KLTP FRAKSI AKTIF

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF FRAKSI AKTIF
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett
(1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari
bahasa Yunani (chromato = penulisan dan grafe = warna). Kromatografi
berarti penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan
campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen
campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan
fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat atau zat cair,
sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Teknologi
yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada campuran
bahan adalah prinsip dasar kromatografi.
Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada
sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan.Kromatografi digunakan
sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-
komponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang terdapat pada tahu,
tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak manfaat.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui
kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan
analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap
maupun cuplikannya.
SRI ARISTA RAHMAWATI RIVAI

150 2012 0368
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa
yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang
sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna
untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang
diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara
kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Beberapa kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi
kesehatan manusia, diantaranya adalah sebagai antioksidan,
antitumor /antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan dapat
mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan
metode kromatografi.
Pada percobaan kali ini ditentukan fraksi aktif flavonoid hasil
KKK dan KCV ekstrak daun Lobi-lobi (Flacourtia inermis Roxb.) dengan
menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparative (KLTP).
B. Maksud dan Tujuan Praktikum
1. Maksud Praktikum
Adapun maksud dari praktikum ini adalah untuk menentukan
fraksi aktif flavonoid hasil KKK dan KCV ekstrak daun Lobi-lobi
(Flacourtia inermis Roxb) dengan menggunakan metode kromatografi
lapis tipis preparatif (KLTP).
2. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk menentukan fraksi
aktif flavonoid hasil KKK dan KCV ekstrak daun Lobi-lobi (Flacourtia

150 2012 0368
inermis Roxb.) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis
preparative (KLTP).
C. Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari percobaan ini adalah kita dapat mengetahui
bagaimana cara memisahkan atau mengisolasi dan mengidentifikasi
senyawa-senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi daun Lobi-lobi lobi
(Flacourtia inermis Roxb.) menggunakan Kromatografi Lapis Tipis
Preparatif.

150 2012 0368
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Metode Isolasi
Pada dasarnya isolasi senyawa kimia dari bahan alam adalah
sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang berca
mpur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang
murni. Tumbuhan mengandung ribuan senyawa yang dikategorikan
sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder. Biasanya proses
isolasi senyawa dari bahan alami ini mentargetkan untuk mengisolasi
senyawa metabolit sekunder, karena senyawa metabolit sekunder
diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi kehidupan
manusia. Antara lain manfaatnya dalam bidang pertanian, kesehatan
dan pangan. Metode standar laboratorium dengan kuantitas sampel
terbatas dan perlunya menentukan metode yang paling sesuai
(Darwis, 2000).
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran
menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-
masing komponennya. Berdasarkan hal di atas maka metode umum
dalam isolasi senyawa metabolit sekunder dapat digunakan. (Darwis,
2000).
Dari identifikasi awal, maka dapat diamati kandungan senyawa
dari tumbuhan sehingga untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu
senyawa yang lebih dominan dan salah satu usaha mengefektifkan

150 2012 0368
isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut
organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut
polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya
senyawa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar
(Harborne, 1987).
a. Simplisia
Simplisia ialah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai
obat, yang belum mengalami pengolahan apapun juga dan
kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan.
Simplisia nabati ialah simplisia yang berupa tanaman utuh, bagian
tanaman atau eksudat tanaman. Eksudat tanaman ialah isi sel
yang secara spontan keluar dari tanaman atau isi sel yang
dengan cara tertentu dikeluarkan dari selnya, atau zat-zat nabati
lainnya yang dengan cara tertentu dipisahkan dari tanamannya
dan belum berupa zat murni (Departemen Kesehatan RI, 1986).
b. Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif
simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Prinsip ekstraksi
adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan
senyawa non polar dalam pelarut non polar (Departemen
Kesehatan RI, 1986).

150 2012 0368
c. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi
dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan
penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk
ke rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan
karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di
dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat
didesak ke luar (Departemen Kesehatan RI, 1986).
d. Fraksinasi
Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan komponen-komponen
berdasarkan perbedaan kepolaran tergantung dari jenis senyawa
yang terkandung dalam tumbuhan. Dalam metode fraksinasi
pengetahuan mengenai sifat senyawa yang terdapat dalam
ekstrak akan sangat mempengaruhi proses fraksinasi
(Departemen Kesehatan RI, 1986).
e. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia atau
merupakan salah satu metode identifikasi awal untuk menentukan
kemurnian senyawa yang ditemukan atau dapat menentukan
jumlah senyawa dari ekstrak kasar metabolit sekunder.
Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan
adsorben bertindak sebagai fase stasioner (Ibrahim, 2000).

