PRAKTIKUM X

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

(ELUEN POLAR)

A. TUJUAN
Mahasiswa mampu menjelaskan dan melakukan identifikasi kimia dengan KLT.

B. DASAR TEORI
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan
perambatankomponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-
komponennya akan dipisahkanantara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam akan menahan komponen campuransedangkan fase gerak akan melarutkan zat
komponen campuran. Komponen yang mudah tertahanpada fase diam akan tertinggal.
Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akanbergerak lebih cepat. (
Imam Haqiqi, Sohibul,2008 )
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan
perambatankomponen dalam medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama kali
dijelaskan olehMichael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang bekerja di Universitas
Warsawa Pada saat itu,Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmen- pigmen
lain dari ekstrak tanamanmenggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium
karbonat. Pada kromatografi,komponen- komponen yang akan dipisahkan berada diantara
dua fase yaitu fase diam ( stationary )dan fase bergerak ( mobile ). Fase diam adalah fase
yang akan menahan komponen campuransedangkan fase gerak adalah fase yang akan
melarutkan zat komponen campuran. Komponen yangmudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal atau tidak bergerak sedangkan komponen yangmudah larut dalam fase gerak
akan bergerak lebih cepat. ( Iskandar, 2007 )
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik yang sederhana dan banyak
digunakan. Metode inimenggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi
penyerap untuk lapisan tipis dankering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida.
Untuk menotolkan larutan cuplikan padalempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro
pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah darilempeng dicelup dalam larutan pengulsi
di dalam wadah yang tertutup (Chamber) (Rudi, 2010)
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada
tahun 1938. KLTmerupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan
elektroforesis. Berbedadebgan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau
dikemas di dalamnya, padakromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang
seragam (uniform) pada permukaanbidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat
aluminium atau pelat plastik. Meskipundemikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan
sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom. (Iskandar, 2007)
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi
komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan isoflavonoida yang terdapat
pada tahu, tempe,bubuk kedelai dan tauco serta Scoparia dulcis, Lindernia anagalis, dan
Torenia violacea. Yang padasenyawa isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa
kelebihan senyawa isoflavon yang potensialbagi kesehatan manusia, di antaranya adalah
sebagai antioksidan, antitumor / antikanker,antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat
mencegah osteoporosis. Fase gerak yang dikenalsebagai pelarut pengembang akan
bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler padapengembangan secara menaik
(ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangansecara menurun
(descending). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebihmurah
dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan.
Dalamkromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat
dikatakan hampirsemua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat
(Rohman, 2007).
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas
dasar perbedaanadsorpsi atau partisi oleh pase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.
Pada dasarnya KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas , terutama pada cara
pelaksanaannya. Perbedaan nyatanyaterlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya,
yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagaipengganti kertas. Bahan adsorben sebagai
fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbukselulosa. Partikel selika gel
mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentukikatan hidrogen
dengan molekul polar air. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali
 jugamengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase
gerakmerupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. (Rudi, 2010)
Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis
tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan
komponen-komponen pada KLTdengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk
memisahkan komponen kimia tersebutdengan menggunakan kolom kromatografi dan
sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel daneluen yang digunakan berdasarkan basil
yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalaukepolaraan eluen pada kolom
kromatografi sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT (Iskandar, 2007)
Pada hakekatnya KLT merupakan metoda kromatografi cair yang melibatkan dua
fasa yaitu fasa diamdan fasa gerak. Fasa geraknya berupa campuran pelarut pengembang
dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap
(kromatografi cair-padat) atauberfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair
(kromatografi cair-cair). Fasa diam pada KLTsering disebut penyerap walaupun berfungsi
sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistemkromatografi cair-cair. Hampir segala
macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT,contohnya silika gel (asam
silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatomae) danselulosa. Silika gel
merupakan penyerap paling banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007).

C. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
 Chamber
 Gelas beaker 100 mL
 Batang pengaduk
 Pipa kapiler
 Plat KLT
 Oven
 Sinar UV
 Penggaris
 Cutter
 Kertas saring
 2. Bahan
 Etanol 96%
 Kloroform
 Aquadest
 Ekstrak etanol daun Insulin
 Fraksi Kloroform
 Fraksi n-butanol
 H2SO4
D. CARA KERJA

1. Pembuatan eluen
Eluen non polar dibuat dengan campuran pelarut yaitu N-heksana dan etil
asetat dengan perbandingan 8:2:7:3:6:4

Eluen polar dibuat dengan campuran pelarut yaitu etil asetat : etanol : air
dengan perbandingan 15:2:1;8:2:1;6:2:1

2. Penjenuhan eluen

Penjenuhan eluen dilakukan dengan memasukkan eluen kedalam chamber dan

kemudian mengamati sampai eluen naik keatas kertas saring (berarti jenuh).
Keluarkan kertas saring dari chumber.

