TUGAS IMUNOLOGI

“Eksplorasi dan Identifikasi Antigen Protein Salmonella typhi pada

Penderita Demam Tifoid Akut”

Nama : Citra Amaniah Anhar

NIM : 011814153006

PROGRAM STUDI S2 ILMU KEDOKTERAN DASAR

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA

TAHUN AKADEMIK 2018-2019

PENDAHULUAN

Demam tifoid disebabkan oleh Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi), patogen yang
dibatasi manusia yang memasuki inang melalui jaringan limfoid yang berhubungan dengan
usus. Perhitungan terbaru dari prevalensi tifoid memperkirakan bahwa 11,9 ± 20,6 juta kasus
demam tifoid baru terjadi setiap tahun di negara-negara berpenghasilan rendah dan menengah
dengan sekitar 129.000 ± 223.000 kematian. Berdasarkan data yang disediakan oleh WHO,
90% kematian tifoid ini terjadi di Asia, dan sebagian besar korban adalah anak-anak di bawah
usia lima tahun. Organisme tifoid memiliki kemampuan untuk mengatur respon imun tuan
rumah selama infeksi. Namun, sebagian besar penderita memiliki respon antibodi yang dapat
dideteksi pada polisakarida Vi kapsul, O (lipopolisakarida), dan antigen H (flagellar) selama
infeksi aktif dan untuk periode yang lebih lama setelahnya. Angka prevalensi tertinggi di
negara-negara endemik, meskipun titer individu bervariasi sesuai dengan lokasi geografis, usia,
dan tingkat pemaparan. Ini berdasarkan atas individu di daerah endemik yang sering memiliki
antibodi Vi tinggi dan titer antibodi O tanpa riwayat klinis tifoid dan oleh ketidakmampuan
untuk mendeteksi respons antibodi yang tinggi pada pasien yang dikonfirmasi kultur. Semua
diagnosa tifoid yang umum digunakan berkinerja kurang spesifik dan merupakan penghalang
jalan bagi upaya pengendalian penyakit. Saat ini, metode yang dapat diandalkan untuk
identifikasi tiap penderita demam tifoid adalah kultur organisme kausatif dari spesimen
biologis. Namun, prosedur ini terbatas pada laboratorium dengan peralatan yang memadai dan
pelatihan mikrobiologi, dan metode ini memiliki sensitivitas terbatas karena konsentrasi
organisme yang rendah dalam sirkulasi perifer. Sehingga menggunakan metode llain yang
bergantung pada mendeteksi antigen organisme yang menginfeksi atau amplifikasi asam
nukleat. Metode-metode ini sering dilaporkan sangat sensitif. Diagnostik tifoid baru
menggunakan berbagai pendekatan pengukuran respon imun bawaan, antibodi pada supernatan
limfosit, dan identifikasi tanda-tanda metabolomik. Namun, kemajuan ini masih terbatas pada
laboratorium penelitian dan belum siap dikembangkan menjadi tes diagnostik cepat sederhana
(RDT). Dalam mengidentifikasi banyak antigen protein Salmonella typhi bersifat imunogenik
yang respon antibodinya dihasilkan selama tahap awal tifoid dengan memurnikan serum pasien
tifoid, kemudian mengenali protein rekombinan larut dalam teknik biologi molekular, hal ini
bermaksud untuk memvalidasi antigen yang dapat digunakan dalam uji diagnostik.
Berdasarkan dari latar belakang tersebut, maka penulis merumuskan masalah yang tepat yaitu
: (1) Apa saja jenis antigen protein Salmonella typhi yang dapat ditemukan pada demam tifoid
akut?; (2) Bagimanakah metode dalam menentukan antigen protein Salmonella typhi pada
demam tifoid akut yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas tinggi ?

PEMBAHASAN

KOMPONEN ANTIGEN Salmonella typhi

Demam Tifoid dan paratifoid tipe A, B, dan C disebabkan oleh Salmonella enterica
serovar thyphi (S.typhi) dan serovar paratyphi A, B, dan C. Spesies Salmonella merupakan
famili Enterobacteriaceae menyebabkan penyakit enterik yang populer. Berdasarkan filogeni
nya terdapat empat komponen antigenik penting yang dapat ditemukan pada Salmonella typhi
yaitu:
(1) Capsular Vi Polysacharide; memiliki BM 65 x 103 kDa terletak pada lapisan luar,
merupakan homopolimer linier yang terikat pada 1,4 N-acetylgalactosaminuroic acid,
memiliki 2 kelompok determinan antigen yaitu O-acetyl yang imunodominan dan N-acetyl dan
carboxyl yang memiliki potensi terjadinya reaksi antigen-antibodi, merupakan antigen
independen limfosit T dan respon imunnya dimediasi sel B (Nasrodin, 2011), memiliki istilah
Antigen K permukaan dimana bahan penyusunnya merupakan polisakarida peka panas yang
terletak di permukaan kapsul bakteri dan merupakan antigen paling umum ditemukan di
serotipe Salmonella, dan hanya ditemukan dalam tiga serotipe patogen: Paratyphi C, Dublin
dan Typhi (Shue-Kee-Eng et.al.,2015).

