Dosen Pengampu:
Prof. Drs. Bambang Kuswandi, MSc, PhD
Disusun Oleh:
Kris Nugraheni (162210101012)
BIOANALISIS
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2019
ABSTRAK
Tujuan: lipid seperti prostaglandin, leukotrien, dan tromboksan dilepaskan sebagai mediator inflamasi
pada nyeri (SSP dan SST).
Metode dan Hasil: Untuk mengukur lipid ini sebagai biomarker mekanistik potensial dalam model
nyeri neuropatik, kami mengembangkan metode berbasis LC-MS/MS dengan hasil yang lebih tinggi
dengan deteksi simultan PGE2, PGD2, PGF2α, LTB4, TXB2 dan 2-arachidonoyl gliserol di jaringan
otak dan sumsum tulang belakang. Kami juga menunjukkan bahwa metode LC-MS/MS lebih sensitif
dan spesifik dalam membedakan level PGE2 dalam jaringan CNS dibandingkan dengan ELISA.
Kesimpulan: Kemampuan untuk memodifikasi metode LC-MS/MS untuk mengakomodasi banyak
lipid lain dalam satu analisis, menunjukkan bahwa metode yang disajikan menawarkan alternatif
hemat biaya dan lebih sensitif terhadap metode ELISA yang berguna dalam pengaturan penemuan
obat.
Abstrak: Pada manusia, lipid menjalankan berbagai fungsi seperti produksi dan penyimpanan energi,
isolasi, pencernaan dan penyerapan dan produksi hormon. Dari beberapa lipid, prostaglandin,
tromboxan, dan leukotrien memainkan peran penting dalam penyakit kardiovaskular, reaksi alergi, dan
peradangan. Dengan demikian, penting untuk memantau level mereka sebagai biomarker mekanis
potensial untuk secara efektif mendiagnosis dan mengobati penyakit yang mendasarinya. Kami telah
berhasil menggunakan metode spektrometri massa yang sangat spesifik dan hasil lebih tinggi untuk
mengukur lipid ini dalam sel-sel otak serta di jaringan otak dan sumsum tulang belakang dari tikus
(model nyeri) dan membandingkan data yang diperoleh dalam ELISA tradisional.
Pendahuluan
Inflamasi adalah mekanisme utama untuk respon imun terhadap infeksi mikroba. Beberapa
jalur inflamasi diyakini memainkan peran penting dalam patogenesis beberapa penyakit
neurodegeneratif seperti penyakit Alzheimer atau penyakit Parkinson serta penyakit sistem saraf tepi
seperti rheumatoid arthritis dan penyakit radang usus. Dalam inflamasi dan inflamasi saraf, fitur
umum termasuk sel-sel kekebalan yang diaktifkan seperti makrofag (hati) dan mikroglia (otak)
menginduksi enzim COX yang menghasilkan stres oksidatif serta produksi dan pelepasan sitokin dan
kemokin. Studi juga menunjukkan bahwa nyeri inflamasi dapat ditandai dengan pelepasan mediator
lipid dari jalur COX seperti endocannabinoid, prostaglandin (PG), tromboxan, leukotrien, diantara
yang lain dari sistem saraf perifer serta SSP seperti jaringan otak dan sumsum tulang belakang.
Prostaglandin seperti PGE2, PGD2, PGF2α dan Thromboxane B2 (TXB2) menunjukkan berbagai
fungsi fisiologis dan patofisiologis yang dimanifestasikan oleh rasa sakit, demam, dan reaksi alergi.
Data dari kedua studi praklinis dan klinis membuktikan temuan bahwa PGE2 memainkan peran
penting dalam memperburuk rasa sakit setelah pengobatan dengan rangsangan perifer atau sentral.
