Laporan Praktikum Nama : Ekawisudawati

Mikrobiologi NIM : J3L112185

Kelas : B P1
Kelompok : 7 (Tujuh)
Hari/Tgl : Rabu/2-10-2013
Waktu : 14.30-17.50 WIB
PJP : Emil Wahdi, S.Si
Asisten : 1. Ramdhani
2. Yesi Septiani
3. Yeny Anggraini

KUANTITASI MIKROBA, PERHITUNGAN TIDAK

LANGSUNG
(Metode Cawan Gores dan Tuang untuk Menghitung Sel Hidup)

ANALISIS KIMIA
PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2013
Pendahuluan
Dalam keadaan sebenarnya (dialam bebas) tidak ada bakteri yang hidup
tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Untuk menyendirikan suatu spesies
dikenal beberapa cara, yaitu : dengan pengenceran, penuangan, penggesekan, dan
mengucilkan satu sel. Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode
mikrobiologis, antara lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk
mengamati ciri-ciri kultural morfologi, fisiologi dan seriologi dibutuhkan mikroba
yang berasal dari satu spesies (Dwidjoseputro 1978). Selain itu, jumlah
mikroorganisme dapat dihitung melalui beberapa cara, namun secara mendasar
dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu perhitungan langsung dan tidak langsung.
Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme
pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih
dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara tidak langsung
terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan
perhitungan.
Jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi
jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel. Untuk
memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk perhitungan koloni
adalah yang mengadung antara 30-300 koloni. Karena jumlah mikroorganisme
dalam sempel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-
kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi
syarat tersebut harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan
(Hadioetomo 1993).
Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan
untuk mengetahui mutu bahan pangan, dan proses yang akan diterapkan pada
bahan pangan tersebut. Ada beberapa cara untuk mengukur atau menghitung
mikroba yaitu dengan perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara
langsung, dan pendugaan massa sel secara tak langsung. Perhitungan jumlah sel
dapat dilakukan dengan 3 metode yaitu dengan hitungan mikroskopik, MPN
(Most Probable Number), dan hitungan cawan (Fardiaz, 1989). Dari ketiga
metode tersebut metode hitungan cawan paling banyak dan mudah digunakan.

Tujuan
Mempelajari cara pengenceran serial dan menentukan jumlah bakteri
dalam suatu sampel dengan hitungan cawan.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah mikropipet, blue tip, cawan petri kosong
yang steril, rak tabung reaksi, kawat penyebar, Bunsen, korek api, Erlenmeyer,
dan gelas piala. Bahan-bahan yang digunakan adalah suspensi bakteri, tabung-
tabung yang berisi media PCA cair, media PCA dalam cawna petri, alkohol 70%,
media PCA cair, tabung-tabung berisi 9 ml larutan fisiologis (0,85% NaCl).

Prosedur Percobaan
Disiapkan alat dan bahannya yang akan digunakan. Kemudian meja kerja
dan tangan disterilkan terlebih dahulu menggunakan menggunakan alkohol 70%.
Kemudian disipakan 5 tabung yang berisi 9 ml garam fisiologis dan susun
berderet sesuai dengan pengencerannya. Tabung 1 pengenceran 1: 10, tabung 2
pengenceran 1:100, tabung 3 pengenceran 1:1000, tabung 4 pengenceran 1:10000,
tabung 5 pengenceran 1:100000. Sampel dikocok hingga kekeruhannya rata dan
Bunsen dinyalakan. Ambil 1 ml suspensi bakteri menggunakan mikropipet
kemudian dimasukkan ketabung 1. Tabung dikocok sampai homogen, lalu
diambil 1 ml dari tabung 1 kemudian dimasukkan ke tabung 2. Dikocok sampai
homogen lalu diambil 1 ml dari tabung 2 kemudian dimasukkan ke tabung 3.
Dikocok sampai homogen lalu diambil 1 ml dari tabung 3 kemudian dimasukkan
ke tabung 4. Dikocok sampai homogen lalu diambil 1 ml dari tabung 4 kemudian
dimasukkan ke tabung 5. Dikocok sampai homogen, agar pengerjaannya aseptik
lakukan pengenceran mendekati Bunsen agar tetap steril. Setelah pengenceran
dilakukan, disiapkan 3 cawan petri steril dan 3 cawan petri berisi media PCA.
Ditiap cawan diberi kode tabung pengencer yang akan dituang atau disebar.
Cawan sebar dilakukan dengan cara dipipet 0,1 ml sampel dari tabung pengencer
3 lalu dimasukkan ke media PCA dan disebar menggunakan kawat penyebar.
Dilakukan hal yang sama untuk tabung pengenceran 4 dan 5. Sedangkan cawna
tuang dilakukan dengan cara dipipet 0,1 ml sampel dari tabung pengencer 3 lalu
dimasukkan kecawan petri steril setelah itu ditambahkan PCA cair kemudian
dihomogenkan dengan cara diputar mebentuk angka delapan. Dilakukan hal yang
sama untuk tabung pengenceran 4 dan 5. Dibiarkan agar dalam cawan petri itu
menjadi padat lalu diletakkan dalam posisi terbalikuntuk diinkubasi pada suhu
kamar selama 24 jam. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung.

