BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum ini digunakan untuk mengetahui
pada serapan berapa zat yang dibaca oleh spektrofotometer UV secara optimum
karena detektor KCKT yang digunakan untuk penelitian ini adalah detektor UV.
Pada penelitian ini, hasil scanning panjang gelombang maksimum atorvastatin
dalam fase gerak metanol-air pH 3 (80:20 v/v) dengan konsentrasi 100 µg/mL
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 200 – 400 nm
menunjukkan bahwa atorvastatin memiliki serapan maksimum pada 245 nm.
Berdasarkan penelitian Sawant et al., (2012), panjang gelombang maksimum
atorvastatin adalah 246 nm. Perbedaan panjang gelombang sebesar 1 nm masih
dalam batas toleransi yang diperkenankan menurut Depkes RI (1995), yaitu lebih
kurang 3 nm. Spektrum UV atorvastatin dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2. Spektrum UV atorvastatin dalam fase gerak metanol : air pH 3 (80:20, v/v)
dengan konsentrasi 100 µg/mL.

B. Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak

Parameter hasil optimasi kondisi KCKT yang diamati meliputi waktu
retensi (Rt), resolusi (Rs), tailling factor (TF), dan nilai lempeng teoritis (N) dari

23
 24

berbagai variasi komposisi dan kecepatan alir fase gerak. Prioritas pertama dalam
pemilihan perbandingan komposisi fase gerak adalah nilai resolusi yang dihasilkan
yaitu RS > 2. Nilai ini menunjukkan puncak yang dihasilkan terpisah sempurna
dengan puncak yang lain. Prioritas kedua adalah waktu retensi, semakin cepat maka
akan semakin baik karena menghemat waktu analisis. Prioritas ketiga adalah
tailling factor dari masing-masing puncak yang dihasilkan yaitu < 2 dan nilai N
yang dihasilkan > 2000.
Optimasi metode analisis atorvastatin dengan KCKT kondisi awal yaitu
kolom Cosmosil C18, ukuran partikel 5 µm, panjang kolom 150 mm dan diameter
dalam 4,6 mm, fase gerak campuran metanol-air pH 3, volume injeksi 20 µL,
detektor UV 245 nm, dan kecepatan alir fase gerak 1 mL/menit. Optimasi metode
analisis dilakukan dengan optimasi perbandingan komposisi fase gerak metanol-air
pH 3. Hasil optimasi komposisi fase gerak dapat dilihat pada tabel 2, sedangkan
kromatogram hasil optimasi perbandingan fase gerak metanol-air pH 3 dapat dilihat
pada lampiran 2.

Tabel 2. Hasil Optimasi Perbandingan Komposisi Fase Gerak Metanol-Air pH 3

Perbandingan Komposisi Fase Gerak Syarat

(Metanol-Air pH 3) (Snyder
Parameter
et al.,
70-30 75-25 80-20 85-15 90-10 2010)

Resolusi (Rs) 1,54 0,83 3,15 1,06 3,00 >2

Rt (menit) 6,24 4,98 3,91 3,25 2,72 ≤ 10
Tailing factor 1,60 0,89 0,90 0,75 1,20 <2
Jumlah lempeng 5784 5377 5184 4210 5980 > 2000
teoritis (N)

Dari hasil optimasi perbandingan komposisi fase gerak yang diperoleh,

dipilih perbandingan 80:20 karena menghasilkan nilai resolusi serta tailing factor
yang optimal dengan waktu retensi yang cukup cepat dibandingkan dengan
perbandingan komposisi fase gerak yang lain. Selain itu, nilai N yang dihasilkan
juga sudah memenuhi syarat yaitu >2000 (Snyder et al., 2010). Bila dilihat dari
 25

kromatogram pada lampiran 3, peak yang dihasilkan memberikan hasil yang baik
pula.
Selanjutnya, hasil dari optimasi perbandingan komposisi fase gerak yang
dipilih yaitu metanol-air pH 3 (80:20) dilakukan optimasi kecepatan alir fase gerak.
Optimasi kecepatan alir yang dilakukan yaitu pada kecepatan 0,9; 1,0 dan 1,1
mL/menit. Hasil optimasi kecepatan alir dapat dilihat pada tabel 3.