Meskipun sebagian besar molekul inflamasi ini memiliki waktu paruh yang sangat singkat dalam
plasma (kurang dari satu menit), mereka jauh lebih stabil di jaringan otak dan sumsum tulang belakang
yang memungkinkan kuantifikasi molekul utuh baik dalam matriks in vitro dan in vivo. Dengan
demikian tujuan pertama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode LC-MS/MS untuk
secara bersamaan mengukur lipid ini sebagai biomarker mekanistik potensial dalam model hewan
penyakit inflamasi dan menggunakan model nyeri neuropatik untuk mengevaluasi kelayakan. Tujuan
kedua adalah membandingkan metode LC-MS/MS dengan ELISA yang lebih umum digunakan.
Selama lebih dari dua dekade, ELISA telah secara rutin digunakan untuk mengukur protein
atau lipid dalam matriks in vitro dan in vivo. Meskipun perangkat ELISA yang tersedia secara
komersial telah sepenuhnya divalidasi untuk LOD, linearitas, spesifisitas atau reaktivitas silangnya,
ELISA memiliki beberapa kelemahan lain seperti spesifisitas antibodi terhadap masalah protein, biaya
dan stabilitas perangkatnya. Meskipun ELISA dapat mengukur lipid berkonsentrasi rendah dengan
preparasi sampel yang minimal, reaktivitas silang antara spesies isomer (PGE2, PGE1, PGD2, antara
lain, yang memiliki berat molekul yang sama tetapi konfigurasi struktur yang berbeda) tidak dapat
sepenuhnya dihilangkan sehingga mengarah ke tingkat positif palsu yang lebih tinggi dibandingkan
dengan analisis menggunakan LC-MS/MS. Dengan demikian salah satu tujuan dari penelitian ini
adalah untuk membandingkan hasil untuk PGE2 antara metode ELISA dan metode LC-MS/MS.
Beberapa metode analitik telah dikembangkan dan dipublikasikan dalam literatur untuk
kuantifikasi absolut lipid dalam matriks biologis. Ini termasuk aliran tradisional LC-MS/MS serta
nano-LC-MS/MS. Meskipun nano-LC-MS/MS menawarkan beberapa keuntungan seperti persyaratan
volume sampel yang sangat rendah, konsumsi pelarut fase gerak yang rendah dan sensitivitas yang
lebih tinggi, metode ini tidak umum digunakan karena kebutuhan untuk instrumentasi yang lebih
kompleks yang memerlukan investasi tambahan dan prosedur penanganan sampel yang
membosankan. Triple quadrupole LC-MS/MS adalah metode yang lebih disukai untuk mengukur
prostanoid, endocannabinoid dan metabolitnya. Sebuah penelitian baru-baru ini menggunakan SPE
(Solid Phase Extraction/ekstraksi fase padat) online sebagai prosedur pembersihan sampel cepat untuk
mengukur PGE2, PGD2 dan TXB2 dalam sistem pengujian in vitro yang berbeda untuk menentukan
efek inhibitor COX-2. Schmidt et al. memvalidasi metode LC-MS/MS untuk mengukur PGE2 dan
PGD2 dalam sampel mikrodialisis tikus dengan LLOQ masing-masing 25 pg / ml dan 50 pg / ml.
Demikian juga, PGE2 dan PGD2 diukur dengan menggunakan metode yang divalidasi dari Cao et al.,
dalam kultur sel A549 epitel paru manusia dan kultur sel RAW 264.7 makrofag tikus. Meskipun
penelitian baru-baru ini mengukur LTB4 dalam plasma manusia atau spesimen sputum, batas
kuantitasi mereka adalah 0,2 ng / ml dibandingkan dengan 0,078 ng / ml yang diamati dalam
penelitian kami. Meskipun prosedur ekstraksi cair-cair yang relatif sederhana digunakan dalam kedua
studi, SPE yang lebih kompleks juga telah digunakan untuk mengekstraksi lemak dari jaringan otak
yang membutuhkan pembersihan sampel yang luas. Dengan demikian, mempertimbangkan kebutuhan
untuk pengujian dengan kapasitas yang signifikan dalam fase penemuan obat, tujuan kami adalah
untuk mengembangkan metode LC-MS/MS dengan hasil yang lebih tinggi yang dapat diandalkan
untuk mengukur lipid ini dalam injeksi tunggal dengan pemulihan yang dapat diterima dan dapat
direproduksi.