150 2012 0368
f. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom digunakan untuk pemisahan campuran
beberapa senyawa yang diperoleh dari isolasi tumbuhan. Dengan
menggunakan fase padat dan fase cair (pelarut organik), maka
fraksi-fraksi senyawa akan menghasilkan kemurnian yang cukup
tinggi (Ibrahim, 2000).
B. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah
dan murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikiann juga
peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan
yang digunakan lebih sederhana dan hampir semua laboratorium
melaksanakan metode ini. Kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya
berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastic
(Gholib, 2007).
Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi
dengan adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina)
maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fasa
diam.Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan
eluen. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor
retensi) yang diperoleh (Gholib, 2007).

150 2012 0368
Pemisahan menggunakan KLT, dalam pelaksanaannya
pertama-tama perlu membuat platkromatografi, yaitu untuk
membentangkan penyerap dalam lapisan tipis yang berkelakuan
sebagai penyokong yang inert. Pembuatan lapisan tipis diatas kaca
dilakukan dengan jalan penyemprotan atau pencelupan. Plat yang
telah dilapisi diaktifkan dengan cara memanaskan pada suhu kira-kira
1000C selama beberapa waktu (Sastrohamidjojo, 2007).
Pada dasarnya kromatografi lapis tipis melibatkan dua sifat
yaitu sifat fase diam dan sifat fase bergerak atau campuran pelarut
pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi
sebagai permukaan penyerap pada kromatografi lapis tipis, yaitu silika
gel, alumina, kieselgur, dan selulosa. Fase gerak dapat berupa hampir
segala macam pelarut atau campruran pelarut (Sudjadi, 1988).
Pada fase diam salah satu cairan biasanya diserap oleh zat
penjerap padat, karena itu memberikan daerah permukaan yang
sangat luas kepada pelarut yang mengalir pada fase gerak, dan
menghasilkan pemisahan yang baik, yang tidak dapat dicapai dengan
cara penyarian cairan-cairan yang biasa (Ditjen POM, 1979).
Fase diam pada KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 μm.Semakin kecil ukuran rata-
rata partikel fase diam, semakin baik kinerja KLT dalam hal efisien dan
resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silica dan

150 2012 0368
serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama adalah
pada KLT yaitu adsorpsi dan partisi. Untuk tujuan t
ertentu, pejerap atau fase diam dapat dimodifikasi dengan cara
pembaceman. Fase gerak dari pustaka dapat ditentukan dengan uji
pustaka atau dengan dicoba-coba karena pengerjaan KLT ini cukup
cepat dan mudah.Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2
pelarut organik karena daya elusi campuran ini dapat diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi dengan optimal
(Gholi
b, 2007).
Dalam pembuatan dan pemilihan fase gerak yang harus
diperhatikan yaitu kemurnian dari eluen itu sendiri karena KLT
merupakan teknik yang sensitif; daya elusi dari pelarut itu juga harus
diatur sedemikian rupa agar harga Rf berkisar antara 0,2-0,8 yang
menandakan pemisahan yang baik; polaritas dari pelarut juga harus
diperhatikan agar pemisahan terjadi dengan sempurna. Ada 2 cara
yang digunakan untuk menganalisis secara kuantitatif dengan KLT.
Pertama, bercak yang terbentuk diukur langsung pada lempeng
dengan menggunakan ukur luas atau dengan teknik densitometri.
Cara kedua yaitu dengan mengorek bercak lalu menetapkan kadar
senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan menimbang
hasil korekan (Gholib, 2007).

150 2012 0368
Larutan sampel dalam pelarut yang mudah menguap diletakkan
diatas lapisan dengan menggunakan pipet mikro atau syringe. Bila
sampel telah kering, plat diletakkan secara vertical dalam bejana yang
sesuai dengan tepi yang dibawah dicelupkan dalam fasa gerak. Fasa
gerak dalam kromatografi merupakan campuran zat pelarut (solvent
system) yang menggerakkan sampel dengan kecepatan berbeda
akibat pengaruh masing-masing komponen senyawa ataupun
pemilihan adsorben sebagai fasa diam (Adnan, 1997).
1. Tujuan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis digunakan untuk pemisahan
senyawa secara cepat, dengan menggunakan zat penjerap berupa
serbuk halus yang dilapiskan serba rata pada lempeng kaca.
Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom
kromatografi terbuka” dan pemisahan dapat didasarkan pada
penjerapan, pembagian, atau gabungannya, tergantung dari jenis
zat penjerap dan cara pembuatan lapisan zat penjerap dan jenis
pelarut (Ditjen POM, 1979).
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan
banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa,
memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektivitas
pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi
kolom, serta memantau kromatografi kolom, melakukan screening
sampel untuk obat. Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan

150 2012 0368
untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang
digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Analisis kuantitatif
dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak langsung pada
lengpeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik
densitometry dan cara berikutnya dalaha dengan mengerok bercak
lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak
dengan metode analisis yang lain, misalnya dengan metode
spektrofotometri. Dan untuk analisis preparatif, sampel yang
ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu
dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang non- dekstruktif.
Bercak yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerok
dan dilakukan analisis lanjutan (Gholib, 2007).
2. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pengamatan senyawa yang telah dipisahkan dilakukan
menggunakan metode fisika dan kimia. metode-metode fisika yang
sering digunakan meliputi flurosensi sinar ultra ungu dan
pencacahan radioaktif. Jika metode kimia digunakan dalam
pengamatan, maka dapat dilakukan dengan penyemprotan atau
pencelupan dalam asam sulfat pekat, serium sulfat dan yod yang
selanjutnya dipanaskan pada suhu sekitar 200 0C hingga komponen
senyawa terpisah menjadi hitam (Sastrohamidjojo, 2007).
Identifikasi komponen senyawa terpisah atau noda dinyatakan
dengan harga Rf (Retardation factor) sebagai rasio antara jarak

150 2012 0368
noda terhadap titik awal dengan jarak system pelarut terhadap titik
awal (Haqiqi, 2008).
Harga Rf dipengaruhi oleh struktur kimia, fasa diam, fasa gerak,
derajad kejenuhan, jumlah sampel, suhu, dan kesetimbangan.
Harga-harga Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan
harga-harga standar. Senyawa standar biasanya memiliki sifat
kimia yang mirip dengan senyawa yang dipisahkan pada
kromatogram (Sastrohamidjojo, 2007).
Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen
dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen. Rumus faktor
retensi adalah (Wood, 1985) :
jarak tempuh komponen

Rf =
jarak tempuh eluen
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen
tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi
adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang
mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang
rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam
bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada
fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT
yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang
harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan
sebaliknya (Wood, 1985).

150 2012 0368
Nilai Rf didefinisikan sebagi perbandingan jarak yang ditempuh
oleh senyawa pada permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang
ditempuh oleh pelarut sebagai fase gerak. Semakin besar nilai Rf
dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan
dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang
sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan
berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis
tipis (Stahl, 1985).
Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasi senyawa.

Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama dengan nilai Rf
standar dari senyawa tersebut maka senyawa tersebut dapat
dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip.
Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat
dikatakan merupakan senyawa yang berbeda. Namun perbedaan
perlakuan dalam percobaan kromatografi lapis tipis juga akan
mempengaruhi nilai Rf sampel yang diidentifikasi (Gholib, 2007).
3. Penampak Bercak Noda
a. Lampu UV
Senyawa dan warna diukur pada jangka 200 nm sampai 400
nm, senyawa berwarna diukur pada jangka 400 nm sampai 700
nm. Panjang gelombang serapan maksimum dan minimum
pada spektrum serapan yang diperoleh direkam dalam nm.
Demikian juga kekuatan absorbansi (keterserapan). Bahan yang
dignakan hanya dalam jumlah sedikit diisi dengan 3 ml larutan.

150 2012 0368
Dengan manggunakan sel khusus hanya diperlukan
sepersepuluh volume tersebut (Stahl, 1985).
Pengukuran spektrum yang demikian itu penting pada
identifikasi kandungan tumbuhan termasuk untuk mendeteksi
golongan senyawa tersebut. Pelarut yang banyak digunakan
untuk spektroskopi UV adalah etanol 95 %, metanol, air, heksan
dan eter. Alkohol mutlak niaga harus dihindari karena
mengandung benzen yang menyerap di daerah UV pendek.
Pelarut seperti kloroform harus dihindari karena menyerap kuat
di daerah 200 – 600 nm, tetapi sangat cocok untuk mengukur
spektrum tumbuhan karotenida didaerah spektrum tampak
(Stahl, 1985).
Pada UV 366 nm, lempeng GF 366 hanya mengabsorbsi
cahaya, namun tidak berfluoresensi Molekul noda akan
mengabsorbsi cahaya ultraviolet lalu tereksitasi dan kemudian
memancarkan cahaya ultraviolet atau cahaya tampak pada
waktu kembali ke tingkat dasar (emisi) atau mengalami
fluoresensi, sehingga noda akan tampak (Sastrohamidjojo,
1985).
b. Pereaksi KLT
Mekanisme penampakan noda pada H 2SO4 yaitu gugus
yang terdapat pada noda dirusak oleh H 2SO4 sehingga terjadi
pergeseran panjang gelombang dari panjang gelombang UV