(2) Lipopolysacharide (LPS); memiliki dua deterimanan antigen yang dikenal sebagai
endoteksin, merupakan rantai heteropolisakarida unit oligosakarida (O antigen) terjalin ke inti
melalui asam heteroligosakarida (inti) yang kovalen dalam rangkaian lipiodal, acetylated
glucosamine disaccharide (lipid A) (Nasrodin, 2011), merupakan antigen somatik O yang
stabil terhadap panas, dan Serotipe nya bersifat spesifik yang dapat mengekspresikan lebih
dari satu antigen O pada permukaan Salmonella (Shue-Kee-Eng et.al.,2015).

(3) Flagella Protein; biasa dikenal dengan antigen H, mengandung protein polimerase
yang disebut flagellin yang merupakan bagian penting dalam respon imun, mempunyai 2
bentuk fase yaitu fase 1 dan fase 2 (Nasrodin, 2011), dan setiap serotipe mengekspresikan fase
I berupa antigen H spesifik yang bertanggung jawab untuk identitas imunologinya, sedangkan
fase II antigennya berupa antigen non-spesifik yang dapat dibagi oleh banyak serotipe (Shue-
Kee-Eng et.al.,2015).
 (4) Outer Membrane Proteins (OMPs); proteinnya terdiri atas porin (berada diantara 2
lapis lipid pada permukaan S.typhi, berperan langsung dalam patogenesis dan merupakan
antigen yang penting dalam respon imun host, memliki BM 36-41 kDa, bersifat hidrofilik,
contohnya adalah OmpB, C, D, dan F) dan nonporin (berinteraksi dengan peptidoglikan,
memiliki BM 33 kDa, berperan sebagai reseptor bakteriosin/ mempertahankan morfologi serta
integritas membran luar, contohnya adalah OmpA) (Nasrodin, 2011).

JENIS ANTIGEN PROTEIN Salmonella typhi PADA DEMAM TIFDOID AKUT

S. Typhi menghasilkan hemolisin E (HlyE), yang juga dikenal sebagai Cytolysin A (ClyA)
atau hemolisin diam, lokus A (shea). Ini merupakan toksin pembentuk yang merugikan dan
menular ke manusia. Fraksi yang dimurnikan protein HlyE memiliki ukuran yang diharapkan
dari sekitar 30 kDa berdasarkan natrium dodesil sulfat poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-
PAGE) pemisahan. HlyE S. Typhi dan S. Paratyphi A dapat diaktifkan oleh faktor Salmonella
transkripsi SlyA yang merupakan regulator penting dari gen virulensi di Salmonella.
Berdasarkan pengamatan mikroskop elektron, molekul HlyE diprediksi oligomerize untuk
membentuk saluran yang diproyeksikan ke arah luar dari membran, kemudian membentuk
struktur pori-seperti dimana pori-pori ini membentuk toksin S. Typhi dan S. Paratyphi diyakini
bertanggung jawab untuk infeksi manusia dan patogenesis Salmonella tertentu. Selain itu HlyE
dilaporkan kaya akan α-heliks dengan beberapa segmen peptida amphiphilic yang diyakini
analog dengan membran protein yang mengikat dan pori pembentuk. HlyE merupakan
antigenik yang spesifik dapat mendeteksi demam tifoid di bawah denaturasi kondisi . Oleh
karena itu, antibodi terhadap HlyE imunogenik berpotensi dapat berguna untuk diagnosa (Lim
et.al., 2016).