Tabel 3. Hasil optimasi kecepatan alir fase gerak

Kecepatan Alir Fase Gerak
(mL/menit) Syarat (Snyder et
Parameter
al., 2010)
0,9 1,0 1,1
Resolusi (Rs) 3,00 3,15 2,63 >2
Rt (menit) 4,49 3,91 3,61 ≤ 10
Tailing factor 1,12 0,90 0,75 <2
Jumlah lempeng teoritis
5367 5184 5184 > 2000
(N)

Hasil optimasi kecepatan alir yang dipilih adalah 1 mL/menit, karena

menghasilkan nilai resolusi, tailing factor, nilai N, serta luas area yang optimal
dengan waktu retensi yang cukup cepat dibandingkan dengan kecepatan alir yang
lain.
Berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan diperoleh sistem kromatografi
sebagai berikut:
Fase diam : Cosmosil C18 (150 x 4,61 mm, 5 µm)
Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20)
Kecepatan alir : 1 mL/menit
Detektor : UV 245
Vol. Injeksi : 20 µL

C. Uji Kesesuaian Sistem

Tujuan dilakukan uji kesesuaian sistem untuk mengetahui kesesuaian,
keefektifan serta menjamin bahwa metode yang digunakan dapat menghasilkan
akurasi dan presisi yang dapat diterima untuk analisis atorvastatin agar sistem
 26

KCKT memberikan hasil yang baik (Gandjar dan Rohman, 2012). Syarat uji
kesesuaian sistem yang baik menurut Snyder et al. (2010), apabila waktu retensi
menghasilkan CV ≤ 1,0%, luas area dan intensitas menghasilkan CV ≤ 2,0%, nilai
resolusi > 2, tailing factor ≤ 2, dan nilai N > 2000. Hasil uji kesesuaian sistem dapat
dilihat pada tabel 4.

Tabel 4. Hasil uji kesesuaian sistem KCKT untuk analisis atorvastatin 120 ng/mL
dalam larutan fase gerak
Syarat
Parameter Rerata SD CV (%) (Snyder et
al., 2010)
Waktu Retensi 3,96 0,01 0,17 CV ≤ 1,0 %
Luas Area 2726465 21018,89 0,77 CV ≤ 2,0 %
Tinggi Puncak 362225 1829,41 0,51 CV ≤ 2,0 %
Resolusi 2,45 0,05 2,02 Rs > 2
Tailing Factor 0,88 0,01 1,67 TF ≤ 2
Jumlah Lempeng
Teoritis (N) 6055 4,19 0,07 N > 2000

Hasil uji kesesuaian sistem terhadap kadar atorvastatin 120 ng/mL yang
dianalisis dengan KCKT menunjukkan bahwa kondisi yang digunakan untuk
analisis kadar atorvastatin dalam tablet memenuhi persyaratan uji kesesuaian
sistem.

D. Validasi Metode Analisis

1. Penentuan Selektivitas
Selektivitas menggambarkan kemampuan suatu metode untuk
mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen
lain. Pada penelitian ini, selektivitas metode analisis dilakukan dengan
membandingkan puncak dalam kromatogram atorvastatin standar, sampel
tablet atorvastatin, dan pelarut fase gerak yang dianalisis dengan KCKT pada
kondisi yang optimum. Selain itu juga dilakukan perhitungan nilai resolusi dari
atorvastatin standar.
 27

ATR

ATR

Gambar 3. Profil kromatogram : A) standar atorvastatin, B) sampel tablet atorvastatin, C)

pelarut fase gerak

Parameter KCKT :
Fase diam : Cosmosil C18 (150 x 4,61 mm, 5 µm)
Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20)
Kecepatan alir : 1 mL/menit
Detektor : UV 245
Vol. Injeksi : 20 µL
 28