150 2012 0368
bergeser ke panjang gelombang sinar tampak, sehingga dapat
dilihat dengan mata langsung.(Sastrohamidjojo, 1985).
4. Keuntungan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah
(Gholib, 2007) :
1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan
pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan
sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen
yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
Adapun kerugiannya adalah tidak efektif dalam skala besar.
Pemakaian dalam skala besar akan menghabiskan plat KLT yang
lebih banyak sehingga biaya analisispun akan semakin meningkat
(Tambunan, 2011).
C. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Kromatografi dalam bidang kimia merupakan sebuah tehnik analisis
yang digunakan untuk memisahkan sebuah campuran ataupun
persenyawaan kimia. Tehnik ini ditemukan pada tahum 1906 oleh Mikhail
Tswett seorang ahli botani dari Italia yang lahir di Rusia. Tehnik pemisahan
ini dilakukan terhadap pigmen tumbuhan (klorofil), dengan cara

150 2012 0368
menuangkan ekstrak petroleum eter dari daun tumbuhan diatas sebuah
kolom kaca yang berisi serbuk kalsium karbonat dalam arah yang tegak
lurus (Najib, 2013).
KLT Preparatif dapat digunkaan untuk memisahkan bahan dalam
jumlah gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah
milligram (Kristanti, 2008).
Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan
fase diam dan fase gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah plat
dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg,
dapat dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben
silika gel atau aluminium oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1
mm, jika tebalnya di dua kalikan, maka banyaknya sampel yang dapat
dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT biasa, adsorben yang
paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika gel (Kristanti,
2008).
Metode kerjanya meliputi penotolan ekstrak bahan alam dalam
bentuk pita pada lempeng. Hal ini memungkinkan sampel dalam jumlah
besar dapat muat pada lempeng KLT, lempeng dikembangkan dalam
pelarut yang telah diketahui mampu memisahkan komponen, yang paling
penting adalah harus digunakan metode deteksi yang tidak merusak
sampel (Najib, 2013).
Pada KLT preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan
berupa garis pada salah satu sisi plat lapisan besar dan dikembangkan

150 2012 0368
secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah
menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak
jika senyawa itu tahan warna, dan penjerap yang mengandung pita
dikerok dari plat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penjerap dengan
pelarut polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi
sehingga diperoleh senyawa murni untuk telah pendahuluan, untuk
menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya
berjumlah kecil dan campurannya rumit, dan untuk memperoleh cuplikan
yang murni untuk mengkalibrasi KLT kuantitatif (Gritter, 1991).
Keuntungan KLTP adalah salah satu metode pemisahan yang
memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling
dasar. Kerugian KLTP adalah pengambilan senyawa dari plat yang
dilanjutkan dengan pengekstraksian penjerap memerlukan waktu lama
dan jika senyawa beracun harus dikerok dari plat akan menimbulkan
banyak masalah serius. Serta adanya zat pencemar dan sisa dari plat
sendiri setelah pengsekstraksian pita yang mengandung senyawa yang
dipisahkan dengan pelarut (Hostettmann, 1995).
Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa,
dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparative. Hampir
setiap campuran kimia, mulai dari bobot molekul rendah sampai tinggi,
dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya dengan beberapa
metode kromatografi. Jenis pemisahan, apakah analitik atau preparatif,
tidak ditentukan oleh ukuran cuplikan, melainkan lebih oleh keperluan