Selain toksin HlyE, terdapat toksin tifoid lainnya yang dapat menjadi faktor terkait
virulensi S. Typhi, yang dianggap sebagai berhubungan dengan gejala awal tifus. Menurut
(Tran et, al., 2016), mereka mengkonfirmasi menemukan 3 antigen terbaik sebagai komponen
toksin tifoid yang bersifat imunogenik dan dapat menjadi biomarker penting dari tifoid akut,
diantaranya adalah PilL (protein yang diduga diekspor dan komponen dari tipe IV pili yang
disandikan berdekatan dengan gen yang menyandikan Vi pada SPI-7,40,41 Protein PilL
diinduksi menyusul penyerapan oleh makrofag yang diturunkan manusia dan pili tipe IV yang
dikaitkan memfasilitasi masuk ke sel epitel), CdtB (dikodekan oleh STY1886, adalah salah
satu dari dua sub-unit toksin tifoid, sejenis AB), dan Vi (antigen kapsular yang dikodekan oleh
lokus viaB, memiliki kemampuan untuk menekan deteksi oleh bawaan sistem kekebalan yang
prinsipnya selama infeksi, dapat melepaskan jumlah Vi yang mengikat sel T melalui
pelarangan kompleks dan menghambat sekresi interleukin-2dari sel T dirangsang melalui sel-
T reseptor, mengurangi ekspresi IL-8 dalam mukosa usus, dan dengan demikian menurunkan
respons inflamasi) (Zhang et.al., 2018).

Di sisi lainnya, (Salerno et.al., 2017) menggunakan sistem antigen yang mengekspresikan
secara inovatif dengan berdasarkan pada infeksi sel-B dengan E. coli rekombinan untuk
mengevaluasi tanggapan sel T untuk empat S. protein Typhi: SifA (diperlukan untuk tubulasi
endosomal dan pembentukan filamen yang diinduksi Salmonella sp.), FliC (Flagelin yang
tergantung motilitas sel di tiap jenis bakteri), GroEL (Chaperonin yang mempromosikan
pelipatan protein), dan OmpC (Protein membran luar yang dapat membentuk pori-pori yang
memungkinkan terjadinya difusi molekul-molekul kecil melintasi membran luar). Keempat
protein ini dikenal memberikan sifat-sifat bertahan hidup terhadap Salmonella dan oleh karena
itu dapat dievaluasi sebagai antigen yang bersifat imonogenik.

METODE PEMURNIAN DAN PEMERIKSAAN ANTIGEN PROTEIN Salmonella

typhi

(1) Metode Microarray

Merupakan metode mini-preparasi DNA yang dimurnikan yang digunakan untuk ekspresi
dalam sistem reaksi transkripsi-translasi Eschericia coli secara in vitro (IVTT) dengan
mengikuti instruksi pabrik. Reaksi kontrol negatif adalah reaksi yang dilakukan dengan
tidak adanya templat DNA ("NoDNA" kontrol). Campuran inhibitor protease dan Tween-
20 (konsentrasi akhir 0,5% v / v) yang ditambahkan ke dalam reaksi, kemudian dicetak ke
kaca nitroselulosa dilapisi slide menggunakan printer microarray Omni Grid 100
(Genomic Solutions). Beberapa reaksi kontrol negatif dan titik kontrol positif dari
campuran IgG yang mengandung tikus serta IgG dan IgM manusia yang ditambahkan ke
array. Ekspresi protein diverifikasi dengan probing array dengan monoclonal anti-
polyhistidine dan anti-hemaglutinin (Carolina et.al., 2017). Tahapan dalam metode
microaaray antara lain :
a. Pemurnian protein dan Amplifikasi oleh PCR

