Pemisahan Kromatografi

Slamet Ibrahim
Marlia Singgih Wibowo
 Pendahuluan
• Metode analisis harus selektif dan spesifik
• Pemisahan analit dari gangguan komponen lain (bahan
aktif lain atau matriks) merupakan tahap yg penting
• Metode pemisahan klasik : pengendapan, distilasi,
ekstraksi
• Metode pemisahan modern : kromatografi, elektroforesis
• Untuk sampel multikomponen dan senyawa kompleks
seperti dalam matriks biologi (darah, urin, dan jaringan).
 Kromatografi
• Suatu teknik pemisahan yang pertama kali diperkenalkan
oleh Mikhail Tswett (1906)
• Digunakan utk memisahkan pigmen tumbuhan (klorofil,
xantofil) melalui kolom kaca yang berisi kalsium karbonat
• Warna yg terbentuk akibat elusi pelarut organik membentuk
pita-pita berwarna dalam kolom
• Teknik tsb diberi nama Kromatografi (chroma=warna,
graphien=tulisan/gambaran)
 Definisi Kromatografi

• IUPAC
• Farmakope Indonesia IV
IUPAC (International Union of Pure
and Applied Chemistry)
• Metode digunakan untuk pemisahan komponen dari suatu
sampel pada mana komponen akan terdistribusi antara
dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam
mungkin berupa padat atau cair yang terikat pada bahan
padat atau gel. Fase padat dapat terkemas dalam kolom,
tersebar sebagai suatu lapisan, atau terdistribusi sebagai
lapisan film. Fase gerak dapat berupa gas atau cair yang
mengalir atau berpindah dalam arah tertentu (Pure &
Applied Chem, 37, 447, 1974)
 Farmakope Indonesia IV, 1995,
halaman 1002
• Prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi
diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase
atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara
berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya
zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan
adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan,
tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion,
dengan demikian masing-masing zat dapat diidentifikasi
atau ditetapkan dengan metode analitik
 Yang terlibat dalam kromatografi
• Zat terlarut, yang didistribusi diantara dua fase
• Dua fase : Fase diam dan fase gerak
• Fase gerak membawa serta zat terlarut melalui media
hingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi lebih
awal atau lebih akhir
• Zat terlarut dibawa melewati fase padat oleh aliran pelarut
dlm bentuk cair atau gas , disebut ELUEN atau FASE
GERAK
• Fase diam bertindak sbg penjerap (adsorben) atau cairan
sehingga terjadi partisi antara kedua fase
 Klasifikasi
• Berdasarkan geometri : Kromatografi
Kolom (kolom klasik dan kolom modern)
dan Kromatografi planar
• Berdasarkan sifat fisika sampel :
– Kromatografi gas (sampel harus menguap
agar terbawa oleh fase gerak gas),
– Kromatografi cair ( sampel harus larut dalam
pelarut organik atau air, komponen fase
gerak)
 Kotak hitam kromatografi
Variabel terkontrol : Kolom, Komposisi fase
gerak, laju alir, suhu, selektifitas, Kepekaan

Sampel Kromatogram

PEMISAHAN PENCIRIAN
(deteksi)

APLIKASI:
KROMATOGRAF
Identifikasi,
Kemurnian,
Penetapan
Variabel tdk terkontrol : Kinerja kolom, kadar
stabilitas aliran, Noise, Drift
 Pembagian kromatografi

KROMATOGRAFI GAS (KG)

KROMATOGRAFI CAIR
KROMATOGRAFI SUPER KRITIK

KROMATOGRAFI CAIR (KC)

 KROMATOGRAFI GAS

PADAT
Berdasarkan Fase
diamnya :
KOLOM
•Padat (KGP) CAIRAN (yang melekat
•Cairan (KGC) pada pendukung padat)

Fase gerak

•ADSORPSI (KGP)
•PARTISI (KGC) Fase diam

Pita terpisah
Berdasarkan Mekanisme Pemisahan :
•Adsorpsi (Kromatografi Adsorpsi)
•Partisi (Kromatografi Partisi)
KROMATOGRAFI CAIR
SUPERKRITIK (fase
gerak berupa gas pada
suhu dan tekanan di
atas titik kritiknya: CO2)

KOLOM Fase gerak

Fase diam

•PARTISI
 KROMATOGRAFI CAIR

PADAT
KOLOM PLANAR

CAIRAN •KLASIK (kolom besar)

•KERTAS
•KINERJA TINGGI
•LAPIS TIPIS

•ADSORPSI
•PARTISI
•ADSORPSI
•FASE TERIKAT
•PARTISI
•PENEKAN ION
•KIRALITAS
•PASANGAN ION (Stereoisomer)
•PERTUKARAN ION
•EKSKLUSI UKURAN
•AFINITAS
•KIRALITAS
 Perbedaan teknik kromatografi
berdasarkan bobot molekul sampel:
Kromatografi gas (sampel
harus menguap/dibuat
menguap)