Data dan Hasil Pengamatan

Tabel 1 Hasil pengamatan cawan sebar dan cawan tuang
Jumlah koloni Jumlah
No Metode bakteri
10-3 10-4 10-5
(CFU/ml)
1 Cawan sebar 30 TSUD(1) TSUD(4) 3x107
2 Cawan tuang TSUD TSUD (7) TSUD (13) -
Ket : TSUD = Terlalu Sedikit Untuk Dihitung

(a) (b) (c)

Gambar 1 Hasil Inkubasi Bakteri Metode Tuang (a) pengenceran 1:1000, (b)
pengenceran 1:10000, (c) pengenceran 1:100000
 (a) (b) (c)
Gambar 2 Hasil Inkubasi Bakteri Metode Sebar (a) pengenceran 1:1000, (b)
pengenceran 1:10000, (c) pengenceran 1:100000

Pembahasan
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba
yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut akan
berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata
tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua
cara yaitu:  metode tuang (pour plate) dan metode permukaan/sebar
(surface/spread plate) (Fardiaz, 1993). Namun, dengan metode ini sampel harus
di persiapkan terlebih dahulu, seperti pengenceran dan penuangan. Pengenceran
dapat dilakukan dari suatu suspensi yang bermacam-macam spesies diencerkan
dalam satu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian di ambil 1mL untuk
diencerkan lagi. Kalau perlu, dari enceran yang kedua diambil 1 mL untuk
diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL
untuk disebarkan pada medium padat untuk memperoleh biakan murni.
Penuangan yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah
diencerkan. Kemudian sampel disebarkan dalam suatu medium dari kaldu dan
gelatin encer. Dengan demikian diperoleh biakan adukan. Setelah medium
mengental, beberapa jam akan muncul koloni-koloni yang masing-masing dapat
dianggap murni (Dwidjoseputro 1978). Perhitungan jumlah koloni akan lebih
mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara decimal. Semakin tinggi
jumlah mikroba yang terdapat di dalam sampel, semakin tinggi pengenceran yang
harus dilakukan (Fardiaz, 1992). Namun dalam percobaan pengenceran dilakukan
hingga 5 kali.
Berdasarkan percobaan semua jumlah bakteri memiliki koloni bakteri
yang tumbuh sedikit. Sehingga jumlah bakteri (CFU/ml) tidak dapat dihitung.
Namun, pada cawan sebar pengenceran 1:1000 dapat dihitung. Sebenarnya hasil
yang didapatkan yaitu jumlah koloni tumbuh, tidak valid atau tidak dapat
digunakan lagi sebab inkubasi bakteri dilakukan lebih dari 24 jam. Setelah
melebihi 24 jam maka fase pertumbuhan bakteri telah melewati fase stationernya
dan berada pada fase kematian. Fase pertumbuhan bakteri yaitu fase lag
merupakan fase penyesuaian bakteri dengan lingkungan baru. Setelah sel
menyesuaikan diri dengan lingkungannya maka sel mulai mencegah hingga
mencapai populasi yang maksimum. Fase berikutnya adalah fase log yaitu periode
pembiakan yang cepat dan merupakan periode berciri khas sel-sel yang aktif.
Setelah fase log, fase stationer yaitu fase yang ditandai laju pembiakan berkurang
dan beberapa sel mati, sehingga jumlah keseluruhan bakteri akan tetap. Fase
terakhir dalam pertumbuhan bakteri adalah fase kematian. Fase kematian adalah
fase yang terjadi apabila laju kematian melampaui laju pembiakan dan biasanya
pembiakan berhenti. Ketika inkubasi yang dilakukan lebih dari 24 jam maka
nutrisi yang disediakan oleh media mulai menyusut menyebabkan bakteri banyak
yang mati sehingga yang dapat terhitung hanya sedikit. Namun, tidak semua
bakteri masa inkubasinya 24 jam (dalam percobaan sebaiknya 24 jam), ada juga
yang inkubasinya lebih dari 24 jam. Hasil metode hitungan cawan menggunakan