Memilih 18 Salmonella typhi antigen yang memberikan sinyal serodiagnostic

diferensial menggunakan skrining microarray protein untuk ekspresi dan pemurnian lebih
lanjut. Urutan pengkodean dari gen yang dipilih, tidak termasuk domain transmembran
yang diamplifikasi PCR dari DNA genom CT18 dan dikloning ke 50 NcoI dan 30NotI
situs dalam vektor pembatasan pET28b (þ) untuk pemurnian lebih lanjut-Tag-Nya.
Escherichia coli DH5a ditransformasikan dengan konstruk plasmid untuk penyimpanan
stabil dan Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS digunakan untuk ekspresi dan pemurnian.
Untuk ekspresi protein, strain E. coli BL21 (DE3) pLysS mengandung konstruksi plasmid
unik (pEK90-pEK109) mengandung gen bunga yang diinokulasi ke dalam kaldu LB yang
mengandung 100 mg / L kanamisin, dan diinkubasi pada 370 C semalam. Kultur semalam
diencerkan (1: 100) ke dalam kaldu LB dan diinkubasi pada suhu 37° C dengan agitasi
sampai densitas optik (OD600) 0,5. Ekspresi protein eksogen diinduksi oleh penambahan
isopropil-b-D-thiogalactoside (IPTG), ke konsentrasi akhir 0,1 mM. Sel bakteri dipanen
5000 xg pada 40 C selama 10 menit), setelah 3 jam inkubasi pada 24? C. Untuk protein
terlarut, pelet bakteri diresuspensi dalam 50 mM dapar fosfat (pH 8) mengandung 300 mM
NaCl dan 10 mM imidazole. Setelah sonikasi, puing-puing sel dan fragmen membran yang
pellet dengan sentrifugasi pada16.000 xg pada 40 C selama 30 menit. Supernatan disaring
melalui membran 0,45 mm sebelum digoyangkan pada 40 C dengan butiran agarose nikel
(Ni-NTA, Invitrogen) selama 2 jam. Protein terikat pada butiran Ni-NTA yang dimuat ke
kolom aliran gravitasi dan dicuci dengan imidazole 20 mM dalam buffer fosfat. Protein
dielusi dengan imidazole 250 mM dalam buffer fosfat. Untuk protein yang tidak larut,
protokol denaturasi dilakukan dengan terlebih dahulu menginkubasi sel bakteri dalam
larutan 8 M urea (pH 7,8) yang mengandung 20 mM natrium fosfat dan 500 mM NaCl.
Protein dielusi dengan 4 M Urea (pH3) dalam larutan yang mengandung 20 mM Sodium
Phosphate buffer dan 500 mM NaCl. Protein diperbarui setelah pemurnian dalam 50 mM
larutan Sodium Phosphate dan 500 mM NaCl (Tran et.al., 2017).

b. Microarray Protein

Gen-gen Salmonella typhi yang diamplifikasi dan dikloning menggunakan metode PCR
dan rekombinasi tinggi yaitu ORFs dari DNA genomik TY2 Salmonella typhi DNA yang
diidentifikasi menggunakan GenBank NC_004613 dan diamplifikasi menggunakan
primer spesifik gen yang mengandung 20 bp nucleotide extension komplementer untuk
ujung vektor pXT7 linier, yang memungkinkan rekombinasi homolog antara produk PCR
dan vektor pXT7 pada sel DH5a yang kompeten. Protein fusi yang dihasilkan juga
memendam epitop hemagglutinin pada ujung 3 ′ dan polyhistidine pada ujung 5 ′. ORF
lebih panjang dari 3 kb dibagi menjadi beberapa segmen tumpang tindih in-frame yang
lebih pendek dari 3 kb untuk kloning. Plasmid diekspresikan pada 240 C dalam 16 jam
secara in vitro ditranskripsikan pada sistem E. coli (kit ekspres dari Invitrogen). Untuk
mikroarray, 10 μl reaksi dicampur dengan 3,3 μl 0,2% Tween 20 untuk memberikan
konsentrasi akhir 0,05% Tween 20, dan dicetak ke kaca dilapisi nitroselulosa slide
(Whatman) menggunakan printer Omni Grid 100 microarray (genomic solutions).
Ekspresi protein dan pencetakan dipantau dengan imunoprobing dengan anti-polyhistidine
(klon His-1) dan anti-hemaglutinin (klon 3F10). Salmonella enterica lipopolysaccharide
dan E.coli lipopolysaccharide dibeli dari Sigma dan dicetak pada 0,1 mg / mL dan 0,01
mg / mL (L6511, L2880, Sigma). Sampel serum manusia diencerkan menjadi 1: 200
dengan 10 mg / ml E. coli lysate. Slide microarray diinkubasi dalam antibodi sekunder
biotin-konjugasi (Jackson ImmunoResearch) diencerkan 1/200 dalam buffer pemblokiran,
dan dideteksi dengan inkubasi dengan SureLight® P-3 yang konjungtif streptavidin. Slide
dicuci dan dikeringkan dengan sentrifugasi singkat. Slide microarray dipindai dan
dianalisis menggunakan scanner microarray HT Perkin Elmer ScanArray Express.
Intensitas dihitung menggunakan software QuantArray. Semua intensitas sinyal dikoreksi
untuk latar belakang tempat tertentu. Semua intensitas sinyal dikoreksi untuk latar
belakang tempat tertentu (Li Liang et.al., 2013).

