Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.

Bakteri yang berbentuk

tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil
tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai
stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung
(Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi
(Dwidjoseputro.1998).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri
dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan
listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat
dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta
mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan
mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga
kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan
struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang
digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri
menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl
neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam
(Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih
dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya,
hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari
pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad,
mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan
sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode
ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang
didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan
oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang
tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan
yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garamgaram yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut
berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion
yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang
mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian
yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya,
pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna

basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan
sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan
negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme,
namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk
mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat
berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan
untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat
warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan
(Dwidjoseputro.1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif
dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat
warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling
mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna.
Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian
difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk
dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri
yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu
suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya
(Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan
preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan
preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras
antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa
seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala
digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah
nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk
melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat
(coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada
coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan
(diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan
pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan
diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri.
Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang
bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative.
Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut
ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan
pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.
Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994)
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam.
Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua,
banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan
zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan
dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram
negatif (Lay,1994)
Cirri-ciri gram negative:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku,
sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:
Struktur dindingnya tebal
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk
pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk :
Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa
.

4.2 Pembahasan
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini
dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol ,
fuchsin , dan safranin(lay ,1994).
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana
bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode
perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri
melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak
berwarna(negatif) (Lay.1994).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif
dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak
berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal
violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine
(Lay.1994).
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin, yang
dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya
yaitu pada Bacillus subtitulis(Lay.1994).
Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat
yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri
secara umum(Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana digunakan larutan
zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam latar belakangnya (Lay.1994)
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci
(Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan
safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel
vegetatifnya (Lay.1994)

Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam prosedur
pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki
ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan
sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994)
Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai
histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur
dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).
Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan campuran
nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta
penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme
yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari
menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa
fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol
tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu
pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat
diwarnai dengan metode biasa.
Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam
air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air
minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis
(Dwidjoseputro.1998).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan
sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah
counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin dan
butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa
berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak
membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua
jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan
menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994).
Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri dengan bentuk basil dan
berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada pewarnaan negatif, tidak ditemukan terlalu banyak bakteri,
ditemukan bakteri dengan bentuk coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna biru gelap
dan bakteri berwarna kuning. Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna
merah dan memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 400. Sedangkan, pada perwarnaan
spora yang menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil
pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin, yaitu sel vegetatifnya dengan bentuk coccus
pada perbesaran 400 di mikroskop.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga
sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum
mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air
sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air

5.1 Kesimpulan
Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :
Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu
kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya
Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan differensial,pewarnaan spora dan
perwarnaan kapsul
Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol fuchsin, crystal
violet, nigrosin, malachite green, lugols iodida, dan safranin.
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam
tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan
tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Contoh bakteri gram posittif

contoh bakteri gram negatif