Resume artikel “Exploring antibiotic resistance genes and metal resistance genes in plasmid

metagenomes from wastewater treatment plants”

Alfarizky Aryonugroho/kelas D/165040200111090

Plasmid bekerja sebagai elemen genetik mandiri dalam microorganisme. Plasmid dapat memberikan inangnya
fungsi penting seperti ketahanan antibiotik dan ketahanan terhadap kandungan besi tinggi. Dalam penelitian ini,
enam kumpulan metagenomik dibangun dengan DNA plasmid yang diambil dari endapan tanaman pengolah air
limbah. Metagenom plasmid juga mengandung banyak gen yang terkait dengan ketahanan, seperti gen ketahanan
antibiotik dan gen ketahanan besi. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa plasmid dalam tanaman pengolah
limbah dapat menjadi tempat penyimpanan gen ketahanan dan dapat berperan penting dalam pemindahan gen ini.

Plasmid disebut sebagai elemen yang dapat dipindahkan, plasmid biasa berperan sebagai elemen pewaris
tambahan pada kromosom. Secara fisik plasmid terpisah dari kromosom DNA dan dapat mereplikasi dirinya sendiri
didalam sel. Transformasi dan perbanyakan dari plasmid berperan penting dalam perombakan dan transfer materi
genetik. Pada awal kultur murni dapat dianalisa bahwa berbagai macam prokariot dapat beradaptasi secara cepat
dengan lingkungannya melalui distribusi gen antar spesies yang dibantu oleh plasmid. Namun pemahaman tentang
mekanisme plasmid dalam mentransfer gen masih terbatas sampai analisa beberapa model organisme karena
kebanyakan dari organisme tidak dapat di kultur dalam laboratorium. Akan tetapi, beberapa penelitian sekarang
sudah berhasil dalam mengkarakterisasi keanekaragaman genetik dari metagenom plasmid dengan menggunakan
kultur independen dengan pendekatan metagenom.

Tanaman pengolah limbah dianggap sebagai tempat penyimpanan untuk beberapa tipe dari gen ketahanan
antibiotik. Maka dari itu, kumpulan microbia yang terdapat pada tanaman pengolah limbah dijadikan model sistem
untuk mengeksplor berbagai macam plasmid yang membawa gen dengan fungsi penting untuk inangnya seperti
ketehanan antibiotik dan ketahanan kandungan besi tinggi. Dalam beberapa penelitian belakangan ini beragam
plasmid yang mengandung gen tersebut di isolasi dari mikroorganisme dalam tanaman pengolah limbah, penelitian
ini menunjukkan bahwa kumpulan mikroorganisme ini mengandung banyak jenis plasmid.

Secara tradisional plasmid di isolasi dengan metode PCR, yang mana sangat memakan waktu dan biaya. Selain
itu para peneliti juga menemukan beberapa halangan dalam mengisolasi plasmid seperti beberapa jenis plasmid tidak
dapat direplikasi dalam inang laboratorium dan plasmid tanpa gen marker pilihan akan sulit untuk diambil. Maka
dari itu high-throughput sequencing menyediakan lebih banyak data dibandingkan metode tradisional dan lebih
layak digunakan untuk mengamati metagenome plasmid.

Dalam penelitian kali ini digunakan 6 sampel dari daerah berbeda seperti tanaman pengolah limbah Shatin yang
mengolah 230.000 m3 limbah dan tanaman pengolah limbah Shek Wu Hui yang mengolah 93.000 m3 limbah.
Keenam sampel kemudian dipindah ke laboratorium dalam 1 jam dan langsung digunakan untuk ekstraksi plasmid
DNA. Plasmid DNA di ekstrak mengunakan lisis alkali dengan alat QIAGEN Plasmid Mini Kit. Setelah
mengendapkan protein dan sebagian besar kromosom DNA, plasmid yang telah diekstrak dimurnikan dan
dibersihkan. Kemudian plasmid DNA diambil dengan pengendapan menggunakan isopropanol dan dicuci
menggunakan 70% etanol. Setelah inkubasi semalam pada suhu 37℃, sistem pencernaan di inaktifkan dengan cara
dipanaskan selama 30 menit pada suhu 70℃ dan secara bertahap didinginkan dengan es. Plasmid DNA yang telah
diendapkan dengan 3M sodium asetat kemudian dicuci dengan 70% etanol untuk pemurnian. Tiap 5μg plasmid DNA
yang telah diekstrak kemudian diurutkan menggunakan high-throughput sequencing dengan alat Illumina Hiseq
2000.

Diperkirakan sebanyak 3 Gb dari urutan metagenomik dihasilkan dari tiap sampel plasmid DNA. Untuk
memahami perbedaan antara plasmid DNA dan total DNA dalanm satu tipe sampel yang sama, empat set data
metagenomik dari total DNA yang diekstrak dari keenam sampel diambil dari penelitian sebelumnya. Untuk
mengeksplor peran plasmid pada inangnya, didalam penelitian ini dipilih gen yang berhubungan dengan mekanisme
ketahanan untuk analisis lebih jauh. Dibandingkan dengan metagenom DNA, metagenom plasmid lebih kaya dalam
jumlah gen yang berhubungan dengan mekanisme ketahanan.