c. Pemeriksaan IgG Plasma oleh ELISA

Respon antibodi spesifik antigen ditentukan oleh tes immunosorbent enzyme-linked

(ELISA). Polystyrene 8-well plates (piring microtiter MaxiSorp) dilapisi dengan 3 μg
rFliC yang dilarutkan dalam 100 µL buffer coating (64 mM Na2CO3, 136 mM NaHCO3,
pH 9.8) dan kemudian diinkubasi semalaman pada 4 ° C. Piring dicuci tiga kali dengan
PBS / T (PBS mengandung 0,05%, w / v Tween-20). Saat pengikatan nonspesifik diblok
dengan 100 μL susu skim 3% (w / v) di PBS / T (1 jam, 37 ° C). Sampel serum secara
serial diencerkan menjadi 1: 500 dalam PBS yang mengandung 0,03% Tween-20 dan
ditambahkan ke pelat ELISA. Setelah tiga langkah pencucian, 100 μL IgG peroksidase
konjugasi (Sigma) diencerkan 1: 5000 di PBS / T ditambahkan ke piring. Pelat diinkubasi
selama 1 jam pada 37 ° C dan kemudian dicuci tiga kali dalam PBS / T. Untuk setiap
sumur, 100 μL substrat TMB (Sigma) ditambahkan dan diinkubasi pada suhu kamar
selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan 100 μL 2 M H2SO4 dan hasilnya dibaca oleh
pembaca ELISA pada panjang gelombang 450 nm. Pemurnian IgG Anti-FliC dengan
kolom Protein G Sepharose 4B Antibodi IgG dimurnikan menggunakan kolom G
Sepharose 4B (Sigma). Pada awalnya, kolom dicuci dengan 100 mM Tris-HCl buffer (pH
= 8) diikuti oleh 10 mM Tris-HCl buffer (pH = 8) sampai kolom mencapai kesetimbangan.
 Sampel serum dimuat ke kolom dan dicuci dengan 100 mM Tris-HCl buffer (pH = 8)
diikuti oleh 10 mM Tris-HCl buffer (pH = 8) sampai semua protein lain dielusi. Antibodi
dielusi dari kolom dengan melewatkan 100 mM glycine buffer (pH = 3). Pada akhirnya,
kemurnian IgG dikonfirmasi oleh SDS-PAGE (12%). Penentuan konsentrasi antibodi dan
bakteri yang optimal ELISA dilakukan seperti yang dijelaskan di atas menggunakan
konsentrasi yang berbeda dari antibodi IgG anti-FliC murni (2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50
dan 60 μg) dan konsentrasi konstan antigen (3 μg) ). Dalam satu set percobaan, ELISA
dilakukan dengan konsentrasi antigen yang berbeda (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 15 dan 20 μg)
dan konsentrasi konstan antibodi (10 μg). Setelah ini, seluruh sel-ELISA bakteri dilakukan
dengan strain standar Salmonella enteritidis menurut standar McFarland (OD: 0,257 nm,
kepadatan sel 3 × 108 CFU / mL). Dalam pengujian ini, lempeng dilapisi dengan berbagai
konsentrasi sel bakteri (108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, dan 10 CFU / mL) dan terpapar
dengan konsentrasi konstan (10 ug) dari antibodi (Seyed Ali et.al., 2017).

(2) Metode Biopanning

Merupakan metode penyaringan memori pada tampilan phage untuk pengayaan
peptida yang secara khusus mengikat target minat yang dilakukan melalui strategis
berbasis seleksi afinitas, dimana popukasi partikel phage diinkubasi dengan target dalam
jangka waktu tertentu kemudian dilakukan serangkaian pencucian yang ketat dan pada
akhirnya akan menangkap phage yang menampilkan peptida terikat. Metode ini dapat
digunakan untuk pemulihan virion karena partikel phage sangat stabil dalam kondisi yang
keras (Aghebati-Malaki et.al., 2016). Tahapan dalam metode biopanning antara lain :
a. Amplifikasi V-gen kappa (Vκ), lambda (Vλ) dan isotype IgM
Mengisolasi limfosit menggunakan metode Ficoll-Paque PLUS sesuai dengan
instruksi pabrik dengan 10 mL darah dikumpulkan di Vacutainer EDTA (BD) tabung.
RNA total diisolasi menggunakan QIAamp kit darah RNA dan cDNA disintesis
menggunakan Superscript III dengan hexamers acak menggunakan 50-250 mRNA ng
(Kugler et.al., 2015). Antibodi amplifikasi V-gen kappa (Vκ), lambda (Vλ) dan isotype
IgM berasal VH dari setiap individu dilakukan dengan menggunakan set primer.