Karena ada persyaratan yang kurang spesifik oleh FDA AS untuk memvalidasi metode
bioanalitik untuk kuantifikasi biomarker, data yang disajikan di sini menawarkan keuntungan besar
sebagai metode LC-MS/MS dengan hasil yang lebih tinggi yang cocok untuk tujuan mengukur lipid
dalam penemuan obat atau pengaturan pengembangan obat awal. Sepengetahuan kami, ini adalah studi
pertama yang memantau banyak lipid baik dalam polaritas positif dan negatif dalam injeksi tunggal
dalam waktu kurang dari 5 menit tanpa mengurangi sensitivitas. Kami juga menunjukkan kegunaan
metode kami untuk mengukur lipid dalam kultur mikroglia in vitro dan jaringan otak dan sumsum
tulang belakang tikus in vivo dan membandingkan hasilnya dengan metode ELISA standar yang
digunakan untuk PGE2 dari sampel in vitro. Kami juga ingin menyebutkan bahwa metode yang
disajikan juga dapat diterapkan untuk jenis sampel lain seperti plasma atau cairan serebrospinal untuk
mengukur lipid sebagai biomarker.
Metode
Reagen dan kimia
Standar referensi otentik untuk PGE2, PGD2, PGF2α, LTB4, TXB2 dan 2-AG dan analog
deuterasinya (PGE2-d4, PGD2-d4, LTB4-d4 dan TXB2-d4) diperoleh dari Cayman Chemical (MI,
USA) kecuali untuk 2-AG yang analog deuterasinya (2-AG-d8) diperoleh dari Abcam (MA, USA).
Larutan garam seimbang Hepes dan media Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) dibeli dari
Gibco, Life Technologies (NY, AS). Serum janin sapi (FBS/Fetus Bovine Serum) dan semua reagen
kultur sel lainnya diperoleh dari Atlanta Biologicals (GA, USA). LC-MS/MS grade asetonitril dan
metanol diperoleh dari Fisher Scientific (NJ, USA). Asam format diperoleh dari Sigma-Aldrich (MO,
USA). Air deionisasi diproduksi di rumah menggunakan sistem pemurnian air Milli-Q Gradient (MA,
USA).
Pengembangan metode: optimasi LC-MS/MS
Sistem LC-MS/MS terdiri dari spektrometer massa triple quadrupole yang dioperasikan dalam
mode pemantauan beberapa reaksi (TSQ Quantum, Thermo Scientific, CA, USA). ESI yang
dipanaskan dioperasikan dalam mode negatif untuk semua analit kecuali 2-AG, di mana mode ESI
positif yang digunakan. Spektrometer massa dioptimalkan untuk berbagai parameter yang berlaku
untuk semua analit. Tegangan semprot diatur pada 2000 kV dalam mode negatif dan 4500 kV dalam
mode positif, suhu alat penguap 450 ° C, waktu siklus 0,3 detik, suhu kapiler ditetapkan pada 325 ° C,
tekanan gas selubung dan tekanan gas AUX masing-masing diatur pada 40 dan 20 psi. Analit
dijalankan dalam mode pemindaian penuh untuk menentukan puncak ion molekulernya dan ionisasi
tumbukan teraktivasi dilakukan pada puncak ion molekuler dalam mode MS / MS. Lensa tabung dan
energi tumbukan dioptimalkan untuk setiap analit secara individual. Katup pengalihan digunakan
untuk memperoleh data antara menit 1 dan 4,6 untuk mengurangi saturasi yang tidak diinginkan dari
detektor. Puncak molekul ion dan ion fragmen, lensa tabung dan energi tumbukannya ditunjukkan
pada Tabel 1. Data diproses menggunakan perangkat lunak Xcalibur 3.0.63.