3. Penotolan dan identifikasi KLT

Penotolan dan identifikasi KLT dilakukan dengan melarutkan ekstrak

simplisia dengan etanol dalam vial.

Menotolkan ekstrak yang telah diencerkan diatas plat KLT hingga terbentuk noda
 Mengeluarkan plat KLT hasil penotolan dari chumber setelah eluen yang
menaik mendekati garis batas atas sebesar 0,5 cm

Mengamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV dengan panjang

gelombang tertentu. Dan menggambar hasil yang terbentuk

Selain menggunakan sinar UV untuk melihat noda yang dibentuk

menggunakan penampak bercak H2S04

Menyemprotkan H2S04 diatas plat KLT, memanaskan diatas bunsen sehingga

noda atau plat terlihat jelas.

Mengamati kembali noda yang terbentuk dibawah sinar UV dan menggambar

hasilnya kemudian menghitung harga Rf nya.
E. HASIL PENGAMATAN

𝒋𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒑𝒂𝒏𝒋𝒂𝒏𝒈 𝒏𝒐𝒅𝒂

Rumus Rf = 𝒋𝒂𝒓𝒂𝒌 𝒑𝒂𝒏𝒋𝒂𝒏𝒈 𝒑𝒆𝒍𝒂𝒓𝒖𝒕

Eluen polar
15:2:1
2 0
Ekstrak etanol Rf = 8,5 Fraksi kloroform Rf = 8,3 = 0

= 0,2352
8:2:1
0 0
Ekstrak etanol Rf = 8,5 Fraksi kloroform Rf = 8,5 = 0

=0
6:2:1
8,1 8,5
Ekstrak etanol Rf = 8,5 Fraksi kloroform Rf = 8,5 = 1

= 0,9529
F. PEMBAHASAN
Pada percobaan ini, tehnik kromatografi lapis tipis yang digunakan adalah suatu
plat tipis (aluminium) yang berfungsinya untuk tempat berjalannya adsorbens sehingga
proses migrasi analit oleh solventnya bisa berjalan. Hal ini Inilah yang membedakan antara
kromatografi kertas dengan kromatografi lapis tipis. Yang dimana pada KLT
menggunakan plat tipis sedangkan pada KK menggunakan kertas (lapisan selulosa)
sehingga proses elusinya lebih lama (kira– kira 10–20 menit lebih lama dari KLT).
Perbedaan lainnya dari kedua kromatografi tersebut adalah pembentukan noda pada
adsorbensnya dimana pada KLT noda yang dihasilkan lebih tajam dibandingkan noda yang
nampak dalam KK. Hal ini disebabkan pada KK penyusun dari adsorbens berupa selulosa
yang dapat mengikat air, sehingga ketika dielusi dengan suatu pelarut atau fase gerak maka
noda yang dihasilkan mengalami penyebaran akibat terdapatnya gugus –OH dalam
adsorbens yang masih tertingal dalam fase diamnya sehingga penampakan nodanya terlihat
lebih pudar dan bentuk nodanya tidak bulat. Sedangkan dalam KLT adsorbens yang
digunakan berupa slika gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang
tercipta lebih terfokus dan tajam.
Adapun tahapan dari praktikum kali ini adalah dimulai dari penyiapan lempeng
silika gel yaitu dibuat lempeng dari silika gel dengan ukuran 7 cm x 1 cm, kemudian
lempeng silika gel dipotong dengan yang sebelumnya telah diukur. Kemudian penjenuhan
chamber yaitu chamber diisi dengan eluen polar yaitu etanol:kloroform:air dengan
perbanding 15:2:1, 8:2:1, dan 6:2:1 dimasukkan potongan kertas saring yang panjangnya
lebih dari tinggi chamber dan kemudian ditutup dan dibiarkan hingga eluen naik pada
kertas saring hingga melewati penutup kaca (chamber telah jenuh) dimana dilakukan
penjenuhan ini bertujuan untuk menyeimbangkan tekanan atmosfer di dalam dan di luar
chamber agar noda berjalan lurus (tidak berkelok-kelok).
Selanjutnya dilakukan Penotolan sampel pada lempeng yaitu ekstrak etanol daun
pacing (dilarutkan dalam etanol), fraksi kloroform (dilarutkan dalam kloroform), dan fraksi
n-butanol(dilarutkan dalam n-butanol), lalu ekstrak diambil dengan menggunakan pipa
kapiler, kemudian ditotolkan pada lempeng yang telah disiapkan. Lempeng yang telah
ditotol diangin-anginkan sejenak untuk menguapkan pelarutnya lalu dimasukkan ke dalam
chamber yang telah dijenuhkan. Bila eluen telah mencapai batas atas dari lempeng silica
 gel, maka lempeng tersebut dikeluarkan. Selanjutnya diamati secara langsung dan dengan
menggunakan penampak bercak UV, disemprot lempeng dengan larutan H2SO4.