Pada penelitian ini dihasilkan kromatogram dengan puncak atorvastatin

standar dan sampel tablet atorvastatin pada waktu retensi 3,9 menit, serta tidak
terlihat adanya puncak pada kromatogram pelarut fase gerak. Hal ini
menunjukkan bahwa metode yang digunakan selektif terhadap senyawa
tertentu, dan menunjukkan tablet atorvastatin dapat dianalisis mengggunakan
metode ini dengan membandingkan dengan standar atorvastatin yang memiliki
waktu retensi yang sama.
Menurut Snyder et al. (2010), persyaratan uji selektivitas untuk
pengembangan metode analisis apabila memiliki nilai resolusi (Rs) > 2, hasil
perhitungan resolusi diperoleh dari kromatogram atorvastatin standar dengan
nilai resolusi sebesar 3,1 yang berarti memenuhi persyaratan. Hasil ini
menunjukkan metode KCKT yang digunakan untuk analisis atorvastatin
mempunyai selektivitas yang baik. Hasil kromatogram atorvastatin standar,
sampel tablet atorvastatin, dan pelarut fase gerak dapat dilihat pada gambar 3.
2. Penentuan Linearitas
Uji linearitas dilakukan dengan cara menginjeksikan 5 seri konsentrasi
atorvastatin pada sistem KCKT. Konsentrasi yang digunakan adalah 20, 40,
60, 80, 120 ng/mL. Data luas area atorvastatin yang diperoleh diplotkan dengan
seri konsentrasi atorvastatin. Persamaan garis yang dihasilkan antara seri
konsentrasi atorvastatin dengan luas area yang diperoleh dari kromatogram
adalah y = 10742607,432x – 1356494,324; koefisien korelasi (r) = 0,9995, dan
koefisien determinasi (r2) = 0,9990.
Menurut Chan et al. (2004), persyaratan linearitas untuk validasi
metode analisis bisa diterima jika nilai koefisien determinasi (r2) lebih besar
atau sama dengan 0,997. Pada penelitian ini, nilai r2 yang diperoleh adalah
0,9990 sehingga metode analisis yang digunakan telah memenuhi syarat
linearitas yang ditetapkan. Hasil kurva hubungan luas area kromatogram
terhadap konsentrasi atorvastatin pada penentuan linearitas dapat dilihat pada
gambar 4.
 29

3000000

Luas Area Atorvastatin 2500000

2000000

1500000 y = 10.742,61x + 1.356.494,32

R 2= 0,999
1000000

500000

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Konsentrasi Atorvastatin (ng/mL)

Gambar 4. Kurva hubungan luas area kromatogram atorvastatin terhadap konsentrasi

atorvastatin pada penentuan linearitas

3. Penentuan Akurasi dan Presisi

Salah satu syarat utama metode analisis adalah tepat dan teliti.
Ketepatan bisa dilihat dari parameter akurasi yang dalam penelitian ini
diperoleh dari nilai perolehan kembali (recovery). Ketelitian dapat dilihat dari
parameter presisi yang pada penelitian ini diukur sebagai simpangan baku
relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) (Rohman, 2009). Pada penelitian ini,
uji presisi yang dilakukan adalah keterulangan (repeatability) yaitu presisi pada
kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatanya, maupun
waktunya (Gandjar dan Rohman, 2012).
Penentuan presisi dan akurasi dilakukan pada 5 konsentrasi
atorvastatin, dimana pengukuran pada setiap konsentrasi sebanyak 5 kali. Pada
penelitian ini, uji presisi dan akurasi dilakukan pada konsentrasi atorvastatin
yaitu sebesar 20, 40, 60, 80, dan 120 ng/mL. Nilai perolehan kembali dan
koefisien variasi pengukuran atorvastatin hasil penelitian ini dapat dilihat pada
tabel 5.
 30