Pemisahan kromatografi dilakukan pada sistem Acquity UPLC dari Waters (MA, USA).
Analisis diselesaikan pada kolom Kinetex C18 (2,1 × 50 mm) dengan ukuran partikel internal 2,6 μm
(Phenomenex, CA, USA). Untuk mencapai waktu running yang lebih pendek, digunakan gradien
linier dengan asam format 0,1% dalam air Milli Q Gradient dan asam format 0,1% dalam asetonitril.
Untuk mencapai resolusi efisien, aliran LC ditetapkan pada 0,45 ml / menit dengan gradien berikut: 0–
3 menit 30% B, 3–3,65 menit 30–90% B, 3,65–4,8 menit 90% B, 4,8–5 menit 90–30% B. Total jangka
waktu adalah 5 menit. Volume injeksi sampel adalah 20 μl. Temperatur kolom diatur pada 20 ° C.
Preparasi Standar
Standar diperoleh sebagai 100 μg / ml atau 1 mg / ml larutan. Dari 1 μg / ml larutan stok kerja
disiapkan dalam asetonitril dan disimpan pada -80 ° C. Untuk sampel in vitro, kurva kalibrasi
dihasilkan dalam DMEM yang mengandung 2% FBS dari 0 hingga 10 ng / ml yang dibubuhi 10 ng /
ml analog deuterasi yang berfungsi sebagai standar internal (IS). Untuk sampel in vivo, supernatan
jernih (homogenat) jaringan otak kosong dan sumsum tulang belakang diencerkan sepuluh kali untuk
mengurangi tingkat lipid endogen dan kurva kalibrasi dihasilkan dari 0 hingga 10 ng / ml yang
mengandung 10 ng / ml IS yang dideuterasi.
Recovery, efek matriks & LOQ
Pemulihan analit dipantau dengan membandingkan respons area puncak yang diperoleh dari
standar rujukan dan sampel berduri deuterated analog (IS) sebelum ekstraksi dan pasca ekstraksi pada
konsentrasi 0,156, 1,25 dan 5,0 ng / ml dalam media DMEM untuk sampel in vitro. Karena adanya
lipid endogen di otak dan jaringan sumsum tulang belakang, pemulihan in vivo ditentukan dengan
spiking 0,2 dan 1,0 ng / ml IS yang dideuterasi untuk masing-masing analit di masing-masing
homogenat jaringan di otak dan sumsum tulang belakang. Efek matriks ditentukan dengan
membandingkan respons area puncak antara sampel setelah diekstraksi dan sampel rapi (disiapkan
dalam fase gerak). Linearitas ditentukan dengan memonitor respon area puncak dari 0 hingga 10 ng /
ml untuk sampel in vitro dan in vivo. LOD ditentukan sebagai rasio S / N 3: 1 dan LOQ didasarkan
pada S / N 10: 1 untuk semua analit.
Penilaian carry-over
Carry-over dari jarum injeksi dilakukan dengan menyuntikkan sampel kosong setelah standar
kalibrator tinggi (10 ng / ml). Luas puncak sampel kosong dibandingkan dengan luas puncak sampel
LOQ untuk setiap analit. Area puncak sampel kosong harus kurang dari 20% dari sampel LOQ untuk
menghindari pengambilan sampel.