Dari hasil percobaan dihasilkan pada eluen perbandingan 15:2:1 jumlah nodanya
satu, jarak yang ditempuh senyawa terlarut 2 cm, dan jarak yang ditempuh pelarut 8,5 cm,
sehingga dihasilkan nilai Rf 0,2352 dan pada perbandingan 8:2:1 jumlah nodanya satu,
jarak yang ditempuh senyawa terlarut 2 0 cm, dan jarak yang ditempuh pelarut 8,5 cm,
sehingga dihasilkan nilai Rf 0, dan pada perbandingan 6:2:1 jumlah nodanya satu, jarak
yang ditempuh senyawa terlarut 8,1 cm, dan jarak yang ditempuh pelarut 8,5 cm, sehingga
dihasilkan nilai Rf 0,9.
Semakin tinggi polaritas senyawa, fase diam dari senyawa dengan afinitas yang lebih
besar akan mempunyai nilai Rf yang semakin kecil. Semakin rendah polaritas senyawa,
semakin tinggi afinitas untuk pelarut dan semakin besar nilai Rf. Jika pelarut berubah dari
pelarut polaritas rendah (seperti hexane) ke polaritas yang lebih tinggi (seperti etil asetat)
kekuatan eluasi akan meningkat dan akan meningkatkan semua nilai-nilai Rf. Tempat
dengan nilai Rf tertinggi adalah yang paling polar (bergerak tercepat), dan tempat dengan
nilai Rf terendah adalah yang paling polar (bergerak lambat).

G. KESIMPULAN
1. Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen
menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. Prinsip
dalam kromatografi yakni adsorbsi dan partisi.

2. Dari hasil percobaan dihasilkan pada eluen perbandingan 15:2:1 jumlah nodanya satu,
jarak yang ditempuh senyawa terlarut 2 cm, dan jarak yang ditempuh pelarut 8,5 cm,
sehingga dihasilkan nilai Rf 0,2352 dan pada perbandingan 8:2:1 jumlah nodanya satu,
jarak yang ditempuh senyawa terlarut 2 0 cm, dan jarak yang ditempuh pelarut 8,5 cm,
sehingga dihasilkan nilai Rf 0, dan pada perbandingan 6:2:1 jumlah nodanya satu, jarak
yang ditempuh senyawa terlarut 8,1 cm, dan jarak yang ditempuh pelarut 8,5 cm,
sehingga dihasilkan nilai Rf 0,9.
H. DAFTAR PUSTAKA
Haqiqi, Sohibul Himam. 2008. Kromatografi Lapis Tipis. Makassar: Universitas
Hasanuddin
Iskandar, Yusuf. 2007. Karakteristik Zat Metabolit Sekunder Dalam Ekstrak Bunga
Krisan(Chrysanthemum cinerariaefolium) Sebagai Bahan Pembuatan Biopestisida.
FMIPA. Semarang.
Khopkar, S,M. 2009. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas Indonesia.
Rudi, L. 2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Kendari: Universitas Haluoleo.
Sofia, Lenny. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah
denganMetoda Uji Brine Shrimp. Sumatera Utara: USU Repository.
 Mengetahui

Dosen Pengampu

Rezqi Handayani,S.Farm,M.P.H.,Apt Nurul Qamariah,Msi

Asisten Dosen

Heni Rusmita, Amd.Farm Rizmadhani Safitri Mirza Sinta Syaba’nia

Praktikan

Ridwan Dwiatmoko
 LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA
PAKTIKUM X
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
(ELUEN POLAR)

Disusun Oleh :

Ridwan Dwiatmoko

17.71.018697

PROGAM STUDI DIPLOMA-III FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PALANGKA RAYA
TAHUN 2019