150 2012 0368
khusus. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan
untuk semua cuplikan, dan kromatografi hanya dilakukan jika diperlukan
fraksi murni dari campuran (Gritter, 1991).
Kadang-kadang kita berhasil memisahkan campuran tertentu
dengan beberapa kali pengembangan memakai sistem pelarut yang sama
yang nisbi nonpolar, padahal campuran itu tidak dapat dipisahkan dengan
sekali pengembangan yang memakai sistem pelarut yang lebih polar.
Jumlah cuplikan lebih banyak dapat dipisahkan dengan cara
pengembangan berganda sehingga hal ini sangat penting pada KLT
preparatif (Gritter, 1991).
Kromatografi pada lapisan berbentuk khusus. Kadang-kadang
lapisan KLT perlu diraut menjadi berbagai bentuk. Pada lapisan belandas
kaca, bentuk itu dapat dibuat dengan spatula atau alat yang diruncing.
Lapisan berlandas plastik dapat dipotong-potong memakai gunting
(Gritter, 1991).
Ketika pelarut muncul dari bagian lapisan yang sempit (tempat
menotolkan cuplikan), pelarut dipaksa bergerak menyamping dan
sekaligus menegak. Ini berarti cuplikan akan berbentuk pita, bukan bercak
bundar. Pita ini lebih tajam dan lebih mudah dilihat, dan kita dapat
menunjukkan komponen yang lebih banyak (Gritter, 1991).
Jika sebuah fraksi dipekatkan dan didinginkan serta pelarutnya
dibiarkan menguap lambat,Kristal dapat membentuk senyawa yang murni
Kristalisasi dapat dilakukan dengan sedikit penggosokan pada bagian

150 2012 0368
dalam dinding kaca selanjutnya membiarkannya di tempat dingin,bahkan
dalam lemari pendingin. Beberapa deposit mungkin merupakan kristalin
dan harus di cek dengan bantuan lensa tangan untuk meyakinkan bahwa
deposit tersebut bukan bahan yang amorf yang berasal dari larutan saat
pendinginan terjadi (Harborne,1987).
Manfaat dari kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa aktif
penyebab efek racun atau efek yang bermanfaat, yang ditunjukkan oleh
ekstrak tumbuhan kasar bila diuji dengan sistem biologi. Dalam hal ini
kita harus memantau cara ekstraksi dan pemisahan pada setiap tahap,
yaitu untuk melacak senyawa aktif tersebut sewaktu dimurnihkan.
Kadang-kadang keaktifan hilang selama proses fraksinasi akibat
ketidakmantapan senyawa itu, dan akhirnya mungkin saja diperoleh
senyawa berupa kristal tetapi keaktifan seperti yang ditunjukkan oleh
ekstrak asal (Harborne, 1987).

150 2012 0368
BAB III
METODE KERJA
A. Alat dan Bahan
1. Alat
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum, yaitu botol eluen,
chamber KLTP, gelas ukur, pipet volume, sendok besi, mistar, pipa
kapiler, pensil, lampu UV254 dan UV366, lempeng KLTP, dan vial
2. Bahan
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum, yaitu
aluminium foil, aquades, asam asetat, butanol, fraksi aktif KKK dan
KCV, kapas, kertas saring, label, dan tisu.
B. Cara Kerja
Ekstraks ditotolkan berbentuk pita pada garis penotolan yang telah
dibuat sebelumnya. Lempeng yang digunakan biasanya berukuran 20x20
cm. setelah sampel ditotolkan pada lempeng, kemudian dikembangkan
dengan eluen yang sesuai dandapat memisahkan komponen kimia.
Setelah pengambilan/elusi, pita-pita tersebut di deteksi dan
diberitanda kemudian dikeruk yang selanjutnya disebut sebagai isolat.
Kemudian tiap-tiap isolate tersebut ditotolkan pada lempeng KLT analitik
untuk melihat profil kromatogramnya. Selanjutnya dilakukan pengujian
antioksidan pada lempeng KLT dengan metode DPPH.

150 2012 0368
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan
Dari praktikum Kromatografi Lapis Tipis Preparatif yang dilakukan
didapatkan data-data sebagai berikut :
Sampel : ekstrak Lobi-Lobi (Flacourtia inermis Roxb)
Jenis Eluen : campuran butanol : asam asetat : water.
1. Tabel hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Fase
Diam Gerak
Metode Jarak Ukuran Nilai Rf
lempeng
KCV 2,6 cm Silica gel Eluen 10 × 10 cm 0,472
3 cm 0,545
KKK 3,2 cm 0,581
Silica gel Eluen 10 × 10 cm