Sebanyak 1800 PCR individu dari masing-masing cDNA donor dilakukan secara
independen dalam volume reaksi 20 uL menggunakan 1U dari PFU DNA polimerase dan
0,2 pM primer masing-masing selama 30 siklus pada 95 °C selama 30 detik pada 55 ° C /
62 ° C selama 45 detik, dan pada 72 ° C selama 5 menit. Semua primer yang digunakan
disintesis oleh IDT. Produk PCR dimurnikan dengan elektroforesis gel agarosa
menggunakan kit ekstraksi berupa QIAquick Gel. VH, Vλ dan Vκ PCR produk
dikumpulkan secara terpisah. Untuk menambahkan situs restriksi untuk penggandaan, 30
ng dari pooled VH, Vλ dan Vκ PCR produk PCR pertama untuk setiap satu kolam renang
yang digunakan dalam volume akhir 20 uL dengan Vent polimerase menggunakan 0,2 pM
masing-masing primer untuk PCR amplifikasi. PCR Program amplifikasi termasuk 30
siklus (30 s 95 ° C, 45 s 55 ° C, 1 menit 72 ° C) diikuti oleh ekstensi akhir 5 menit pada
72 ° C. Produk PCR dimurnikan dengan elektroforesis gel agarosa menggunakan ekstraksi
QIAquick Gel. VH, Vλ dan Vκ PCR produk kemudian dikumpulkan secara terpisah (Liem
et.al., 2016).

Sebuah protokol penggandaan dua langkah digunakan untuk penggandaan memori.

Ini melibatkan generasi memori mini variabel rantai ringan (VL) yang terdiri dari kedua
keluarga Vλ dan Vκ pertama sebelum pengenalan rantai berat dengan linker glisin-serin.
Untuk VL kloning, 2 mg dari pLABEL vektor yang berasal dari pTSL dan VL (Vλ dan
Vκ) produk PCR dicerna dalam volume akhir 50 uL dengan 10U dan 20U untuk NotI dan
SalI masing-masing pada 37 °C semalam. Pencernaan yang tidak aktif pada 65 °C selama
20 menit, dilanjutkan dengan defosforilasi menggunakan 5U alkali fosfatase. Setiap ligasi
dilakukan dengan 1 mg dicerna vektor dan 270 ng produk PCR menggunakan 400 U T4
DNA ligase dalam volume 20 uL pada 8 °C. Menonaktifkan ligasi pada 65 °C selama 10
menit dan diendapkan dengan 2 uL 3 M natrium asetat pH 5,2 dan 50 uL etanol selama 3
jam pada -80 ° C, diikuti oleh 20 menit sentrifugasi pada 16.000 × g. Pelet dicuci sekali
dengan 300 uL 70% (v / v) etanol. pelet kering itu resuspended dalam 4 uL dH2O dan
dicampur di es dengan 50 uL electrocompetent Escherichia coli XL1-Blue MRF.
Elektroporasi dilakukan dengan 0,1 cm prechilled cuvettes menggunakan MicroPulser
electroporator sebesar 1,7 kV. Memanaskan dengan suhu 37 ° C, menambahkan 2 YT-
GA agar dan diinkubasi selama 30 menit pada 750 rpm. Transformasi yang berlapis pada
25 cm2 cawan Petri dengan 2 YT-GA agar (1,6% (w / v) Tryptone, 1% (w / v) ekstrak ragi,
0,5% (b / v) NaCl, 100 mM glukosa, 100 ug / mL ampicilin, 1,5% (b / v) agar-agar) dan
diinkubasi o / n pada 37 ° C. Secara paralel, 10-6 pengenceran setiap reaksi transformasi
yang berlapis untuk menentukan tingkat transformasi. piring ini digunakan juga untuk
pengendalian kualitas dengan koloni PCR menggunakan primer oligonukleotida
LMB3_Fw((CAGGAAACAGCTATGAC)) dan pIII_Rv (GTTAGCGTAACGATCTAA)
untuk memverifikasi ukuran insert. Koloni tergores dari piring agar-agar menggunakan 40
media mL 2 YT dan 5 mL secara langsung digunakan untuk persiapan plasmid midi
menggunakan Qiagen Maxi Kit. Hasil sisanya disimpan dalam 20% gliserol pada -80 °C
(Liem et.al., 2016).

Langkah kedua kloning termasuk pencernaan dari 5 mg pLABEL-VL sub-memori dan

2 ug produk VH_linker PCR menggunakan 10U NcoI dan 20U SalI (NEB, USA) pada 37
° C o / n. The pencernaan, ligations dan transformasi dilakukan seperti yang dijelaskan
untuk VL kloning dengan modifikasi berikut. Ligasi dilakukan dengan 270 produk VH
PCR ng. Setelah transformasi XL1-Blue MRF', o / n inkubasi pada 25 cm2 2 YT-GA piring
dan mengulang suspensi di 6 mL 2 media YT, hasil penyimpanan di gliserol masing-
masing dibuat dan disimpan pada -80 ° C (Liem et.al., 2016).