standar yaitu Standard Plate Counts (SPC). Standar itu menyebutkan bahwa
cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara
30-300, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan
koloni yang besar yang jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu
koloni dan satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai satu rantai tebal
dihitung sebagai rantai koloni (Waluyo 2007).
Media pertumbuhan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Plate
Count Agar. PCA bukan media yang selektif, melainkan media yang dapat
menumbuhkan bakteri apapun yang penting nutriennya sesuai. Berdasarkan
percobaan pada pengenceran 10-3 di metode cawan sebar jumlah koloni yang
terhitung adalah 30. Sehingga, diperoleh jumlah bakterinya 3x107. Hanya satu
yang dapat dihitung jumlah bakterinya sebab hasil pengenceran yang lain datanya
TSUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung). Menurut Fardiaz (1992), jika pada
semua pengenceran dihasilkan koloni bakteri < 30  koloni pada cawan petri, maka
pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. sedangkan jika pada semua
pengenceran dihasilkan koloni bakteri > 300  koloni pada cawan petri, maka
pengenceran yang dilakukan terlalu rendah. Berdasarkan percobaan, semakin
tinggi pengenceran maka jumlah koloni bakteri semakin sedikit. Pada cawan sebar
pengenceran 10-3 adalah 30 koloni sedangkan pada pengenceran 10 -4 adalah 1
koloni. Namun, pada pengenceran 10-5 adalah 4 koloni.
Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk
menentukan jumlah mikroba. Kelebihan metode ini ialah hanya sel yang masih
hidup saja yang dapat dihitung, beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus,
dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroba yang mempunyai penampakan
pertumbuhan secara spesifik.
Selain memiliki kelebihan metode ini juga memiliki kekurangan diantaranya
sel yang berdekatan kemungkinan membentuk koloni sehingga hasil perhitungan
tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, nilai yang beda akan dihasilkan
apabilai nilai dan kondisi inkubasi berbeda, mikroba yang ditumbuhkan harus
dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak,
diperlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lama untuk menumbuhkan
koloni (Dwidjoseputro 1978).

Simpulan
Berdasarkan percobaan jumlah bakteri yang diperoleh dari pengenceran
1:1000, pengenceran 1:10000, dan pengenceran 1:100000 metode tuang adalah
TSUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung) sehingga tidak dapat dihitung jumlah
bakterinya sebab tidak memenuhi data statistik. Sedangkan pada cawan sebar
dipengenceran 1:1000 jumlah koloni yang tumbuh adalah 30 sehingga jumlah
bakterinya 3x107 CFU/ml, dan pengenceran 1:10000, dan pengenceran 1:100000
metode sebar adalah TSUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung).
Daftar Pustaka
Dwidjoseputro. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang. Djambatan
Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta: Gramedia Pusaka Utama.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Teknik dan Prosedur
Dasar dalam Praktikum. Jakarta: Gramedia Pusaka Utama
Waluyo L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press

Lampiran
Contoh perhitungan :
Diketahui : Jumlah koloni = 30 koloni
Faktor pengenceran = 10-3
Volume sampel = 0,1 ml
Ditanya : Jumlah bakteri ?
Jawab :
Jumlah bakteri = 1 1
∑ Koloni X X
F. Pengencer Vol. Inokulan

= 1 1
30 X X
10-3 0,1 ml 7
= 3x10 CFU/ml