Laporan Praktikum Hari/Tgl : Senin/18 November 2013

Biokimia Waktu : 11.00-12.40 WIB

PJP : Inda Setyawati, STP, M. Si
Asisten : Lusianawati, S.Si
Sari Yuniarni, S. Si

ISOLASI DNA KROMOSOM

Kelompok 9 :

Ekawisudawati (J3L112185)
Vidya Maela Rasep (J3L112109)
Muhammad Mustofa Kamal (J3L112035)

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Pendahuluan
Asam nukleat adalah senyawa polimer yang menyimpan semua informasi
genetik dan merupakan suatu makromolekul yang tersusun dari beberapa polimer
nukleotida. Asam nukleat yang berperan sebagai materi genetik adalah DNA dan
RNA. Sedangkan fungsi lain dari asam nukleat adalah sebagai koenzim, contoh
koenzim yaitu ATP (Adenosine Triphosphate). DNA (Deoxiribose Nucleic Acid)
adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik yang berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis untuk seluruh kehidupan secara seluler. DNA
yang terdapat pada nukleus berbentuk linier dan dengan protein histon akan
berasosiasi sangat erat/kuat. DNA yang terdapat pada mitokondria dan kloroplas
bentuknya sirkular dan dengan protein histon tidak akan berasosiasi. RNA (Ribo
Nucleic Acid) adalah asam nukleat yang bobot molekulnya lebih kecil dari DNA
yang berada dalam ribosom, sitoplasma, dan inti sel. Perbedaan DNA dan RNA
adalah gula penyusun DNA adalah Deoksiribosa sedangkan RNA gula
penyusunnya adalah ribosa. DNA memiliki timin sedangkan RNA memiliki
urasil. DNA tersusun atas rantai panjang dan ganda sedangkan RNA rantainya
pendek dan tunggal, perhatikan Gambar 1 (Soewoto et all 2001).

Gambar 1 Struktur DNA dan RNA (Soewoto et all 2001)

Suatu isolasi DNA dapat dilakukan dengan bantuan sentrifuse untuk
mempermudah pemisahannya dan dapat diketahui konsentrasinya dengan
membaca absorbansinya menggunakan spektrofotomer UV-VIS. Prinsip dari
sentrifuse adalah dengan prinsip sedimentasi yang akan memisahkan dua jenis zat
yang memiliki perbedaan bobot jenis yang berbeda yang dipengaruhi oleh gaya
sentrifugal dengan rotasi berputar, semakin tinggi rotasi berputar maka gaya
sentrifugal akan semakin besar. Zat yang memiliki bobot jenis lebih besar akan
lebih mudah mengendap. Sedangkan prinsip dari spektrofotometer UV-VIS
didasarkan pada pengukuran energi cahaya tampak atau UV oleh suatu senyawa
sebagai fungsi dari panjang gelombang. cahaya monokromatik melalui suatu
media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut akan diserap, sebagian
dipantulkan dan sebagian lagi dipancarkan. Sinar dari sumber radiasi diteruskan
menuju monokromator. Detektor akan menerima cahaya dari sampel secara
bergantian dan berulang-ulang. Sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke
digital dan dilihat hasilnya pada ready out, sehingga serapannya dapat terbaca
(Day dan Underwood 2002).

Tujuan
Praktikum bertujuan mengetahui sifat dan struktur DNA kromosom
melalui proses isolasinya.

Metode
Alat-alat yang digunakan neraca analitik, kaca arloji, pisau, sudip, tabung
sentrifuse, tabung reaksi, kuvet, spektrofotometer UV-VIS, sentrifuse, gelas piala,
pipet mohr, bulb, dan mikro pipet.
Bahan-bahan yang digunakan larutan Tris HCl, SDS, EDTA, aquades,
bawang merah, etanol dingin, air de ionisasi steril.
Isoalsi DNA kromosom dilakukan dengan cara ditimbang 25 gram
bawang merah kemudian dihaluskan menggunakan mortar dan ditambah larutan
lisis 40 ml; 1,5 gram garam yang telah dihaluskan. Setelah itu, dituang ke gelas
piala ditambah 5 ml SDS 10%, larutan kemudian diinkubasi 60°C dalam
waterbath 20 menit dan diaduk. Larutan disentrifuse 3000 rpm, setelah itu
ditambah 1 gr NaCl diaduk dan dibiarkan 15 menit. Diambil lapisan atas dengan
menggunakan pipet mikro dan dipindahkan kedalam dua tabung baru.
Ditambahkan 10 ml EtOH dingin dan ditempatkan tabung secara perlahan diatas
es selama2-5 menit. DNA kromosom akan akan mengendap pada bagian atas dari
EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih. Benang-benang kromosom
diambil dengan pipet dan dimasukkan ke tabung eppendorf lalu di sentrifuse lagi
13000o rpm. EtOH dibuang pada lapisan atas tanpa merusak pelet dan
ditambahkan lagi EtOH 1 ml kemudian disentrifuse lagio selama 1 menit. DNA
kromosom dibiarkan kering dan EtOH dibuang. Setelah kering, ditambahkan 1 ml
TE buffer/dH2O steril untuk melarutkan DNA kromosom. Diukur absorbansi
larutan DNA dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm dan
panjang gelombang 280 nm.

