BAB I

PENDAHULUAN

I.I Latar Belakang

Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar
luas dibandingkan mahluk hidup yang lain. Bakteri memiliki ratusan ribu spesies
yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri
ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki ciri-ciri
yang membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah organisme
uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan berukuran renik
(mikroskopis).

Ciri-ciri Bakteri

Bakteri memiliki ciri-ciri yang membedakannnya dengan mahluk hidup lain yaitu :

1. Organisme multiselluler

2. Prokariot (tidak memiliki membran inti sel )

3. Umumnya tidak memiliki klorofil

4. Memiliki ukuran tubuh yang bervariasi antara 0,12 s/d ratusan mikron
umumnya memiliki ukuran rata-rata 1 s/d 5 mikron.

5. Memiliki bentuk tubuh yang beraneka ragam

6. Hidup bebas atau parasit

7. Yang hidup di lingkungan ekstrim seperti pada mata air panas,kawah atau
gambut dinding selnya tidak mengandung peptidoglikan

8. Yang hidupnya kosmopolit diberbagai lingkungan dinding selnya mengandung

peptidoglikan

Struktur Bakteri

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)

Meliputi dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula
penyimpanan.

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)

Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora.
Struktur Dasar Bakteri :

1. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan

polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri gram positif
bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila peptidoglikannya tipis).

2. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun

atas lapisan fosfolipid dan protein.

3. Sitoplasma adalah cairan sel.

4. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas

protein dan RNA.

5. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang

dibutuhkan.

I.II Maksud Praktikum

Maksud praktikum ini adlah utuk mengetahui pembuatan media NA.

I.III Tujuan Praktikum

Untuk mengidentifikasi bakteri yang tumbuh pada media NA.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.I Media Pertumbuhan

Media pertumbuhan mikroorganisme adalh suatu bahan yang terdiri dari campuran
zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.
Kolagen. Kekurangannya adalah lebuh banyak jenis mikroba yang mampu
menguraikannya dibanding untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga
memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
1. Bahan-bahan media pertumbuhan

a. Bahan Dasar

{ Air (H2O) sebagai pelarut

{ Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit
didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45oC

{ Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam
amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannya adalah lebih banyak jenis
mokroba yang mampu menguraikannya disbanding agar.

{ Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai
pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi
mikroorganisme autotrof obligat.

b. Nutrisi atau zat makanan

{ Media harus mengandung unsure-unsur yang diperlukan untuk metabolism sel

yaitu berupa unsure makro seperti C, H, O, N, P . Unsur mikro seperti Fe, MG dan
unsure pelican/trace element.

{ Sumber karbon dan energy yang dapat diperoleh berupa senyawa organic atau
anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber
karbon organic antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organic.

{ Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain.
Sejumlah mikroba dapt menggunakan sumber N anorganik seperti urea.

{ Vitamin-vitamin.

c. Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan

tertentu, misalnya phenol red (indicator asam basa) ditambahkan untuk indicator
perubahan ph akibat produksi mikroba non-target/kontaminan.

d. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media

{ Agar. Agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan
terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaanya adalah sbagai
pemadat(gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk
membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk
melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali
atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada
ph yang asam
{ Pepton . pepton adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot,
liver, darah, susu, casein, lactalbumin,gelatin dan kedelai. Komposisinya
tergantumg pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.

{ Meat extract. Meat extract adalah mengandung basa organic terbuat dari otak,
limpa, plasenta dan daging sapi.

{ Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat
alcohol, selain itu juga mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B
complex)

{ Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam

amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dala
amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol dll. Konsentrasi yang
ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5%.

1. Macam macam media pertumbuhan

Medium berdasarkan sifat fisik

{ Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin
media menjadi padat

{ Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga
menjadi sedikit kenyal, tidak padat , tidak begitu cair. Media semi solid dibuat
dengan tujuan seperti mikroba dapat menyebar Ke seluruh media tetapi tidak
mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh
pada media NFB Nitrogen Free Bomthymol Blue) semi solid akan membentuk cincin
hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat
dengan mudah hancur. Semi solid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi
oksigen meningkatkan metabolism nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh
merata diseluruh media.

{ Media cair yaitu media yag tidak mengandung agar, contohnya adalah NB
(Nutriuen Broth), LB (Lochtose Broth).

2. Medium berdarakan komposisi

{ Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya glucose agar, mac conkey agar.

{ Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara
pasti misalnya PDA (Potato dekstrose agar) yang mengandung agar, Dekstrosa dan
ekstra kentang. Untuk bahan ekstra kentang, kita tidak dapat mengetahui secara
detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
{ Medium non sintesis media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat
diketahui secara pasti dan biasanya langsung di ekstrak dari bahan dasarnya,
misalnya, tomato, juice agar, brain heart infusion agar, pancreatic ekstrac

3. Medium berdasarkan tujuan

{ Media untuk isolasi

Media ini mengadung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba,

misalnya Nutrient Broth blood agar.

{ Media selektif/penghemat

Media yang saling mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga
media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang
pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah luriah bertani media
yang ditambah amphisin untuk merangsang E.coli resisten anti biotik dan
menghambat kontaminan yang peka, ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4%
untuk membunuh Streptococcus agalactiaeyang toleran terhadap garam.

{ Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk

pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum,
kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri
yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana
untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood
Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.

{ Media untuk peremajaan kultur

{ Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur

{ Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

{ Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu

mikroba. Contohnya adalah Kosers Citrate medium, yang digunakan untuk menguji
kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

{ Media untuk karakterisasi bakteri

{ Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba.

Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan
kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.

{ Media diferensial

{ Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar

karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple
Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna,
ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.

II.2 Isolasi Bakteri

Langkah-langkah inkubasi bakteri pada media NA dengan metode Streak Plate

a. Cairkan nutrien agar dalam penangas air.

b. Dinginkan sampai temperatur 50.

c. Tuangkan medium agar tersebut ke dalam cawan petri steril secara aseptik dan
biarkan sampai dingin dan padat.

d. Ambil 1 ose suspensi bahan yang mengandung bakteri atau campuran bakteri
secara aseptik, kemudian dibuat goresan pada permukaan agar.

e. Cawan petri diberi label (etiket) kemudian dibungkus dan dibalik untuk
mencegah terjadinya tetesan air pada permukaan agar dari hasil kondensasi uap
air.

f. Sesudah inkubasi akan terlihat koloni pada bekas goresan. Pada permulaan
goresan akan terjadi pertumbuhan yang lebat setelah diinkubasikan, sehingga akan
sukar diisolasi.Tiap koloni yang terpisah mungkin berasal dari 1 macam sel bakteri.

g. Salah satu koloni dipilih dari masing-masing tipe koloni yang tumbuh.

h. Diambil secara aseptis dengan ose satu koloni yang dikehendaki dan
suspensikan dalam air steril.

i. Diperiksa dengan Pewarnaan Gram.

j. Dipindahkan masing-masing jenis hasil isolasi ke dalam medium nutrien agar

miring.

k. Diinkubasikan pada temperatur yang sesuai selama 24-28 jam.

l. Uji kembali kemurniaanya dengan pengecatan Gram.

m. Jika tiap tabung hanya terdapat satu macam bakteri berarti isolasi tersebut telah
berhasil.

2. Cara Taburan (Pour Plate Method)

a. Bahan yang mengandung bakteri atau campuran seencer mungkin
disuspensikan untuk mendapatkan koloni yang terpisah-pisah sehingga mudah
diisolasi.

b. Medium untuk pertumbuhan bakteri (nutrien agar) dicairkan dalam penangas

air (100C), dinginkan sampai temperatur 50C, kemudian diinokulasikan dengan
satu ose suspensi secara aseptis. Digojog supaya tercampur rata.

c. Dituangkan ke dalam cawan petri steril berlabel secara aseptis.

d. Cawan-cawan petri tersebut dan selanjutnya diinkubasi pada temperatur

kamar.

e. Setelah 24-48 jam inkubasi, amati bentuk koloni bakteri baikyang tumbuh di
permukaan dan di dalam agar, apakah koloni-koloni bakteri terpisah merata atau
masih menyatu dengan bakteri lain membentuk spreader.

f. Diperhatikan koloni yang tumbuh pada media baik yang ada di permukaan,
tengah, dan dasar medium. Lalu dicatat semua koloni berdasarkan warna, bentuk,
ukuran, dan konsistensi koloni.

4. Surface Plate Method

a. Cairkan nutrien agar dalam penangas air.

b. Dinginkan sampai temperatur 50.

c. Tuangkan medium agar tersebut ke dalam cawan petri steril secara aseptik dan
biarkan sampai dingin dan padat.

d. Bahan yang mengandung bakteri atau campuran seencer mungkin

disuspensikan untuk mendapatkan koloni yang terpisah-pisah sehingga mudah
diisolasi.

e. Tuangkan bakteri yang sudah diencerkan kedalam cawan petri berisi medium
agar yang sudah padat secukupnya. Ratakan dengan dry glasky yang sudah
disterilkan dengan alkohol dan lampu bunsen.

f. Cawan petri diberi label (etiket) kemudian dibungkus dan dibalik untuk
mencegah terjadinya tetesan air pada permukaan agar dari hasil kondensasi uap
air.

g. Sesudah inkubasi akan terlihat koloni pada permukaannya.