b. Proses Biopanning

10 ug rHlyE dilapisi ke permukaan setiap sumur dari penyerapan protein tinggi pada
Costar microtiter piring. Setelah menyala, inkubasi pada 4 °C, sumur dicuci tiga kali
dengan fosfat buffered saline (PBS, pH7.4) mengandung 0,1% (v / v) dan diblokir dengan
300 uL PTM memblokir penyangga (2% susu skim di PBS-T) selama 2 jam dengan
pengadukan lembut. Pada saat yang sama, antibodi memori phage adalah pra-diblokir
dengan PTM penyangga. Kemudian, sumur dicuci dengan PBS-T selama tiga kali. Sekitar
1010 cfu dari memori phage digunakan untuk biopanning. Setelah 2 jam inkubasi dengan
700 rpm agitasi, sumur dicuci dengan 300 uL PBS-T tiga kali dengan penambahan sebesar
tiga langkah mencuci untuk putaran berikutnya biopanning. fag terikat dielusi dengan
menggunakan 100 uL Trypsin (10 ug / mL dalam PBS) selama 30 menit pada 37 °C. Phage
yang dielusi diselamatkan oleh infeksi sebuah TG1 budaya tumbuh secara eksponensial
(OD600 0,5) dan phage titer ditentukan dengan pengenceran serial. 20 uL 10X ampisilin
(konsentrasi akhir 100 mg / mL) dan glukosa (konsentrasi akhir 2%) kemudian
ditambahkan dan diinkubasi (37 ° C, 900 rpm). Sebuah total volume 10-uL kultur bakteri
phagemid-bantalan diinokulasi di 200 uL 2 YT kaldu yang mengandung ampicilin dan
selanjutnya berkembang selama 2,5 jam pada 37 ° C dan 900 rpm. Kemudian, sel-sel
koinfeksi dengan pembantu phage, M13KO7 selama 30 menit pada 37 ° C, statis. Kemasan
dan amplifikasi phage diperkaya berturut-turut dilakukan oleh kultur sel (30 ° C, 900 rpm)
dengan ampicilin dan kanamisin sebanyak 60 ug / mL. Kemudian hasil kultur
disentrifugasi dan supernatan yang mengandung phage dikumpulkan untuk putaran
berikutnya biopanning (Frenzel et.al., 2014).
c. Pembacaan Phage Antibodi Poliklonal oleh ELISA

Untuk tiga putaran biopanning, 3 sumur dari lempeng EIA / RIA dilapisi dengan 100
uL rHlyE (10 ug) di PBS penyangga. Keesokan harinya, piring dicuci tiga kali dengan
PBS-T dan diblokir dengan 300 uL PTM selama 2 jam dengan rotary. Untuk 3 sumur
lainnya dilapisi dengan 300 uL PTM merangkap sebagai kontrol latar belakang.
Memperkaya phage dengan mengencerkan dalam volume yang sama dengan PTM untuk
volume akhir 100 uL sebelum menambahkan 50 uL untuk setiap sampel dan kontrol
sumur. Plate diinkubasi selama 2 jam dengan gemetar dan dicuci tiga kali dengan PBS-T.
150 uL anti-M13 horseradish peroxidase (HRP) (1: 5000) di PTM penyangga ditambahkan
ke piring dan diinkubasi selama 2 jam dengan gemetar. Kemudian plate dicuci tiga kali
dengan PBS-T. Terakhir, 150 uL dari 2,2'-Azino-bis (asam 3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonat) garam diamonium (ABTS) (Amresco, USA) mengembangkan solusi
ditambahkan dan kiri untuk mengembangkan dalam gelap. absorbansi diukur pada
OD405nm dalam waktu 30 menit dengan lempeng pembaca (Liem et.al., 2016)