Hasil Pengamatan
Tabel 1 Hasil Pengukuran Konsentrasi DNA dari Umbi Bawang Merah
A terkoreksi [DNA] Rasio
Larutan A260 A280
A260 A280 µg/ml A260/A280
Blanko 0,2730 0,2010
0,6478 0,5678 32,39 1,1408
Sampel 1 0,9208 0,7688
Aterkoreksi 260 =[ Asampel-Ablanko]260
= [0,9208-0,2730]
= 0,6478
Aterkoreksi 280 =[ Asampel-Ablanko]280
= [0,7688-0,0,2010]
= 0,5678
[DNA] = A260 x 50 µg/ml
= 0,6478 x 50 µg/ml
= 32,39 µg/ml
𝐴260 0,6478
Rasio 𝐴280 = 0,5678 = 1,1408

Pembahasan
Isolasi DNA kromosom digunakan bawang merah sebagai sampel karena
memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat lebih jelas. Prinsip isolasi DNA
dari bawang merah adalah pemecahan sel atatu jaringan sel/dialisis dari umbi
bawang merah untuk membebaskan isinya kemudian ekstrak yang telah dihasilkan
dihilangkan komponen-komponen pengganggu dengan cara diberi perlakuan
tanpa merusak DNA kromosomnya dimana pemisahan ini didasarkan pada prinsip
sentrifugasi, komponen-komponen yang biasanya menjadi pengganggu adalah
protein dan RNA, dan setelah diperoleh larutan ekstrak dipekatkan. Berdasarkan
percobaaan tahapan-tahapan dalam isolasi DNA kromosom adalah umbi bawang
digerus, tahapan ini merupakan tahapan penghancuran sel kemudian ditambhkan
larutan lisis dan NaCl yang berfungsi untuk melisiskan membrane sel.
Larutan lisis terdiri atas Tris HCl dan EDTA, EDTA ini berfungsi untuk
membentuk senyawa kompleks atau kelat seperti dengan senyawa Mg2+ yang
merupakan kofaktor DNAse. Sedangkan larutan NaCl yang ditambahakan secara
khusus berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga reaksi-reaksi pada tahap
berikutnya dapat berlangsung cepat dan dengan penambahan garam ini juga
berfungsi untuk membantu ujung-ujung fosfat DNA yang bermuatan negatif
saling mendekat sehingga dapat terbentuk endapan dalam larutan dingin. Selain
larutan lisis dan NaCl, penambahan detergen juga berfungsi melisiskan membrane
sel dan larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ini juga berfungsi untuk merusak
lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Tahapan selanjutnya adalah
larutan diinkubasi pada suhu 60°C selama 20 menit yang berfungsi untuk
mengoptimlkan kerja enzim sebab kerja enzim sangat dipengaruhi oleh suhu dan
sesekali larutan dikocok untuk menghomogenkan larutan agar lisis dari sel
sempurna (Chang 2009).
Tahap selanjutnya adalah larutan disentrifuse 3000 rpm untuk memisahkan
zat berdasarkan bobot jenisnya. Kemudian ditambah NaCl diaduk dan dibiarkan
15 menit, seharusnya yang ditambahkan adalah Kristal protease namun dalam
percobaan yang ditambahkan NaCl, dengan adanya penggantian penambahan
pelarut ini dapat berpengaruh terhadap kemurnian hasil akhir DNA yang diperoleh
sebab dengan penambahan Kristal protease berfungsi untuk memotong atau
memutuskan ikatan peptida dari jaringan sel tanaman umbi bawang, sehingga
ketika Kristal protease ini diganti maka tidak akan terjadi pemutusan ikatan
peptida dari jaringan sel tanaman umbi bawang.
Larutan hasil sentrifuse kemudian diambil lapisan atas dan dimasukkan
kedalam dua tabung baru, setelah itu ditambah EtOH yang berfungsi untuk
menghilangkan pengotor-pengotor dari DNA. Selain itu, DNA akan menggumpal
dalam alkohol sebab alkohol akan mengikat strand DNA yang akan terlihat
sebagai suatu benang-benang putih (Sambrook dan Russel 2006). Tahap ini
merupakan tahap presipitasi yang bertujuan untuk mengendapkan protein histon
agar DNA tidak menggulung dan pada tahap ini DNA akan mengalami pertifikasi
(Gregory dan Funnel 2004). Langkah selanjutnya adalah benang-benang putih
yang terlihat diambil secara perlahan dan dimasukkan ketabung effedorf
