BIOTEKNOLOGI

ISOLASI DAN PURIFIKASI PROTEIN

ISOLASI, PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI STRUKTUR SEKUNDER DARI
PROTEIN ANTIBEKU DARI AMMOPIPTANTHUS MONGO- LICUS

OLEH :

NAMA : VIVI NOVITALIA

NIM : F201501137
KELAS : D3 FARMASI

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

STIKES MANADALA WALUYA
KENDARI
2019
1. Judul
Isolasi, Pemurnian Dan Karakterisasi Struktur Sekunder Dari Protein Antibeku Dari
Ammopiptanthus Mongo- Licus
2. Metode kerja
a. Isolasi Protein Antibeku.
Daun A. mongolicus dihomogenisasi dalam buffer ekstrak (25 mmol/L Tris-HCl,
pH 7,4, 100 mmol/L KCl, 0,1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L phenylmethyl-sulfonyl
fluoride (PMSF)). Homogenat disaring melalui kain keju untuk menghilangkan puing-
puing, dan disentrifugasi pada 4°C selama 30 menit pada 20000g. Supernatan dari
sentrifugasi dimasukkan ke kolom DEAE selulosa 52 yang diseimbangkan
menggunakan buffer (5 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 mol/L KCl, 0,1 mmol/L EDTA).
Protein-protein diuraikan dengan gradien KCl termasuk 0,1-0,3 mol/L, 0,3 mol/L, 0,3-
0,6 mol/L, 0,6 mol/L dan 1,0 mol/L KCl. Eluat dimonitor dengan absorpsi pada 280
nm, dan fraksi puncak dikonsentrasikan oleh super filter dan dikeringkan dengan
lyophilization dan dilarutkan kembali dalam air suling. Kemudian larutan sampel
dimasukkan ke dalam kolom Sephacryl 300 yang dikembangkan dalam 50 mmol/L
NH4HCO3. Eluat dipantau dengan penyerapan pada 280 nm, puncak terkonsentrasi dan
dihilangkan garam seperti di atas.
b. Perlakuan Panas.
Tiap protein dilarutkan dalam 25 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L KCl, 0,1
mmol/L EDTA. Solusinya disimpan dalam air mendidih selama 10 menit dan kemudian
didinginkan dengan cepat dalam air es. Sampel disentrifugasi. Supernatan dari
sentrifugasi dihilangkan oleh Microcon-10 (AMICON Co.).
c. Isotachoforesis Preparatif
Peralatannya adalah Model 491 Prep Cell dari Bio-Rad Lab. HALAMAN: 3% T,
2,67% C; elektrolit terkemuka: 5 mmol/L Tris-HAc, pH 8,5; terminasi elektrolit: 33
mmol/L Glycine, 4 mmol/L Tris-HCl, pH 8,5; buffer sampel: amphaline, pH 7-10,
tegangan lari: 500 V, waktu berlari: 7 jam. Koleksi: 2 mL/10 mnt/tabung.
d. Uji Aktivitas Antibeku
Setiap sampel diuji untuk aktivitas antibeku menggunakan teknik perbedaan titik
leleh titik beku yang dikembangkan oleh DeVries[10] dihilangkan garamnya dan
diferensial pemindaian kalometer (DSC)
e. Pengukuran berat molekul AFP.
 SDS-PAGE (12,5% akrilamida) dan pewarnaan perak dilakukan sebagai kriteria
kemurnian.
f. Analisis Circular dichroism (CD) dari AFP.
CD spektroskopi dibuat oleh larimeter Jasca, J-500 spectropo- dengan sel kuarsa 0,2 cm
panjang jalur pada 15°C.Analisis karakterisasi struktural sekunder diselesaikan dengan
Convex Constraint Analysis (CCA) menggunakan rata-rata berat residu
3. Hasil
Isolasi dan pemurnian ekstrak dari daun A. mongolicus dicapai sebagai berikut.
Supernatan ekstrak dikromatografi pada kolom penukar ion DEAE selulosa 52. Fraksi dari
tabung 156-210 yang diperoleh dari DEAE selulosa 52 columm kemudian disaring gel
pada kolom Sephacryl 300 dan dielusi dengan 50 mmol/L NH4HCO3. sampel dari
Sephacryl 300 adalah 0,25 ℃ pada 10 mg/mL menggunakan teknik perbedaan FP-MP
Fraksi protein dengan THA dari Sephacryl 300 diuraikan kembali dalam 25 mmol/L
Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L KCl, 0,1 mmol/L EDTA, disimpan dalam air mendidih
selama 10 menit dan kemudian didinginkan dengan cepat dalam air es . Supernatan dari
sentrifugasi telah dihilangkan oleh Microcon -10 (AMICON Co.).
Pemurnian lebih lanjut dibuat dengan preparatif isotokoforesis. THA AFP yang
dimurnikan dari tabung 13 adalah 0,35° C pada larutan berair 5 mg/mL menggunakan
metode DSC.
SDS-PAGE fraksi dengan aktivitas antibeku dilakukan dan menunjukkan pita
tunggal dengan pewarnaan perak (gbr. 3), berat molekul fraksi protein ini sekitar 50 ku.
Karakterisasi struktural sekunder AFP telah dipelajari oleh dichroism melingkar
(CD) (gbr. 4). Satu-satunya pita CD negatif dari 190 nm dengan puncak -5,3 m ° pada
198,5 nm, terletak di wilayah karakteristik α-helix (208 dan 222 nm), β-sheet (215-218
nm) dan koil acak (194 —198 nm). Band ini kemungkinan timbul dari superposisi dari
tiga jenis struktural. Di daerah ultraviolet dekat (250-300 nm), kurva CD hampir rata tanpa
pita positif atau negatif, menunjukkan bahwa tidak ada residu asam amino aromatik yang
terletak secara asimetris dalam struktur sekunder AFP dari A. mongolicus.
Analisis lebih lanjut, ditunjukkan pada gambar. 5, untuk wilayah ultraviolet jauh
(195-240 nm), yang berisi informasi struktur "kerangka" untuk protein, dilengkapi dengan
analisis kendala cembung (CCA). Pita CD yang dihasilkan dipecah menjadi lima pita CD
dari struktur sekunder tunggal. Struktur sekunder campuran 11% α-helix, 34% antiparalel
β-sheet dan 55% koil acak untuk protein beku dari A. mongolicus disimpulkan.
4. Kesimpulan
Protein antibeku (AFP) dari daun Ammopiptanthus mongolicus diisolasi dan
dimurnikan dengan DEAE selulosa 52, Sephacryl 300, perlakuan panas dan preparatif
isotachophoresis. Berat molekul AFP adalah 50 ku dengan pengukuran SDS-PAGE.
Aktivitas histeresis termal rata-rata (THA) dari AFP adalah 0,35 ℃ pada 5 mg/mL
menggunakan kalorimeter pemindaian diferensial (DSC). AFP ini menunjukkan stabilitas
yang memanas. Dari dichroism melingkar (CD) data spektral AFP dari 195-240 nm,
struktur sekunder yang terdefinisi dengan baik dari 11% α-helix, 34% antiparalel β-sheet
dan 55% koil acak untuk tanaman AFP disimpulkan.