150 2012 0368
B. Pembahasan
Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu
metode yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai
peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam
jumlah gram, sebagian besar pemakainya hanya dalam jumlah
miligram.KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih
dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam.
Adapun mekanisme dan prinsip penampakan noda pada
pengujian kromatografi yaitu pada UV 254 nm, lempeng akan
berfluoresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap.
Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya
interaksi antara sinar UV dengan indicator fluoresensi yang terdapat pada
lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang
dipancarkan oleh komponen tersebut ketika electron yang tereksitasi dari
tingkat energy dasar ke tingkat energy yang lebih tinggi kemudian kembali
ke keadaan semula sambil melepaskan energy.
Dan pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng
akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah
karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor
yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi
cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi
dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan

150 2012 0368
semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada
lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak
berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.
Sedangkan penyemprotan dengan DPPH adalah salah satu
metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah
metode DPPH. Metode DPPH didasarkan pada kemampuan antioksidan
untuk menghambat radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen.
Perubahan warna ungu DPPH menjadi ungu kemerahan dimanfaatkan
untuk mengetahui aktivitas senyawa antioksidan.
Ketika memisahkan dua atau lebih senyawa melalui kromatografi,
sangat penting untuk memilih pelarut yang benar sebagai fase gerak. Jika
terlalu lemah pelarut yang dipilih dari elusi, akan memakan waktu yang
sangat lama dan volume pelarut yang digunakan sangat besar untuk
mengelusi senyawa. Jika terlalu kuat pelarut yang dipilih dari elusi, semua
senyawa akan segera dielusi. Senyawa polar dengan mudah larut dalam
pelarut polar dan memiliki afinitas rendah untuk pelarut nonpolar.
Senyawa memiliki afinitas tinggi untuk pelarut dengan polaritas yang mirip
dengan diri mereka sendiri.
Nilai Rf tergantung pada sifat polar pelarut yang digunakan, sifat
polar dari fase diam, sifat polar sampel dan kondisi percobaan. Suatu
senyawa yang mempunyai nilai lipofilitas tinggi berarti mudah larut dalam
lipid atau pelarut non polar, maka akan mempunyai harga Rf yang rendah
sedangkan senyawa yang mempunyai nilai lipofilitas rendah berarti

150 2012 0368
senyawa tersebut tidak mudah larut dalam lipid atau pelarut non polar,
maka harga Rf-nya bernilai tinggi. Fase gerak yang digunakan dilakukan
pemilihan beberapa campuran fase gerak atau eluen dengan berbagai
perbandingan untuk mendapatkan campuran fase gerak yang optimum.
Telah disebutkan sebelumnya bahwa polaritas sampel dan laju
pergerakan berbanding terbalik. Semakin tinggi polaritas senyawa, fase
diam dari senyawa dengan afinitas yang lebih besar akan mempunyai nilai
Rf yang semakin kecil. Semakin rendah polaritas senyawa, semakin tinggi
afinitas untuk pelarut dan semakin besar nilai Rf. Jika pelarut berubah dari
pelarut polaritas rendah ke polaritas yang lebih tinggi kekuatan elusi akan
meningkat dan akan meningkatkan semua nilai-nilai Rf. Tempat dengan
nilai Rf tertinggi adalah yang paling polar (bergerak tercepat), dan tempat
dengan nilai Rf terendah adalah yang paling polar (bergerak lambat).
Pada percobaan ini zat padat/ fase diam yang digunakan adalah
silika gel karena silica gel cepat daya adsorbsinya dan fase
geraknya/eluen yaitu n-butanol, asam asetat dan air. Eluen merupakan
campuran yang tidak saling tercampur karena adanya perbedaan
kepolaran yang digunakan untuk elusi. Dan sebagaimana n-butanol, asam
asetat dan air mempunyai kepolaran yang berbeda. n- butanol merupakan
eluen yang bersifat semipolar, asam asetat dan air merupakan eluen yang
bersifat polar. Adapun urutan kepolarannya yaitu air > n-butanol > asam
asetat.