kemudian disentrifuse.
Hasil yang didapatkan supernatan berwarna putih dan pelet yang berwarna
putih. Supernatant adalah senyawa hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis
yang lebih rendah sehingga posisisnya berada pada lapisan atas dan warnanaya
lebih jernih, dalam percobaan supernatant ini merupakan EtOH. Sedangkan pellet
adalah senyawa yang bobot jenisnya lebih besar dibandingkan supernatant
sehingga posisinya berada pada bagian bawah dan berupa endapan, dalam
percobaan pellet ini merupakan benang-benang kromosom. Tahap selanjutnya
adalah supernatant/EtOH dibuang dan di tambahkan lagi larutan EtOH kemudian
di sentrifuse kembali. Tahap ini merupakan tahap akhir yaitu tahap ekstraksi dari
DNA kromosom, penambahan EtOH dan sentrifugasi secara berulang berfungsi
untuk mengekstrak DNA kromososm agar mendapatkan pellet yang lebih murni
sehingga hasil yang diperoleh akan lebih baik dibandingkan tanpa dilakukan
pengulangan. Tahap akhir adalah supernatant dibuang dan pellet yaitu berupa
DNA ditambahkan buffer TE yang berisi 10 mM Tris-HCl pH 8,0 yang
mengandung EDTA 0,1 mM EDTA pH 8,0. Fungsi penambahan buffer TE adalah
untuk melarutkan DNA kromosom, kemudian diukur serapannya pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.
Pengukuran serapan DNA dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometri UV karena DNA memiliki ikatan rangkap terkonjugasi dengan
panjang gelombang 260 nm karena pada panjang gelombang tersebut untuk
mengetahui kandungan DNA dalam larutan dan DNA menyerap panjang gelobang
maksimum pada 260 nm sedangkan pada panjang gelombang 280 nm untuk
mengukur kandungan protein yang masih terdapat dalam hasil isolasi DNA. Oleh
karena itu, untuk melihat kemurnian dari hasil isolasi DNA kromosom dengan
cara rasio antara serapan DNA pada 260 nm dengan 280 nm. Kualitas DNA
kromosom dapat diukur berdasarkan keutuhan (tidak terfragmentasi) dan
kemurnian (terbebas dari kontaminan). Kualitas DNA yang berhubungan dengan
kemurnian dapat diketahui berdasarkan serapan yang dihasilkan pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm. Apabila rasio serapan 260 nm dengan serapan
280 nm antara 1,8-2,0 menunjukkan bahwa dalam hasil isolasi DNA relatif murni
dan terbebas dari kontaminan.
Berdasarkan percobaan diperoleh serapan A260 terkoreksi adalah 0,6478
sedangkan serapan A280 terkoreksi adalah 0,5678 sehingga diperoleh rasio antara
A260 dengan A280 adalah 1,1408. Berdasarkan hasil percobaan tersebut isolasi
DNA kromosom yang dihasilkan murni karena tidak melebihi rentang nilai yang
diharuskan yaitu 1,8-2,0 dan kadar protein yang terdapat didalam hasil isolasi
DNA kromosom tidak lebih banyak dibandingkan kadar DNA. Berdasarkan
percobaan juga diperoleh konsentrasi DNA yaitu 32,39 µg/ml.

Simpulan
Isolasi DNA kromosom dilakukan tiga tahap yaitu dialisis, ekstrak dan
pemekatan ekstrak hingga pada akhirnya diukur serapannya. Berdasarkan
percobaan konsentrasi DNA yang diperoleh dari tanaman umbi bawang adalah
32,39 µg/ml dan isolasi DNA kromosom yang diperoleh telah murni dengan
perbandingan rasio A260/A280 adalah 1,1408.

Daftar Pustaka
Chang W. 2009. Bioetika Sebuah Pengantar. Yogyakarta: Kanisius
Day, Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Penerjemah Iis
Sopyan. Jakarta. Erlangga. Terjemanahan dari Quantitative Analysis
Sixth Edition.
Gregory, Funnel. 2004. Plasmid Biology. Washington DC. ASM Press
Sambrook, Russel. 2006. The Condensed Protocols From Molecular Cloning: A
laboratory Manual. New York. Cold Spring Harbour Laboratory Press
Soewoto et all. 2001. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta. Widya Medika