Penelitian kali ini berhasil menggunakan data metagenomik untuk menggambarkan metagenom plasmid yang
diekstrak dari sampel. Dengan membandingkan total metagenom DNA yang diekstrak dari penelitian sebelumnya,
metagenom plasmid dapat dibedakan dari total metagenom DNA. Berdasarkan analisis MG-RAST jumlah
metagenom plasmid lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah total metagenom DNA. Selain itu untuk gen pembawa
mekanisme ketahanan, termasuk gen ketahanan antibiotik, banyak terkandung dalam metagenom plasmid. Hal ini
menunjukkan bahwa gen ketahanan antibiotik. Dari penelitian ini juga ditemukan bahwa DNA yang diekstrak dari
sampel yang mengandung bakteri feses manusia memiliki jumlah lebih besar dibandingkan jumlah DNA dari sampel
endapan aktif dan endapam pencernaan.

Dari penelitian ini didapat hasil bahwa lima metagenom plasmid yang membawa gen tahan antibiotik dipilih
dari sampel STIN dan SWHAS. Selain itu plasmid dari endapan pencernaan memiliki kelimpahan plasmid yang
lebih rendah dari endapan aktif. Plasmid SWHAS, yang membawa baik gen tahan antibiotik dan gen tahan besi,
hanya ditemukan pada endapan aktif, hal ini mengindikasikan bahwa ion antibiotik dan besi akan terakumulasikan
pada kondisi lingkungan tertentu.

Beberapa tipe dari gen tahan antibiotik yang tahan terhadap tetracyline, quinolone dan betalactam banyak
ditemukan pada metagenom plasmid. Dari seluruh gen tahan antibiotik yang terdeteksi, gen tahan tetracyline paling
banyak ditemukan dalam sampel plasmid, sehingga gen tetracyline banyak digunakan dalam pengobatan manusia
dan industri perkembang biakkan hewan. Untuk gen tahan besi, pada metagenom plasmid banyak ditemukan gen
tahan tembaga dan arsenik, terutama pada sampel Shek Wu Hui. Hal ini menyebabkan gen tahan tembaga dan
arsenik banyak digunakan dalam antibiotik heawan ternak.

Plasmid pembawa gen tahan antibiotik dan gen tahan besi telah diteleti selama beberapa dekade. Namun,
banyak plasmid, umumnya yang berhubungan dengan gen tahan antibiotik, sulit untuk di isolasi menggunakan
metode dalam laboratorium. Salah satu alasannya adalah karena banyak plasmid akan menjadi beban berat dalam
metabolisme inangnya dan mudah hilang ketika mikroorganisme melakukan reproduksi. Oleh karena itu, plasmid
kecil memiliki peran penting dalam membantu untuk pengkodean sehingga perlu untuk dipertahankakn. Selain itu
plasmid dengan ukuran kecil akan dengan mudah mengganda lebih banyak dibandingkan dengan plasmid berukuran
lebih besar. Tantangan lainnya dalam mengisolasi plasmid DNA adalah ketika telah mendapat biomassa dari
beberapa sampel, peneliti menggunakan QIAGEN Plasmid Mini Kit untuk melakukan ekstraksi plasmid dan
ATP-dependent Plasmid Safe DNase untuk menghilangkan residu kromosom DNA. Prosedur ini akan
menghilangkan plasmid sebanyak lebih dari 150 kb. Penyusunan juga dapat menjadi faktor yang perlu diperhatikan
dalam mengambil plasmid dari data metagenom. Beberapa software dievaluasi dalam penelitian ini, CLC bio
Genomics Workbench akhirnya terpilih menjadi software yang dianjurkan dalam penelitian mengenai plasmid. Hasil
ini menunjukkan bahwa pembacaan dan pengaturan dasar akan mempengaruhi hasil penyusunan plasmid.

Dengan alur yang telah dijelaskan dalam artikel ini, peneliti berhasil mendapatkan metagenom plasmid dari tiga
endapan tanaman pengolah limbah. Untuk mengekstrak plasmid, metode tradisional seperti menggunakan alkali
lysis yang dikombinasi dengan perlakuan asam phenol-chloroform. Dalam penelitian ini alkalin lysis digunakan
bersama dengan penjernihan menggunakan resin diikuti dengan perlakuan ATP-dependent Plasmid Safe DNase.
Ekstraksi plasmid menggunakan metode tradisional sangat memakan waktu, kurang lebih 48 jam, sedangkan metode
ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini hanya membutuhkan waktu 8 jam. Dengan menggunakan
high-throughput sequencing, penjabaran metagenom plasmid akan lebih detail dari 6 mikrobia berbeda dan
mendapatkan sejumlah plasmid potensial dengan gen tahan penting. Analisis metagenomik juga menyediakan
spektrum yang jelas dari berbagai tipe gen tahan antibiotik dan gen tahan besi yang terdapat pada metagenom
plasmid dari tanaman pengolah limbah.