Isolasi dan kultur mikroglia tikus primer
Kultur glial campuran primer disiapkan dari tikus Sprague-Dawley (Charles River, NY, USA)
yang berusia 3 hari seperti yang dijelaskan sebelumnya. Korteks serebral dihilangkan dari meninges
dan dicacah dalam larutan garam seimbang Hepes. Sel dipisahkan dalam media kultur lengkap. Media
kultur lengkap terdiri dari DMEM-GlutaMax yang mengandung 4,5 g / l D-Glukosa, 10% FBS
(Atlanta Biologicals, GA, USA) dan penisilin / streptomisin. Sel-sel dimasukkan ke dalam labu-labu
berisi 25 ml media kultur dengan kepadatan satu otak per labu T150 (BD Falcon, NY, USA). Sel
dipertahankan pada suhu 37 ° C dalam 5% CO2 atmosfer yang dilembabkan. Setelah 2 hari, labu
disadap dengan lembut untuk menghilangkan puing-puing sel, media dikeluarkan dan diganti dengan
media baru. Kultur ditanam selama 10–14 hari lalu mikroglia dipanen dengan mengetuk labu dan
mengumpulkan media yang mengandung mikroglia. Mikroglia dipelet dengan sentrifugasi (1100 rpm,
5 mnt), diresuspensi dalam media kultur dan disalut pada kepadatan yang diinginkan dalam plat poli-
d-lisinecoated (1 × 105 sel / 200 ml dalam 48-well plate) (Becton Dickinson BioCoat, MA , AS).
Kemurnian dinilai dengan memberi label pada pembuat mikroglial CD11b, yang mengidentifikasi
95% sel sebagai mikroglia.
Pemberian senyawa analgesik & Bz-ATP pada mikroglia diikuti oleh ELISA untuk kuantisasi
PGE2
Sumuran individu yang mengandung sel-sel mikroglial dilakukan pemberian 1 μM senyawa
analgesik Lundbeck, diikuti oleh Bz-ATP (diketahui menginduksi respons inflamasi) dari 0 hingga
500 μM hingga 30 menit dan sampel kemudian dikumpulkan dan disimpan untuk analisis PGE2 oleh
ELISA. Mikroglia ditanam dalam sumuran berlapis 48 poli-d-lisin dengan kepadatan 1 × 105 sel / 200
ml dalam media DMEM yang mengandung 10% FBS dan dikultur semalam. Hari berikutnya, media
diganti dengan DMEM yang mengandung 2% FBS. Sel diperlakukan dengan konsentrasi yang
berbeda dari senyawa analgesik Lundbeck (0-500 μM) selama 30 menit dan diikuti dengan pemberian
Bz-ATP pada konsentrasi akhir 300 μM. DMSO digunakan sebagai pengencer. Supernatan dipanen 30
menit setelah pemberian Bz-ATP dan diuji untuk sekresi PGE2. Level PGE2 dalam supernatan
ditentukan oleh kit EIA PGE2 (Cayman Chemical Co, MI, USA) sesuai dengan protokol pabrikan.
Preparasi sampel LC – MS / MS
Sampel In Vitro
Supernatan kultur sel mikroglial (90 μl) ditambahkan ke 10 μl campuran IS yang mengandung
100 ng / ml PGE2, PGD2, TXB2, LTB4, yang dideuterasi dan 2-AG yang dibuat dalam asetonitril.
Sampel adalah protein yang diendapkan dengan masing-masing 300 μl asetonitril dan etil asetat.
Setelah divortex singkat (∼30 detik), sampel disentrifugasi pada 3300 rpm selama 20 menit pada suhu
4 ° C. Supernatan dikumpulkan dalam plat bersih, dikeringkan di bawah gas N2 pada 40 ° C dan
dilarutkan dalam 125 μl 30% larutan asetonitril yang mengandung 0,01% asam format dalam air. Dua
puluh mikroliter disuntikkan ke kolom LC.