Tabel 5. Nilai Recovery dan Koefisien Variasi (CV)

Konsentrasi
Atorvastatin Kadar Atorvastatin Recovery
Replikasi CV (%)
diketahui terukur (ng/mL) (%)
(ng/mL)
1 20,22 101,15
2 20,66 103,32
20 3 19,02 95,09 0,64
4 20,96 104,85
5 18,92 94,62
1 43,59 108,99
2 39,66 99,16
40 3 38,49 96,22 1,38
4 37,53 93,84
5 39,72 99,30
1 58,28 97,14
2 56,15 93,59
60 3 56,12 93,53 1,35
4 56,73 94,55
5 62,02 103,37
1 81,58 101,98
2 81,31 101,63
80 3 73,84 92,31 1,73
4 75,04 93,79
5 78,40 98,01
1 111,69 93,08
2 129,53 107,95
120 3 119,80 99,86 2,82
4 123,18 102,65
5 115,25 96,05

Suatu metode analisis yang menggunakan sampel dengan konsentrasi

di bawah 1000 ng/mL dikatakan memiliki akurasi yang baik apabila nilai
recovery yang diperoleh berkisar 80 – 110% dari nilai sebenarnya (Gonzalez
et al., 2010). Pada penelitian ini, semua nilai recovery yang didapatkan berada
pada rentang tersebut. Maka dari itu, metode analisis yang digunakan pada
penelitian ini memenuhi persyaratan akurasi.
 31

Untuk uji presisi, apabila sampel yang digunakan memiliki konsentrasi

di bawah 1000 ng/mL maka syarat CV yang diterima menurut AOAC adalah
kurang dari 7,3% (Gandjar dan Rohman, 2012). Dengan demikian, metode
analisis yang digunakan dalam penelitian ini memenuhi persyaratan presisi.
4. Penentuan LOD (Limit Of Detection) dan LOQ (limit Of Quantifitation)
LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
dan masih memberikan respon signifikan, sedangkan LOQ adalah konsentrasi
terendah analit dalam sampel yang dapat ditentukan denga presisi dan akurasi
yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar
dan Rohman, 2012).
Pada penelitian ini, penentuan LOD digunakan dengan metode visual
instrumental dengan perhitungan signal to noise ratio (Ahuja and Dong, 2005).
Pengukuran dilakukan pada konsentrasi atorvastatin sebesar 0,05; 0,1; 0,2
ng/mL. Hasil penelitian diperoleh bahwa konsentrasi atorvastatin 0,05 dan 0,1
ng/mL tidak terlihat adanya puncak atorvastatin pada waktu retensi sekitar 3,9
menit, sedangkan pada konsentrasi 0,2 ng/mL terlihat adanya puncak
atorvastatin pada waktu retensi 3,96 menit. Hasil kromatogram penentuan LOD
dapat dilihat pada gambar 5.
Nilai LOD dapat dibuktikan dengan melakukan injeksi berulang
konsentrasi terpilih sebanyak 6 kali, apabila CV yang diperoleh lebih besar dari
50 50
= 3/1 = 16,67%, maka nilai tersebut merupakan LOD (Snyder et al.,
𝑆/𝑁′

2010). Pada penelitian ini, injeksi berulang konsentrasi 0,2 ng/mL dihasilkan
CV sebesar 30,07%, dapat dilihat pada tabel 6. Oleh karena itu, dapat
ditetapkan bahwa konsentrasi 0,2 ng/mL merupakan nilai LOD.
Hasil nilai LOD digunakan dasar perhitungan nilai LOQ, dimana
menurut Gandjar dan Rohman (2012), nilai LOQ diperoleh dari rumus LOQ =
10/3 LOD. Hasil dari perhitungan diperoleh nilai LOQ yaitu 0,7 ng/mL. Hasil
penentuan presisi dan akurasi untuk membuktikan nilai LOQ dapat dilihat pada
tabel 7. Pada hasil tersebut diperoleh presisi dan akurasi yang dapat diterima
dan memenuhi persyaratan presisi yaitu CV kurang dari 7,3 dan akurasi dengan
 32

nilai recovery 80 – 110%. Oleh karena itu, ditetapkan konsentrasi 0,7 ng/mL
merupakan nilai LOQ.