d. Pembacaan Phage Antibodi Monoklonal oleh ELISA

Partikel Phage dari biopanning babak sebelumnya dengan poliklonal tertinggi ELISA
pengayaan terinfeksi dengan budaya TG1 (OD600~0,5) pada 37 ° C selama 30 menit dan
berlapis atas 2 YT agar piring dengan ampisilin. Sebanyak 91 koloni tunggal dijemput dan
tumbuh di 2 YT + 2% glukosa + ampicilin pada 37 ° C, 900 rpm o / n di bawah 96 piring
budaya baik bulat. Di plate sumur posisi H3, H6, H9 dan H12 dibiarkan kosong sebagai
kontrol negatif sementara posisi A12 adalah berbudaya dengan clone dikenal (anti-EGFP
scFv antibodi monoklonal) sebagai kontrol positif. Keesokan harinya, 10 uL hasil kultur
diinokulasi di 190 uL 2 YT + 2% glukosa + ampicilin pada 37 ° C, 900 rpm selama 2,5
jam. 20 uL M13KO7 phage helper (~109) ditambahkan dan diinkubasi pada 37 °C selama
30 menit. Kemudian, budaya disaring menggunakan multiscreen 96-baik plat filter dengan
sentrifugasi pada 563 × g selama 5 menit. Filtrat dikumpulkan dalam piring bawah
mikrotiter bulat dan dibuang. Pelet sel diresuspensi dalam 220 uL 2 YT + 0,1% glukosa +
ampicilin + kanamisin dan diinkubasi pada 30 °C, 900 rpm. Keesokan harinya, budaya
disaring di 563 × g selama 5 menit dan fag partikel dikumpulkan sebagai filtrat dan
kemudian digunakan untuk ELISA. Antibodi monoklonal fag ELISA dilakukan pada cara
yang sama (Liem et.al., 2016).
KESIMPULAN

Demam tifoid disebabkan oleh antigen protein Salmonella typhi. Pada antigen protein
Salmonella typhi terdapat toksin yang dapat menjadi faktor terkait virulensi yang dianggap
sebagai penyebab tifoid akut. Antigen protein tersebut adalah HlyE, PilL, CdtB, Vi SifA,
FliC, GroEL, dan OmpC. Dalam mengidentifikasi keseluruhan antigen protein tersebut
dapat menggunakan metode imunosensor yang memiliki sensitivitas dan spesifisitan
tinggi, metode tersebut antara lain yaitu dengan metode array dan metode biopanning.

DAFTAR PUSTAKA

Bee Nar Lim, Chai Fung Chin, Yee Siew Choong, Asma Ismal & Theam Soon Lim. 2016.
Generation of naive human single chain variable fragment (scFv) library for the
identification of monoclonal scFv against Salmonella Typhi Hemolysin E antigen.
Elsevier. Toxin 117, 94-101.

Frenzel, A., Kügler, J., Wilke, S., Schirrmann, T., Hust, M., 2014. Construction of human
antibody gene libraries and selection of antibodies by phage display. In: Steinitz, M.
(Ed.), Human Monoclonal Antibodies. Humana Press, Totowa, pp. 215e243.

Leili Aghebati-Maleki, Babak Bakhshinejad, Behzad Baradaran, Morteza Motallebnezhad, Ali

Aghebati-Maleki, Hamid Nickho, Mehdi Yousefi & Jafar Majidi. 2016. Phage display
as a promosing approach for vaccine development. Ministry of Science and Technology.
Journal of Medical Science, 23:66.

Li Liang, Silvia J, Tran Vu T, Sarah D, Rie N, D.Huw, Stephan M, Stephen B & Philip L. 2013
Immuno profiling with a Salmonella typhi antigen microarray identifies new diagnostic
biomarkers of human typhoid. Scientific Reports, 3 : 1043.

Nasrodin. 2011. Penyakit Infeksi di Indonesia Solusi Kini & Mendatang. Surabaya. Airlangga
Univeristy Press: 3 : 191.

Nga Tran V, Tan Trinh V, Anh Tran T, Elizabeth J, Chay Nguyen N, Phat Voong V, Duy Pham
T, Thanh Ho N, Trung Pham Duc, Pinky Langat, Laura B, Jorge Galan. 2017. An
evaluation of purivied Salmonella typhi protein antigens for the serological doagnosis of
acute typhoid fever. Elsevier. Journal of infection 75: 104-114.
Rosangela Salerno –Goncalves, Herve Tettelin, David Lou, Stephanie Steiner, Tasmia
Rezwanul, Qin Guo, William D. Picking, Vishvanath Nene & Marcelo B. Sztein. 2017.
Use of a novel antigen expressing system to study the Salmonella enterica serovar Typhi
protein recognition by T cells. Amerika. PLOS Neglected Tropical Disease.

Shue-Kee E, Priya P, Nurul-Syakima AM, Hooi-Leng S, Kok-Gan & Learn-Han L. 2015.

Salmonella: A review on pathogenesis, epidemiology and antibiotic resistence. Taylor&
Francis. Frontiers in Life Science, 8:3, 284-293.

Ying Zhang, Xiaodan Chong, Lin Xia, Renfei Lu, George Osei-Adjei, Yiquan Zhang, Xinxiang
Huang. 2018. OxyR positively and directly regulates Vi polysaccharide capsular antigen
in Salmonella enterica serovoar Typhi. Elsevier. Microbial Pathogenesis 124:191-197.