Poin Pembahasan P5

1. Judul dan Tujuan praktikum

2. Bahas pengertian kromatografi, HPLC, apa itu fase gerak fase diamFase diam merupakan
salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi. kenapa? karena
dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya
komponen senyawa analit.

Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan
yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
Fase gerak (Mobile phase)
Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit
tersebut. Nah fase gerak ini g melulu hanya cairan. Tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya
dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil)

3. Jelaskan instrument HPLC

4. Gambar instrument (rangkaian alat) HPLC

5. Jelaskan tentang teknik elusi HPLC serta fase normal dan fase terbalik Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk
fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.

6. Ulas kembai secara lengkap apa yang disampaikan pada saat penjelasan tentang HPLC pada saat di
dalam laboratorium instrument.

7. Bahas hasil kromatogram, jelaskan

Analsis kuantitatif HPLC didasarkan pada pengukuran luas atau area puncak dalam kromatogram. Pada
percobaan penentuan kadar vitamin c, kafein, dan natrium benzoat dalam sampel dengan menggunakan metode
HPLC, digunakan satu deret standar yang konsentrasinya bervariasi, yaitu 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm,
dan 50 ppm. HPLC adalah suatu metode pemisahan dari analit berdasarkan perbedaan interaksi pada fasa diam
dan fasa diamnya. Sehingga akan didapatkan waktu retensi yang berbeda-beda antara komponen yang satu
dengan komponen yang lainnya.
Metode yang digunakan pada pengujian ini adalah metode fasa terbalik dimana fasa gerak yang
digunakan ini bersifat relatif lebih polar daripada fasa diamnya. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran
kalium dihidrogen fosfat dan asetonitril dengan perbandingan 60 : 40. Sedangkan fasa diamnya berupa silika
yang direaksikan dengan organoklorosilana.

1
 Struktur Fasa diam

Berdasarka urutan kepolaran antara vitamin c, kafein, dan natrium benzoat. Bahwa vitamin c lebih
besar dari kafein lebih besar dari natrium benzoat. Maka waktu retensi vitamin c lebih kecil dari kafein lebih
kecil dari natrium benzoat. Sehingga larutan standar yang digunakan mempunyai harga regresi lebih mendekati
satu.
Dalam preparasi larutan standar dan sampel digunakan membran PTFE (Poly Tetra Fluoro Ethylene)
untuk proses pemurnian larutan standar maupun sampel yang dipisahkan dari pengotornya.
Sebelum pengujian sampel, terlebih dahulu dibuat kurva kalibrasi dari deret larutan standar dengan
konsentrasi yang telah ditentukan. Kurva diplotkan antara konsentrasi setiap larutan standar terhadap luas area
peak yang diperkirakan sebagai peak dari vitamin C, pada masing-masing kromatogramnya.
Penentuan peak vitamin C pada kromatogram larutan standar ini dilakukan dengan mengamati peak
yang waktu retensinya relatif tetap atau sama pada setiap konsentrasi larutan standar, serta memerhatikan luas
area peaknya. Karena larutan standar adalah larutan vitamin C maka kadar vitamin C di dalamnya adalah yang
terbesar dibanding komponen lain sebagai hasil penguraian vitamin C atau senyawa lainnya (pengotor).
Adanya penguraian ini ditunjukkan salah satunya dari adanya lebih dari satu peak pada kromatogram.
Dari data kromatogram deret larutan standar, diperoleh waktu retensi untuk vitamin c 1.98; waktu
retensi kafein 2.54; dan waktu retensi natrium benzoat 4.38.
Waktu retensi pada larutan standar menjadi acuan dalam menentukan komponen-komponen yang
terdapat dalam sampel. Pada kromatogram sampel terdapat empat puncak, yaitu :
 Komponen kesatu dengan waktu retensi sebesar 1.79; dan luas area sebesar 220807
 Komponen kedua dengan waktu retensi sebesar 1.99; dan luas area sebesar 1779127
 Komponen ketiga dengan waktu retensi sebesar 4.40; dan luas area sebesar 15581524
 Komponen keempat dengan waktu retensi sebesar 4.81; dan luas area sebesar 478118

Komponen kesatu dalam sampel diduga bukan vitamin c, karena waktu retensi untuk vitamin c
dimulai dari 1.98, sebagaimana hasil dari kromatogram yang tertera. Sedangkan pada komponen kedua,
diidentifikasikan sebagai komponen vitamin c, karena waktu retensinya mendekati waktu retensi vitamin c.
Dan pada komponen ketiga waktu retensinya mendekati waktu retensi natrium benzoat yang dimulai dari 4.38.
sehingga diidentifikasikan bahwa komponen ketiga sebagai komponen natrium benzoat. Komponen keempat
pada sampel diduga bukan natrium benzoat, karena selisih waktu retensinya sangat jauh dengan waktu retensi
natrium benzoat.
Berdasarkan hasil pengolahan data, kadar natrium benzoat dalam sampel adalah 115,757 mg,
sedangkan kadar vitamin c adalah 3,53664 mg.

2
 KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum kali ini dilakukan penentuan kadar zat aditif dalam sampel dengan
menggunakan HPLC, pada larutan sampel yang digunakan yaitu Mizone terdapat dua kadar zat aditif, yaitu
kadar komponen vitamin c dan kadar komponen natrium benzoat.
Kadar vitamin c yang terkandung dalam sampel yaitu sebesar 3,53664 mg dan kadar natrium benzoat
yang terkandung dalam sampel sebesar 115,757 mg.
CONTOH HASIL
Penetapan kadar dengan kromatografi cair kinerja tinggi terlebih dahulu dilakukan dengan memilih
kondisi optimum. Kondisi optimum diambil setelah dilakukan serangkaian kesesuaian sistem. Fasa gerak
yang dipilih adalah kombinasi asetonitril dan dapar fosfat pH 4,5 dengan perbandingan 75:25.
Perbandingan ini diambil karena memberikan pemisahan yang baik antara parasetamol dan ibuprofen.

waktu retensi parasetamol 4,89 menit dan ibuprofen 7,11 menit yang menunjukkan waktu retensi yang
cukup untuk penetapan kadar suatu senyawa yang umumnya di antara 10-20 menit.[4] Selain itu dengan
kecepatan alir yang kecil, dapat menghemat penggunaan fasa gerak. Penambahan natrium heksan
sulfonat dimaksudkan untuk meningkatkan retensi dan memperoleh bentuk kromatogram yang lebih
baik.