Preparasi perlakuan hewan dan sampel in vivo (otak & sumsum tulang belakang)
Kami menguji kegunaan metode LC-MS/MS kami dalam studi nyeri tikus pada model cedera
konstriksi kronis saraf skiatik menggunakan senyawa kesesuaian Lundbeck (10, 30 dan 100 mg / kg
pemberian oral) yang dikembangkan sebagai analgesik. Semua penelitian dilakukan secara ketat
dengan rekomendasi yang ditetapkan dalam Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan
Laboratorium (diterbitkan oleh NAP, 2011) dan Institusional Komite Perawatan dan Penggunaan
Hewan di Lundbeck Research, AS. Tikus Sprague Dawley jantan (Harlan Laboratories, TX, USA)
digunakan dalam penelitian ini. Hewan dibagi menjadi enam kelompok berbeda sepuluh hewan per
kelompok perlakuan: masing-masing saline, pembawa, gabapentin (100 mg / kg) dan senyawa
analgesik (10, 30 dan 100 mg / kg). Setelah diterima, tikus ditempatkan tiga per kandang di kandang
standar. Tikus diizinkan melakukan aklimatisasi hingga 1 minggu sebelum operasi. Semua tikus
diperiksa dan ditimbang sebelum memulai penelitian untuk memastikan kesehatan dan kesesuaian
yang memadai. Selama studi, siklus terang / gelap 12 jam dipertahankan. Suhu kamar dipertahankan
antara 20°C dan 23°C dengan kelembaban relatif dipertahankan sekitar 50%. Makanan dan air
diberikan ad libitum selama penelitian. Semua pengujian dilakukan selama fase siklus cahaya hewan.
Tikus ditaruh di satu tempat setelah operasi. Hanya segmen lumbar sumsum tulang belakang yang
digunakan dalam penelitian ini.
Setelah selesai mengakses keberadaan aktivitas analgesik, jaringan otak dan sumsum tulang
belakang dipanen (dalam 15 menit pengujian) dilanjutkan dengan eutanasia oleh inhalasi CO2. Sampel
disimpan pada -80°C. Otak dihomogenisasi dalam 3 × dan sumsum tulang belakang dalam 4 × w/v
dalam larutan buffer lisis MSD (MesoScale Discovery, MD, USA). Homogenat digunakan untuk
ekstraksi lipid seperti dijelaskan di atas (preparasi sampel in vitro).
Analisis Data
Untuk menentukan konsentrasi sampel yang tidak diketahui, rasio daerah puncak analit dan
daerah puncak IS (sumbu y) diplot terhadap konsentrasi (sumbu x) dan kurva kalibrasi untuk setiap
prostaglandin yang dihasilkan oleh analisis regresi kuadrat terkecil dengan 1/X2 sebagai faktor
pembobotan. Signifikansi statistik ditentukan oleh Student’s t-test dengan p <0,05 menggunakan
GraphPad Prism (6.0). Nilai-nilai disajikan sebagai rata-rata ± SD dan n = 4-5 sampel per kelompok
untuk pengujian in vitro dan n = 8-10 hewan untuk studi in vivo.
Meskipun hasil ini menunjukkan bahwa ELISA yang dapat digunakan sebagai alat skrining,
metode LC-MS/MS memberikan peningkatan spesifisitas, memungkinkan metode yang akan
digunakan tidak hanya sebagai alat skrining, tetapi alat konfirmasi dalam profil lipid untuk pendukung
biomarker yang potensial. Dalam studi ini, perbandingan ELISA dan LC-MS/MS hanya dibuat dengan
sampel in vitro sehubungan dengan PGE2. Namun, kami juga ingin menyelidiki kegunaan metode LC-
MS/MS untuk pemrofilan lipid in vivo menggunakan jaringan SSP (otak dan sumsum tulang
belakang). Sebagaimana terbukti dari data analitik yang dijelaskan secara lebih rinci dalam paragraf
berikutnya, metode ini memiliki kemampuan untuk mendeteksi beberapa lipid pada tingkat picomolar
rendah dalam jaringan SSP yang diperoleh dari hewan dengan nyeri yang diperantarai peradangan.
Dengan optimalisasi metode yang tepat, penulis merasa metode ini dapat diperpanjang dengan upaya
minimal untuk membuat profil analit lipid tambahan serta mengukur lipid dalam jaringan perifer
model inflamasi. Akan sulit untuk membuat metode multiplexing serbaguna menggunakan platform
ELISA, mengingat beberapa keterbatasan yang dibahas sebelumnya.