Kromatografi cair (adsorpsi,

partisi, fase terikat, pertukaran
ion, pasangan ion)

Kromatografi cair (sampel berupa senyawa yang dapat

larut dalam pelarut organik atau air

50 500 10000 » 106

 Kromatografi gas
• Fase gerak : hanya membawa analit
melalui fase diam.
• Laju Aliran : berpengaruh pada pemisahan
• Fase diam : sangat berperan atau turut
serta dalam proses pemisahan sampel
• Suhu (injektor, kolom, detektor)
berpengaruh pada pemisahan.
 Kromatografi cair
• Sampel, fase diam, fase gerak semuanya
berinteraksi dalam pemisahan sehingga
lebih intensif (terutama polaritas, ukuran
molekul, afinitas, sifat permukaan fase
diam dan gerak).
• Laju alir akan berpengaruh pada waktu
retensi.
• Suhu akan berpengaruh pada waktu
retensi.
 Proses pemisahan
Elusi
melalui
kolom
dgn
arah
tertentu
Kromatogram

2
pelarut 1
Mekanisme umum
• Pemisahan dicapai dgn mengendalikan dan
menciptakan interaksi analit-fase gerak-fase diam
• Perbedaan migrasi analit karena adanya mekanisme
interaksi antara analit/fase diam/fase gerak.
• Perbedaan migrasi menunjukkan waktu retensi relatif
• Pada kromatografi kolom: fase gerak mengalir karena
adanya perbedaan tekanan di kedua ujung kolom
• Pada kromatografi planar: fase gerak menaik atau
menurun karena gaya kapiler dan gaya berat/gravitasi
• Komponen yg berinteraksi kuat dgn fase diam akan
ditahan lebih lama dalam kolom dan yg lainnya terbawa
fase gerak dengan laju migrasi yang berbeda.
Kesetimbangan untuk solut A :
Am ⇄ Ad
(gerak) (diam)

Fase gerak (Am)

Fase diam (Ad)

DISTRIBUSI/PARTISI :
Kd = Cd/Cm
 Adsorpsi
Molekul
teradsorpsi pada
permukaan fase
diam (adsorben)
X=solut
S=pelarut
Xm + n Sads ⇄ Xads + n Sm

KAd = [Xads] [Sm]n

Fase diam : [Xm] [Sads]n

2( =Si-OH) =Si-O-Si= +H20
Silanol siloksan
 Partisi
(fase terikat, pasangan ion, penekanan)
Sampel : A+ + B- ⇄ AB
Ion sampel pereaksi pas.ion
Am ⇄ Ad, Kd=[Ad]/[Am]= Cd/Cm
Partikel padat
(pendukung)

Lapisan tipis cair

Fase diam: (fase diam yg cair)
=OH Cl R’ -O R’
Si + Si → Si R’= C6,C8,C18 (kurang polar)
=OH Cl R -O R atau CN, -NH2 (polar)
R = CH3
 Pertukaran ion
Terjadi kompetisi antar ion yang terlibat. Ada cation exchanger,
atau anion exchanger
Fe
H
Fe
Fe
Cu 2+ , Fe 3+ H Cu 2+ , H +
Fe
H H
Fe
H H

Resin penukar ion

MR+Y- + X- ⇄ MR+X- + MR+X- + Y- X-, X+ = ion sampel

atau Y-,Y+ = ion lawan
MR-Y+ + X+ ⇄ MR+X- + MR-X+ + Y+
Eksklusi ukuran (Size exclusion)
Molekul
analit
Molekul kecil
masuk ke dlm
Pori-pori
gel

Molekul
pelarut Molekul besar
Matriks gel ditolak tdk dpt
masuk pori
K=0 mol besar
K=1 mol kecil
K = Cs/Cm
VR = Vo + KVi
 Afinitas
(Bioafinitas, biospesifik)
Matriks
kolom Tahap
+ Tahap
pencucian
elusi
Liganda
+
biospesifik yg
terikat
kovalen Mol yg cocok Tdk terikat

Kolom
diregenerasi

Molekul yg
Molekul yg
diinginkan
dibuang
 Tahap dalam proses afinitas
• Tahap aktivasi gel
BrCN -O-C=N -O
-OH Imidokarbonat
-OH C=NH
-OH -O (aktif)

