BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri merupakan salah satu mikroorganismi yang berukuran mikroskopis atau

sangat kecil. Bakteri juga memiliki morfologi, struktur, dan sifat tersendiri, di karenakan
bakteri berukuran sangat kecil dan hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan
air. Hali ini yang menyebabkan bakteri sulit untuk diamati dalam keadaan hidup.

Untuk mengatasi hal tersebut itu dilakukan pengecatan pada bakteri agar dapat
membantu memudahkan dalam mengamati bakteri. Cara pengecatan atau pewarnaan
merupakan salah satu cara atau metode yang sering dilakukan sat penelitian-penelitian
mikrobiologi.

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah
dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak
digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi
sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram
adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans (Christian gram 1884)

Oleh karena itu Praktikum ini dilator belakangi untuk mengetahui dan mempelajari
teknik-teknik pewarnaan pada bakteri sehingga dapat mempermudah dalam melihat dan
mengamati morfologi, struktur bakteri.

1.2 Tujuan

Mahasiswa dapat melakukan pengecatan sederhana pada bakteri

 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran
inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan spiral,
serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi, dari air, tanah,
udara, hingga dalam tubuhhewan, (Betsy dan Keogh. 2005)

Isolat bakteri yang diperoleh diamati morfologi koloni dengan melihat bentuk
koloni, warna, tepian dan elevasi pada medium agar lempeng, agar tegak dan agar miring.
Sedangkan morfologi sel ditentukan dengan melihat olesan biakan yang sudah diwarnai
dibawah mikroskop dan melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram, dan kemampuan
membentuk spora dari bakteri tersebut (Pelczar dan Chan, 2006). ) Bakteri umumnya tidak
memiliki pigmensehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak
kontrasdengan medium dimana mereka hidup.

Oleh karena itu, perlu dilakukanpewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan
mikroskop (Harleydan Presscot, 2002). Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan
langsungdengan pewarnaan basa, pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif
danpewarnaan gram (Dwidjoseputro, 2003). Pewarnaan basa adalah pewarnaanyang langsung
mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yangtidak langsung mewarnai
bakteri, melainkan mewarnai latar belakang preparatbakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan
dengan menggunakan pewarna yangbersifat asam seperti nigrosin atau tinta cina (Harley dan
Presscot, 2002).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri
dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam
metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram.
Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai
serangkaian larutan pewarna atau reagen (Umsl, 2008).

Sel bakteri dapat diamati dengan jelas jika menggunakan mikroskop dengan
perbesaran 100 x 10 yang ditambah minyak emersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan,
sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan
menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan
membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat
warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan
dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif.Sebaliknya pada
zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat
warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan pada
permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain cristal violet, methylen blue, safranin, Base
Fuchsin, Malachite Green, dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll .

Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu:
Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan
demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna
pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air
fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif
ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan
komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal
yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki
bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada
Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan
dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding
sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar
dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan
pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram
negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih
sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap
masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol.
Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding
selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh
kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol.
Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi
tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut
demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme.
Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini
memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus,
vibrio, basillus, dan sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang
diwarnai (Mega, 2013).

pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan (Dwidjoseputro, 1994).
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen
biru dan air fuchsin (Dwidjoseputro, 1994).
 b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan tinta cina(Dwidjoseputro, 1994).
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

a) Biakan murni Bacillus subtilis dalam nutrient cair umur 24 jam
b) Biakan murni Echercia coli dalam nutrien cair umur 24 jam
c) Cat sederhana Aiechl Nielson’s Cabol Fuchsin atau Hucheros Crystal Violet
d) Gelas benda 2 buah

3.2 Cara Kerja

a) Ambil secara aseptis dengan jarum ose suspensi bakteri B.Subtilis dari biakan murni dan
diratakan diatas gelas benda yang bersih seluas ± 1cm²
b) Keringkan diudara
c) Setelah kering,preparat difiksasi dengan cara melakukan diatas api lampu spiritus (6-7
kali)
d) Setelah dingin maka noda diatas gelas ditetesi dengan cat sederhana 1-2 tetes biarkan 1-
2 menit
e) Cuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa cat tercuci bersih
f) Keringkan diudara
g) Lihat dibawah mikroskop dengan menggunakan perbesaran kuat dengan minyak inersi
h) Ulang cara kerja seperti diatas dengan memakai biakan murni dari Echercia coli
i) Gambar apa yang terlihat.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Bacillus subtillis Echercia coli

4.2 Pembahasan

Pada acara pengecatan bakteri secara sederhana ini menggunakan bakteri Bacillus
subtilis dan Echercia coli yang akan diamati. Sebelum memulai mengamati bakteri tersebut,
praktikan diharuskan untuk membuat preparat oles sesuai dengan langkah-langkah praktikum.

setelah selesai pembuatan preparat oles selesai, dilanjutkan dengan proses pewaraan
atau pengecatan pada bakteri yang bertujuan mewarnai seluruh sel bakteri sehingga bentuk
seluler dan struktur dasar bakteri Bacillus subtilis dan Echercia coli dapat terilihat.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif
menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.

Pada umumnya sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan,
sedangkan sebaliknya sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk dilunturkan.
Sifat cepat dan lambatnya cara pelunturan inilah yang diperbedakan untuk membedakan
kelompok mikroba setelah diberi pewarnaan.
 Dari hasil praktikum acara pewarnaan gram, dapat diketahui bahwa Bacillus
subtillis digolongkan ke dalam Gram Positif sedangkan bakteri Eschericia coli digolongkan
ke dalam Gram Negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna
methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan
peptidoglikan yang tebal, sedangkan Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini
mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
Gram negatif, alkohol akan merusak lipopolisakarida. Kompleks kristal ungu-iodin
yang pada dinding sel bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak
transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin.
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri jenis
Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram
positif.
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Hasil dari praktikum yang telah dilakukan adalah sebagai berikut:

. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan

diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal,
pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk

membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan
untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda
dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.

Bakteri Bacillus subtilis merupakan bakteri gram positif yaitu bakteri yang
mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini
mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebalselain itu bakteri Bacillus sp. merupakan bakteri
berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif. Bakteri Echercia coli
merupakan bakteri gram negatif yaitu bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene
blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
 DAFTAR PUSTAKA

Betsy dan Keogh, 2005 , Microbiology Demystified Jilid II , USA, Mc Graw-Hill

Publisher
Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta. Djambatan

Pelczar, Michael dan E.C.S.Chan. (2006). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit

UI-Press.
Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.

Umsl, 2008, StainingBacteria, www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf, diakses

Sabtu, 17 November 2017 Pukul 20.00