III.3 Pertumbuhan bakteri padamedia padat

Sebagaimana telah disinggung pada bab sebelumnya, bahwa mikroba seperti

makhluk hidup lainnya memerlukan nutrisi pertumbuhan. Pengetahuan akan nutrisi
pertumbuhan ini akan membantu didalam m mikroengkultivasi dan mengidentifikasi
mikroba.

Mikroba memiliki karakteristik dan cirri yang berbeda-beda di dalam persyratan

pertumbuhannya. Ada mikroba yang bias hidup hanya pada media yang
mengandung sulfur dan ada pula yang tidak mampu hidup dan
seterusnya.karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang
menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan mikroba.

Pewarnaan Gram

Bakteri adalah suatu organism prokariot. Beberapa sifat morfologi bakteri

sangat penting dalam hubungannya dengan pertumbuhannya pada makanan dan
ketahanannya terhadap pengolahan. Bakteri pada umumnya mempunyai ukuran sel
0,5-0,1 mikro meter kali 2,0-3,0 mikro meter. Karena ukurannya sangat
kecil,sehingga untuk melihat sturuktur morfologi dan bentuk bakteri diperlukan
mikroskop agar dapat mengamatinya. Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi
bakteri maka bakteri dapat diperiksa di dalam keadaan hidup atau dalam keadaan
mati.Pemeriksaan morfologi bakteri bertujuan untuk mengenal nama bakteri. Di
samping itu,diperlukan juga pengenalan sifat-sifat fisiologisnya,bahkan sifat
fisiologis merupakan factor penentu dalam mengenal spesies suatu bakteri.

Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas
yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri
yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet,
larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya
berupa zat warna safranin atau air fuchsin

Pewarnaan gram sering disebut juga pewarnaan sederhana disebut sederhana

karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme
tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan
pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri.
Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen
biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.

Perbedaan antara bakteri gram positif dan gram negative.

a. Pada gram negatif

{ peptidoglikan pada dinding sel tebal

{ kandungan lipid rendah (1 - 4 %), peptidoglikan lapis tunggal (>50%), asam

tekoat

{ rentan terhadap antibiotik penisilin

{ pertumbuhan dihambat oleh zat-zat warna dasar (misal ungu kristal)

{ persyaratan nutrini agak rumit

{ pada saat prosedur pewarnaan Gram, meninggalkan warna biru

{ berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop

{ mempertahankan warna metil ungu

{ resisten terhadap gangguan fisik

b. Pada gram positif

{ Peptidoglikan Tipis

{ Kandungan lipid tinggi : peptidoglikan (10% berat kering), tidak ada asam tekoat

tidak rentan terhadap antibiotik penisilin

{ Pertumbuhan tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar.

{ Persyaratan nutrisi relatif sederhana.

{ Kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu dicuci alkohol terwarnai
pewarna tandingan safranin (sel tampak merah muda)

{ Berwarna merah atau merah mudab di bawah mikroskop

{ Tidak mempertahankan zat warna metil ungu.

BAB III

METODE KERJA

o Alat

Ose bulat

Spritus

Petridish

Autoclave

Incubator

Objek glass

Pipet tetes

Mikroskop

o Bahan

Coloni bakteri

o Reagen

NaCl 0,9%

CGV

Lugol

Alcohol 96%

Air fuchsin

o Cara kerja

Hari I

{ Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

{ Dibuat media NA kemudian dituang kedalam plate steril

{ Setwlah dingin dibungkus dengan kertas dan dimasukkan ke dalam pendingin

atau lemari es

Hari 2
o Biakan di tanam dalam media agar

{ Ose difiksasi pada spritus

{ Diambil koloni pada suspense

{ Tanam pada media NA yaitu dengan cara menggores zigzag seperti yang
terdapat pada gambar dibawah ini

{ Media yang telah ditanami koloni kemudian dibungkus kembali

{ Diinkubasi selam 24 jam pada suhu 370C

Hari 3

o Dilakukan pewarnaan gram untuk mengidentifikasi bakteri yang tumbuh pada

media NA

{ Sediaan yang telah difiksasi digenangi dengan CGV selama 1-3 menit

{ Dicuci dengan air kran

{ Ditetesi dengan lugol dan didiamkan selama 45 detik

{ Dilunturkan dengan alcohol 96%

{ Kemudian ditetesi dengan Air fuchsin

{ Dikeringkan kemudian diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif

100x (oil imercy)