• Gabung dengan protein

NH
-O -O -C-NH-Protein
C=NH + H2N-Protein
-O -O H Ikatan kovalen
 Konsep Retensi dalam Kolom
Konsep ini dapat dijelaskan dengan persamaan berikut :
• R=ratio laju migrasi solut
• RA=laju migrasi solut A / laju migrasi fase gerak = µA/µm
= fraksi mol solut dlm fase gerak ….. (1)
• RA= nAm / (nAd+nAm) = 1 / (1+nd/nm )…..(2)
• k’ = faktor retensi/kapasitas = nd/nm ……(3)
• RA= 1/(1+k’A ) ……. (4)
• µm= µA (1+k’A) ….. (5) Karena µ = L / tR, maka :
• tRA = tm (1+k’A) …… (6)
Di mana
• tR(A) = waktu retensi komponen A
• tm = waktu retensi fase gerak (komponen yg tdk diretensi
oleh kolom, elusi sempurna
• nA = molar
• nm = molar zat A dalam fase gerak
• nd = molar zat A dalam fase diam
• k=koefisien distribusi komponen dlm kedua fase = Cd/Cm
• k’=nd/nm = Cd.Vd/Cm.Vm=k.Vd/Vm ,
Vd/Vm=ratio fase
• tR=tm (1+k’) = tm (1+k.Vd/Vm) …..!!
• tR = VR/F
• VR=volume retensi fase gerak yg mengandung komponen
F= laju alir fase gerak, sehingga :
• VR = Vm (1+k.Vd/Vm) …. (7)
• VRA = Vm + KAVd ….. (8)
• Dengan demikian parameter retensi adalah :
– Faktor retensi (k’)
– Waktu retensi (tR)
– Volume retensi (VR)
• Untuk komponen sampel yg tdk diretensi (elusi
sempurna) maka Cd=0 dan K=0, serta VR=Vm dan
tR=tm
• Secara eksperimen nilai k’ dapat dihitung dari k’A =
tRA-tm / tm ……. (9)
• Tm diperoleh dari senyawa yg k=0, berarti senyawa
tsb tidak diretensi (Cd=0, K=0)
tRA=L/µm(1+k’A)=L/µm (1+KA Vd/Vm) …… (10)

• tR tergantung pada :
– Panjang kolom (L)
– Laju alir fase gerak (µm )
– Koefisien distribusi/adsorpsi
– Volume fase diam/luas permukaan fase diam pada
adsorpsi
– Volume mati (Vm)
– Waktu retensi dpt dihitung dari kromatogram
 Konsep retensi untuk Kromatografi
Planar
Batas pelarut
pengembang
• Fase gerak berupa lapisan sorben
pada kaca/plastik
• Fase gerak merambat ke atas Zp
dibantu oleh gaya kapiler
• Rf=jarak migrasi sampel (cm)/ jarak
migrasi pelarut pengembang (cm)
• Rf=Zx/Zp …(11) , 0≤Rf≤1
• hRf=100 Rf …(12) , 0≤hRf≤100 Zx

Gerakan Molekul : menaik (gaya Batas awal (tempat penotolan)

kapiler), menurun (gravitasi),
sirkular (sentrifugal)
 Rf = Faktor Retardasi
• Merupakan parameter retensi dasar
• Rf= Rasio antara jarak migrasi sampel(cm) dengan
jarak migrasi pelarut pengembang (cm)
• Rr = (jarak migrasi sampel)/(jarak migrasi senyawa
pembanding)
• Bila Rr =1 berarti kedua senyawa adalah identik,
sedangkan bila Rr ≠ 1 tidak identik
Faktor Kapasitas/retensi (k’)
k’x = tR(x) / tm
Rf = µx / µ = 1/(1+k’)
Rf = tm / tm+tR(x) = 1/(1+k’)
tR(x) k’ = (1 – Rf) / Rf …… (13)

tm
Rf = 0 → k’ ~ (sampel tdk migrasi)
Rf = 0,5 → k’ = 1
t (menit) Rf = 1 → k’ = 0 (sampel terbawa pelarut)

Bandingkan dengan k’ untuk kromatografi kolom :

k’ = tR(x) – tm ……(7)
tm
 Istilah/simbol dalam kromatografi
LAMA BARU
SIMBOL ARTI SIMBOL ARTI
α Faktor selektifitas α Faktor pemisahan

HETP Tinggi Setara Pelat H Tinggi Pelat

Teoritis /Lempeng
k’ Faktor kapasitas k’ Faktor Retensi

n Jumlah Pelat Teoritis N Jumlah Pelat

/Efisiensi
neff Jml efektif pelat teoritis Neff Jml pelat efektif

tm Mobil Phase Holdup tM Mobil Phase

time Holdup time
tr Waktu retensi tR Waktu retensi

t’r Wakt retensi yg diatur t’R Wakt retensi yg

diatur
W Lebar bawah/dasar Wb Lebar puncak
puncak
• Istilah dan simbol pada kromatografi disepakati
berdasarkan rekomendasi IUPAC yg dipublikasi
pd thn 1993 dan 2001
• LS Ettre, “The New IUPAC Nomenclature for
Chromatography”, LC-GC, 11(7),1993, p.502
• Majors and Carr,”Glossary of Liquid Phase
Separation Terms”, LC-GC, 19(2), 2001, p.124.
• Lihat pula :
www.chromatographyonline.com
www.zurchrom.com/pdf/glossary/pdf
TERIMA KASIH