150 2012 0368
Langkah pertama yang digunakan pada percobaan ini yaitu
pembuatan eluen. Eluen terdiri dari n-butanol, asam asetat dan air yang
perbandingannya 6 : 1 : 3 v/v. Eluen ini dimasukkan kedalam chamber lalu
dikocok kemudian dijenuhkan. Tujuan penjenuhan ini yaitu untuk
mempercepat proses elusi. Sementara eluen ini dijenuhkan, diukur silika
gel yang akan digunakan untuk penotolan. Pengukurannya harus sesuai
dengan kondisi chamber yang digunakan.
Setelah pengukuran dilakukanlah proses penotolan. Adapun
penotolan yang baik yaitu hanya satu kali dilakukan penotolan dan
penotolannya harus tegak lurus dengan bidang totol. Penotolan dilakukan
dengan menggunakan pipa kapiler (0,5 μL), serta dilakukan secara hati-
hati dan diusahakan noda tidak melebar di absorben. Totolan dimasukkan
kedalam chamber dan totolan contoh ini tidak boleh tercelup kedalam
eluen. Elusi dihentikan sampai eluen menempuh jarak yang telah
ditentukan pada saat pengukuran yaitu dengan menandainya dengan
pensil. Proses bergeraknya eluen ini yaitu dari bawah keatas sehingga
dinamakan proses ascending dan ini dipengaruhi oleh gaya kapiler.
Setelah itu, absorben diangkat lalu dikeringkan selama beberapa saat
agar pelarut menguap sempurna sehingga penambah reaksi tidak terjadi.
Dari hasil percobaan dengan ketiga campuran eluen yang
berbeda didapatkan nilai Rf, untuk metode KCV (7:3) adalah jarak pita
yang dihasilkan 2,6 cm di dapatkan nilai Rf 1 = 0,3472. Sedangkan untuk
metode KKK fraksi 2 (vial 5-9) adalah jarak pita yang dihasilkan 3 cm di

150 2012 0368
dapatkan nilai Rf1 = 0,545, dan jarak pita 3,2 cm di dapatkan nilai Rf 2 =
0,581.
Adapun kesalahan dalam percobaan ini yaitu nilai Rf yang tidak
sesuai dikarenakan pembuatan eluen yang tidak tepat perbandingannya
atau mungkin karena larutan yang sudah tidak murni. Di samping itu, saat
mentotolkan standar tidak dalam kondisi yang benar-benar tegak
sehingga terjadilah hasil noda berbentuk lonjong yang seharusya bulat.
Hal tersebut dapat mempengaruhi nilai Rf yang didapatkan.
Adapun keuntungan KLTP yaitu salah satu pemisahan yang
memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling
dasar adalah kromatografi lapis tipis preparatif. Sedangkan kerugian KLTP
yaitu ketebalan dari lempeng menyebabkan waktu yang dibutuhkan
menjadi lebih lama dibandingkan dengan KLT pada umumnya.

150 2012 0368
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan maka dapat disimpulkan bahwa
dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparative isolat
yang didapatkan adalah 3 pita dengan nilai Rf masing-masing. Untuk
metode KCV memiliki nilai Rf1 = 0,3472 sedangkan untuk metode KKK
memiliki nilai Rf1 = 0,545, dan Rf2 = 0,581.
B. Saran
Saran untuk laboratorium agar alat dan alat didalam laboratorium
harus ditambah agar dapat meminimalkan dan mengefisienkan waktu
praktikum. Terutama alat yang berhubungan dengan praktikum ini.

150 2012 0368
DAFTAR PUSTAKA
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan.

Yogyakarta : Penerbit Andi.
Alimin, dkk. 2007. Kimia Analitik. Alauddin. Press: Makassar.
Darwis D. 2000. Teknik Dasar Laboratorium Dalam Penelitian Senyawa

BahanAlam Hayati, Workshop Pengembangan Sumber Daya
Manusia Dalam Bidang Kimia Organik Bahan Alam Hayati,
FMIPA Universitas Andalas :Padang.
Depkes RI. 1986. Sedian Galenik. Jakarta: DitjenPOM. Hal. 12, 26.
Ditjen POM.1979. Farmakope Indonesia. Depkes RI. Press : Jakarta
Gholib, I. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
Gritter,R.J. 1991. Pengantar Kromatografi. Edisi ke-1. ITB. Bandung.
Haqiqi, S.,H. 2008. Kromatografi Lapis Tipis. nadjeeb.files.wordpress .com

/2009/10/kromatografi.pdf
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: Penerbit ITB.
Hostettmenn. K. 2006. Cara Kromatografi Prepartif. ITB Bandung.
Ibrahim, Syarif. 2010 Immunotherapy on Breast Cancer.The Indonesian

Journal of Medica Science.
Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press: Jakarta.
Kristanti, Alfinda Novi., dkk. 2008. Buku Ajar Fitokimia. Airlangga

University Press. Surabaya.
Sastrohamidjojo, Dr.H. 1985. Kromatografi. Penerbit Liberty: Yogyakarta.
Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi.

ITB. Bandung.
Sudjadi. 1988. Metode Pemisahan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta.
Tambunan, T. 2011. Karakterisasi Simplisia, Skrining Fitokimia dan Uji

Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Kelopak Bunga Rosela
(Hibiscus sabdariffa L.). Skripsi. Medan: Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara.

