metode pembuatan vaksin hepatitis B

→ Persiapan bahan: biji direndam dalam air selama 2 jam, kemudian disterilkan dengan alkohol 70% selama
menit dan dicuci dengan air steril beberapa kali. Lalu, disterilkan lagi dengan NaClO selama 5 menit dan
dikeringkan beberapa kali. Biji ini kemudian ditumbuhkan dalam media ½ Murashige-Skoog (MS) tanpa
penambahan hormon. Setelah 10 hari, bagian kotiledon dipotong dan digunakan sebagai media transformasi d
Agrobacterium.
→ Plasmid pBI121/HB yang membawa gen 681-bp akan mengkode antigen permukaan hepatitis B serotipe a
(HBbsAg/adr). Gen HBsAg yang mengandung promoter CAMV35S dan terminator nitric oxide dipotong ole
plasmid pBI121/HB, diklon oleh pCAMBIA1301 setelah diberikan enzim Hind III dan ECO RI endonuklease
diubah menjadi DH5α yang selanjutnya digunakan sebagai plasmid rekombinan dengan nama
pCAMBIA1301/HB.
→ Sel strain Agrobacterium LBA4404 diubah secara langsung dengan plasmid yang diperoleh dari klon E.co
yang sebelumnya telah mengalami perubahan struktur akibat enzim retriksi. Tanaman cherry tomato (L.escul
Mill) ditumbuhkan dalam kondisi yang steril. Bagian daun direkayasa dengan Agrobacterium yang mengandu
plasmid pCAMBIA1301/HB. Tunas yang dihasilkan dari kalus ditanam pada media MS yang mengandung 20
mg/L Hyg dan 300 mg/L sefotaksim. Tunas ini kemudian dipindahkan ke media tanah. Identifikasi dan detek
dilakukan pada 20 tanaman yang diberi perlakuan yang sama.
→ Isolasi DNA dan identifikasi PCR
PCR dilakukan dengan metode Taq Polymeration. PCR diawali dengan denaturasi pada suhu 94○C selama 5 m
35 siklus pada suhu 94○C selama 30 menit, 59○C selama 40 detik, dan 72○C selama 1 menit, diikuti dengan
inkubasi pada suhu 72○C selama 10 menit. Urutan basa primer dari gen HBsAg adalah
5’AACGGGATCCCGCACC ATGGAGAACACAACATCA 3’ dan reverse primer
3’CCCGGAATTCCGGCTTAAATGTAT ACCCAAAGAC 5’
Analisis tanaman transgenik dari Southern
DNA genomik yang dicerna setelah pemisahan gel dihapuskan dalam Hybond N + membran
nilon (Amersham Pharamacia Biotech, Inggris). 681 bp BamHI fragmen dari pCAMBIA1301
/ HB yang mengandung gen HBsAg S diberi label menggunakan North2South® DIRECT
HRP Labeling dan Deteksi Kit dari PIERCE (Pierce Bioteknologi, Inc., Rockford, IL, USA)
sesuai dengan petunjuk pabrik, dan digunakan untuk hibridisasi . The Southern blotting dan
hibridisasi selanjutnya dilakukan seperti yang dijelaskan dalam Sambrook dan Russell. Hasil
terdeteksi oleh paparan film X-ray.

Analisis ELISA
protein yang telah diekstraksi dari kontrol daun dan buah yang belum ditransformasi dan
tanaman transgenik seperti yang dijelaskan sebelumnya. Setiap kelompok berisi 20 tanaman.
Ekstrak diklarifikasi dan diuji dalam 3x pengulangan untuk tingkat ekspresi HBsAg, dan nilai
rata-rata diambil sebagai perkiraan jumlah HBsAg. Enzim-linked Immunosorbent Assay
HBsAg (ELISA) kit dibeli dari Wantai Bioteknologi Co, Ltd (Beijing, China), dan standar
HBsAg disediakan oleh Perusahaan Huamei Bioteknologi. Kontrol positif (serum manusia
berasal dari HBsAg) sebagai standar dan kontrol negatif yang digunakan dari (protein yang
diekstraksi dari kontrol yang tidak bertransformasi).
Gambar 1. pembangunan pabrik vektor ekspresif. Plasmid pCAMBIA1301 / HB dengan
dimasukkan HBsAg bawah kendali virus mosaik promotor p35S (CaMV 35S) pada kembang
kol.
Jumlah protein yang larut mengandung HbsAg yang terdeteksi oleh ELISA dan diukur
dengan kurva standar yang ditetapkan oleh seri pengenceran standar HBsAg.
Ekstraksi protein dan Western blot
Jumlah protein dari kedua tanaman yang belum ditransformasi dan ditransgenik akan
diperoleh dengan sentrifugasi pada 2000 ×g, dan konsentrasi 5-kali lipat. Konsentrasi protein
diperkirakan dengan prosedur Bradford. Western blotting dilakukan seperti yang dijelaskan
dalam Sambrook et al.Protein dipisahkan dengan natrium dodesil sulfat poliakrilamida gel
elektroforesis (SDS-PAGE, 15% akrilamida), dan dipindahkan ke fluoride polyvinylidene
(PVDF) membran (Amersham) menggunakan alat pemindahan semi-kering (Bio-Rad).
Membran diblokir selama 1 jam pada suhu kamar dengan 150 mM NaCl, 10 mM Tris / HCl
pH 8,0, 0,1% Tween 20 dan 1% Triton X-100, dan 5% (b / v) susu skim. Bercak diinkubasi
dengan kelinci khusus anti-Fab IgG antibodi poliklonal, disiapkan seperti yang dijelaskan
sebelumnya dan diencerkan sampai 10 ug ml-1 di Tris -buffered saline (TBS) yang
mengandung 1% susu skim (1% TBS). Setelah 2 jam pada 37 ° C, membran dicuci dan
konjugat anti-kelinci konjugat IgG alkali fosfat kambing (Boehringer Mannheim), setelah
diencerkan 1: 1600 dalam 1% TBS ditambahkan selama 1 jam pada 37 ° C. Reaksi enzimatik
dikembangkan dengan nitroblue tetrazolium (0,1 mg ml-1), dan 5-bromo-4-chloro-3-fosfat
indolyl (0,06 mg ml-1) di 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, dan 100 mM Tris / HCl pH 9,5
digunakan. Berat molekul protein diperkirakan dengan penanda pra-bernoda (Rainbow
Dingin Spidol, Amersham).