ATR

Gambar 5. Profil kromatogram atorvastatin : A) konsentrasi 0,05 ng/mL, B) konsentrasi 0,1

ng/mL, C) konsentrasi 0,2 ng/mL

Parameter KCKT :
Fase diam : Cosmosil C18 (150 mm x 4,61 D, 5 µm)
Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20)
Kecepatan alir : 1 mL/menit
Detektor : UV 245
Vol. Injeksi : 20 µL
 33

Tabel 6. Hasil Injeksi Berulang Atorvastatin 0,2 ng/mL

Syarat
Konsentrasi Rerata Luas
Luas Area (Snyder
Atorvastatin Area SD CV (%)
Atorvastatin et al.,
(ng/mL) Atorvastatin
2010)
27105
38624
16123 CV >
0,2 2801,83 842,52 30,07
21844 16,67
28562
35873

Tabel 7. Nilai Recovery dan Koefisien Variasi (CV) pada penentuan LOQ
Konsentrasi Kadar
Atorvastatin Atorvastatin Recovery
Replikasi CV (%)
diketahui terukur (%)
(ng/mL) (ng/mL)
1 0,70 100,01
2 0,71 101,27
0,7 3 0,71 101,14 0,93
4 0,72 103,04
5 0,71 101,10

E. Uji Keseragaman Kadar Tablet

Pada penelitian ini, sampel yang dgunakan untuk uji keseragaman kadar
tablet atorvastatin adalah atorvastatin generik. Sampel ini dipilih karena
atorvastatin generik paling banyak beredar di pasaran dengan harga paling murah
dibandingkan merek lain. Hasil keseragaman kadar tablet atorvastatin generik dapat
dilihat pada tabel 8.
 34

Tabel 8. Kadar Tablet Atorvastatin Generik

Tablet Kadar (%) SD CV (%)
1 105,09
2 100,52
3 105,82
4 102,45
5 102,55
1,79 1,75
6 101,93
7 103,60
8 100,34
9 102,09
10 101,51

Berdasarkan data di atas menunjukkan kadar atorvastatin generik dalam

sediaan tablet memenuhi persyaratan kadar menurut Aini et al. (2015) yaitu tidak
kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 110,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket.
Untuk perhitungan dapat dilihat pada lampiran 10.
Uji keseragaman tablet yang dilakukan selain untuk membuktikan bahwa
metode analisis dengan KCKT yang dikembangkan dapat digunakan untuk analisis
tablet atorvastatin, juga digunakan untuk menjamin mutu, kualitas, serta keamanan
suatu produk obat dalam sediaan tablet.
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan
bahwa:
1. Metode analisis sederhana secara KCKT menggunakan kolom Cosmosil
C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm); menghasilkan kondisi optimum untuk
penetapan kadar tablet atorvastatin dengan fase gerak campuran
metanol-air pH 3 (80:20 v/v); kecepatan alir 1 mL/menit dan dideteksi
dengan detektor UV 245 nm.
2. Metode analisis sederhana yang dikembangkan telah memenuhi
persyaratan validasi metode analisis meliputi selektivitas; linearitas
pada rentang 20 – 120 ng/mL dengan r2 = 0,999; akurasi; presisi; Limit
of Detection (LOD) sebesar 0,2 ng/mL; dan Limit of Quantitation
(LOQ) sebesar 0,7 ng/mL.

B. Saran
Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik maka perlu dilakukan beberapa
hal seperti berikut:
1. Perlu dilakukan validasi dengan parameter yang lain seperti robustness
dan stabilitas larutan.
2. Perlu dilakukan uji keseragaman tablet atorvastatin dengan tablet merek
lain.

35
36