150 2012 0368
Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Andi. Yogyakarta.
Yoshito, Takeuchi. 03-01-2009. Kromatografi. Online. http://www.chem-is-

try.org/mate ri kimia/kimia dasar/pemurnian-
material/kromatografi/ Diak ses tanggal 14 Mei 2011.
Wood E.,G. 1985. Instrumental of Chemical Analysis Fifth edition. Mc

Graw-Hill. Singapore.

150 2012 0368
LAMPIRAN
Lampiran 1. Skema kerja praktikum
Siapkan alat dan bahan
fraksi
ditotol pada lempeng
dimasukkan pada chamber yang berisi eluen
lempeng dielusi
diamati pita dalam UV
disemprot DPPH
dihitung nilai Rf

150 2012 0368
Lampiran 2. Gambar Pengamatan
A. KCV UV 254 nm
B. KKK UV 254 nm

150 2012 0368
C. KCV UV 366 nm
D. KKK UV 366
E. DPPH

150 2012 0368
Lampiran 3. Perhitungan Nilai Rf
1. Fraksi kromatografi kolom konvensional (vial 5-9 )
Dik : eluen = 5,5 cm
Pita 1 = 3 cm
Pita 2 = 3,2 cm
Dit : Rf ..?
jarak rambat noda
Rf =
jarak rambat eluen
3 cm
Rf1 = = 0,545
5,5 cm
3,2 cm
Rf2 = = 0,581
5,5 cm
2. Fraksi kromatografi cair vakum (7:3)
Dik : eluen = 5,5 cm
Pita 1 = 2,6 cm
Dit : Rf ..?
jarak rambat noda
Rf =
jarak rambat eluen
2,6 cm
Rf1 = = 0,472
5,5 cm

150 2012 0368

KLTP FRAKSI AKTIF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Deskripsi Asli:

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

KLTP FRAKSI AKTIF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF FRAKSI AKTIF

Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett

(1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari

bahasa Yunani (chromato = penulisan dan grafe = warna). Kromatografi

berarti penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan

campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen

yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada campuran

bahan adalah prinsip dasar kromatografi.

Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada

sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan.Kromatografi digunakan

sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-

komponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang terdapat pada tahu,

tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak manfaat.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan

campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui

kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan

analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap

SRI ARISTA RAHMAWATI RIVAI

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa

yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang

sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna

untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang

diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara

kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.

Beberapa kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi

kesehatan manusia, diantaranya adalah sebagai antioksidan,

antitumor /antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan dapat

mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan

Pada percobaan kali ini ditentukan fraksi aktif flavonoid hasil

menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparative (KLTP).

B. Maksud dan Tujuan Praktikum

Adapun maksud dari praktikum ini adalah untuk menentukan

(Flacourtia inermis Roxb) dengan menggunakan metode kromatografi

lapis tipis preparatif (KLTP).

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk menentukan fraksi

SRI ARISTA RAHMAWATI RIVAI

inermis Roxb.) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis

Adapun manfaat dari percobaan ini adalah kita dapat mengetahui

bagaimana cara memisahkan atau mengisolasi dan mengidentifikasi

senyawa-senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi daun Lobi-lobi lobi

(Flacourtia inermis Roxb.) menggunakan Kromatografi Lapis Tipis

SRI ARISTA RAHMAWATI RIVAI

Pada dasarnya isolasi senyawa kimia dari bahan alam adalah

sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang berca

mpur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang

murni. Tumbuhan mengandung ribuan senyawa yang dikategorikan

sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder. Biasanya proses

isolasi senyawa dari bahan alami ini mentargetkan untuk mengisolasi

senyawa metabolit sekunder, karena senyawa metabolit sekunder

diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi kehidupan

manusia. Antara lain manfaatnya dalam bidang pertanian, kesehatan

dan pangan. Metode standar laboratorium dengan kuantitas sampel

terbatas dan perlunya menentukan metode yang paling sesuai

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran

menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-

masing komponennya. Berdasarkan hal di atas maka metode umum

dalam isolasi senyawa metabolit sekunder dapat digunakan. (Darwis,

Dari identifikasi awal, maka dapat diamati kandungan senyawa

dari tumbuhan sehingga untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu

senyawa yang lebih dominan dan salah satu usaha mengefektifkan

SRI ARISTA RAHMAWATI RIVAI

isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut