UJI TOKSISITAS KOMBINASI EKSTRAK ETANOL DAUN CENGKEH

(Syzygium aromaticum L) DAN DAUN PEPAYA (Carica papaya L) DENGAN

METODE Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

Iski Ristiani 1), Devi Ika Kurnianingtyas S 2), Desi Sri Rejeki 3)
Prodi S1 Farmasi, STIKES Bhakti Mandala Husada Slawi 52416, Tegal, Indonesia

Abstrak

Toksisitas adalah suatu keadaan yang menandakan adanya efek toksik atau
racun yang terdapat pada suatu bahan yang dapat menyebabkan kerusakan. Uji
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan metode awal yang digunakan
untuk melihat adanya toksisitas. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui efek
toksisitas ekstrak etanol daun cengkeh dan daun pepaya terhadap larva Artemia
salina Leach. Serbuk daun cengkeh dan daun pepaya dimaserasi dengan etanol
96% selama 3x24 jam. Efek toksisitas diuji dengan metode BSLT dengan
konsentrasi 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, dan 300 ppm. Daun
cengkeh mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, saponin, tanin dan steroid,
sedangkan daun pepaya mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, saponin,
steroid, dan triterpenoid yang memiliki efek toksisitas. Toksisitas terhadap larva
udang Artemia salina Leach diamati setelah 24 jam. Presentase kematian larva
Artemia salina Leach pada masing-masing kelompok dilakukan analisis deskriptif
sehingga didapat LC50. Nilai LC50 dari ekstrak etanol daun cengkeh, daun pepaya
dan kombinasi ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dengan perbandingan (1:1)
berturut-turut 89,841 µg/mL; 38,244 µg/mL; dan 73,229 µg/mL. Hasil LC50
kurang dari 1000 µg/mL maka ketiga bahan uji dapat dinyatakan memiliki
aktivitas toksisitas. Kombinasi ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dengan
perbandingan (1:1) memiliki nilai LC50 lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak
tunggal daun pepaya dan lebih besar di bandingkan ekstrak tunggal daun cengkeh.

Kata Kunci : Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), Cengkeh, Pepaya, Artemia salina
Leach, Toksisitas
 Abstract

The Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) test is the initial method used to
see toxicity. The purpose of this study was to determine the toxicity effects of
ethanol extract of clove leaves and papaya leaves on Artemia salina Leach larvae.
Clove leaf powder and papaya leaves are macerated with 96% ethanol for 3x24
hours. Clove leaves contain flavonoids, alkaloids, saponins, tannins and steroids,
while papaya leaves contain compounds of flavonoids, alkaloids, saponins,
steroids, and triterpenoids which have a toxic effect. Toxicity effects were tested
by the BSLT method with concentrations of 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm,
200 ppm and 300 ppm. Toxicity to shrimp larvae Artemia salina Leach was
observed after 24 hours. Percentage of mortality data analyzed probitly with
SPSS to obtain LC50 was analyzed by Kolmogorov-Smirnov test and continued
with ANOVA test. LC50 values from the ethanol extract of clove leaves, papaya
leaves and a combination of clove leaf extract and papaya leaves by comparison
(1: 1) were 89.841 µg / mL respectively; 38,244 µg / mL; and 73,229 µg / mL.
LC50 results are less than 1000 µg / mL, so the three test materials can be stated
to have toxicity activities. the combination of clove leaf extract and papaya leaves
by comparison (1: 1) has a lower LC50 value compared to the single extract of
papaya leaves and is greater than the single extract of clove leaves.

Keywords : Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), Clove, Papaya, Artemia salina Leach,
Toxicity

PENDAHULUAN
Toksisitas adalah suatu keadaan yang menandakan adanya efek toksik atau racun
yang terdapat pada suatu bahan yang dapat menyebabkan kerusakan (Hodgson, 2010).
Toksisitas terdapat dua macam uji diantaranya toksisitas umum dan khusus. Toksisitas
umum untuk mengevaluasi keseluruhan efek suatu obat pada hewan uji sedangkan
toksisitas khusus untuk mengevaluasi seperti uji teratogenik, uji mutagenik, uji
karsinogenik, dan uji efek adisi (Hodgson, 2010).
Kanker merupakan suatu penyakit yang menyebabkan kematian di negara-negara
berkembang. Penyakit ini ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak terkendali dan
menyerang jaringan biologis lainya (Ramdhini, 2010). Berdasarkan data International
Agencyfor Research on Cancer (IARC) pada tahun 2012 terdapat 14,1 juta kasus kanker
dan 8,2 juta kematian akibat kanker, jumlah tersebut meningkat dibandingkan tahun 2008
dimana terdapat 12,7 juta kasus baru dan 7,6 juta kematian (Anonim, 2013). Kanker
merupakan penyakit kedua yang mematikan setelah penyakit jantung salah satu penyakit
kronis yang peningkatanya cukup tinggi saat ini. Menurut World Health Organization
atau WHO (2014) kanker merupakan suatu istilah umum ya`ng menggambarkan penyakit
pada manusia berupa munculnya sel-sel abnormal dalam tubuh yang melampaui batas
yang dapat menyerang sel-sel tubuh lain.
Pengobatan kanker dapat dilakukan dengan operasi, radiasi dan kemoterapi. Selain itu
penggunaan obat-obatan belum selektif dalam membunuh sel kanker sehingga sel tubuh
yang normal juga mati, memiliki banyak efek samping dan biaya pengobatan pasien
relatif mahal, sehingga masyarakat mulai menggunakan obat tradisional sebagai alternatif
pengobatan kanker (Wijaya, 2012).
Salah satu metode awal yang digunakan untuk mencari senyawa bioaktif hayati
sebagai antikanker baru yang berasal dari tanaman adalah Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) yang selanjutnya dapat dilakukan uji sitotoksik menggunakan biakan sel kanker.
Metode BSLT merupakan metode uji hayati yang sederhana, cepat, mudah dan dapat
dipercaya (Meyer, dkk., 1982).
Masyarakat Indonesia telah lama memanfaatkan bahan alam sebagai obat tradisional
untuk menangani berbagai masalah kesehatan (Cut, dkk., 2009). Khasiat obat tradisional
telah turun menurun, bahan baku mudah diperoleh, lebih murah dan memiliki efek
samping yang relatif kecil dibandingkan dengan obat sintetik. Maka dapat dilakukan
penelitian lebih lanjut karena banyak tanaman yang belum diketahui kadar toksisitasnya
(Putri, 2010; Muaja, dkk., 2013).
Tanaman di Indonesia yang dimanfaatkan sebagai obat alami adalah daun Cengkeh
dan daun Pepaya. Banyak penelitian yang telah dilakukan baik secara in vivo maupun in
vitro pada daun Cengkeh dan daun Pepaya. Daun Cengkeh (Syzygium aromaticum)
berdasarkan uji fitokimia mengandung senyawa tanin, flavonoid, saponin, alkaloid,
steroid dan triterpenoid yang merupakan antioksidan (Khalaf, dkk., 2007). Daun Pepaya
(Carica papaya L) mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid yang cukup banyak
dan juga mengandung enzim papain sebagai antioksidan (Dalimartha, 2003; Tietze,
2002). Daun Pepaya mempunyai efek sitotoksik karena mempunyai nilai LC50<1000 ppm
yaitu, 66,61 ppm dan menurut (Meyer, dkk., 1982) menya takan bahwa fraksi N-heksan,
fraksi etil asetat dan fraksi air menunjukkan toksisitas yang relatif lebih rendah memiliki
nilai LC50 untuk fraksi N-heksan 92,93 μg/mL, fraksi etil asetat sebesar 97,25μg/mL, dan
fraksi air 134,02 μg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa potensi toksisitas yang diperoleh
lebih besar pada ekstrak etanol sebelum dilakukannya pemisahan dengan cara fraksinasi.
Penelitian mengenai daun Cengkeh dan daun Pepaya banyak dilakukan namun
penelitian kombinasi kedua jenis tanaman tersebut sebagai toksisitas belum pernah
dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk menguji toksisitas kombinasi ekstrak etanol
daun Cengkeh (Syzygium aromaticum L) dan daun Pepaya (Carica papaya L). Untuk
mengetahui potensi ekstrak yang bersifat aktif dilakukan pengujian bioaktivitasnya
dengan uji toksisitas terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp
lethality Test (BSLT) (Meyer, dkk., 1982).

METODE PENELITIAN
1. Waktu Dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan di laboratorium Farmakologi S1
Farmasi STIKes Bhakti Mandala Husada Slawi.
2. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah blender (Philips), timbangan analitik (Ohaus),
alat maserasi, waterbath (DFS), alat-alat gelas (pyrex) meliputi gelas beaker, gelas
ukur, erlenmeyer, corong, batang pengaduk, cawan, tabung reaksi, rak tabung reaksi,
pipet tetes, mikropipet (Dragon Lab), penjepit kayu, alumunium foil, botol bekas air
mineral, lampu 40 watt (Philips), seperangkat alat penetasan telur udang.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun pepaya (Carica papaya
L), daun cengkeh (Syzygium aromaticum),Larva Artemia Salina Leach, etanol 96%,
NH3, H2SO4, pereaksi meyer, pereaksi wagner, CH3COOH, akuades.
3. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental dengan rancangan
penelitian berupa post-test only control grup design teknik sampling dilakukan secara
simple random sampling. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi
ekstrak etanol daun Cengkeh (Syzygium aromaticum) dan daun Pepaya (Carica
papaya L) yang di ujikan pada Larva Artemia salina leach. Variabel terikat dalam
penelitian ini adalah jumlah kematian Larva Artemia salina leach. Variabel terkontrol
 adalah teknik maserasi, umur Larva Artemia Salina Leach, metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT).
4. Prosedur Penelitian
a) Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah daun cengkeh (Syzygium
aromaticum L) dan daun pepaya (Carica papaya L) dalam penelitian ini diperoleh
di Desa Mendelem, Kecamatan Belik, Kabupaten Pemalang.
b) Determinasi Tanaman
Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran identitas dari tanaman
yang akan diteliti dan menghindari kesalahan dalam pengambilan bahan tanaman
Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Prodi S1 Farmasi Stikes Bhamada
Slawi
c) Penyiapan Bahan
Sebanyak 2 kilogram daun tumbuhan cengkeh (Syzygium aromaticum) dan daun
pepaya (Carica papaya L) segar disortasi basah kemudian dicuci dengan air
mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran atau benda asing. Dikeringkan di
bawah sinar matahari dengan di tutup kain hitam. Daun yang telah kering diblender
sehingga di dapatkan sampel daun tumbuhan cengkeh (Syzygium aromaticum) dan
daun pepaya (Carica papaya L) dalam bentuk serbuk (Harbone, 1987).
d) Pembuatan Ekstrak daun cengkeh dan Ekstrak daun pepaya
Sebanyak 500 gram serbuk daun cengkeh dimaserasi menggunakan pelarut
etanol 96% didalam wadah kaca selama 3 x 24 jam. Perbandingan antara serbuk
daun cengkeh dengan etanol 96% adalah 1 : 5, sesekali diaduk. Hasil maserasi
disaring kembali menggunakan kapas kemudian disaring kembali menggunakan
kertas saring 2 lapis. Filtrat yang diperoleh diuapkan menggunakan rotary
evaporator sehingga diperoleh ekstrak, kemudian ekstrak dihilangkan pelarutnya
diatas waterbath sehingga diperoleh ekstrak bebas pelarut. Ekstrak yang diperoleh
kemudian di timbang dan di hitung rendemenya terhadap berat awal (Harbone,
1987).
e) Standardisasi Ekstrak
1. Organoleptik
Dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau, dan rasa dari ekstrak
(Harbone, 1987).
2. Susut pengeringan
Sebanyak 1 gram ekstrak dimasukan dalam botol timbang yang sebelumnya
telah dioven padaa suhu 1050C selama 30 menit. Kemudian ekstrak diratakan
dalam botol ditimbang dengan menggoyangkan botol atau dengan
menggunakan batang pengaduk. Kemudian dimasukan ke oven dan dibuka
tutupnya, dikeringkan pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Kemudian
dimasukan dalam eksikator hingga suhu kamar dan ditimbang (Harbone, 1987).
3. Kadar air
Ekstrak sebanyak 0,5 gram dibungkus alumunium foil, kemudian kadar air
diukur menggunakan alat moisture analyzer balance yang sudah ditara. Kadar
air yang baik adalah kurang dari 10% karena dapat menghambat pertumbuhan
mikroorganisme (Harbone, 1987).
4. Kadar abu
1) Kadar abu total, sebanyak 1 g ekstrak ditimbang seksama (W1). Kemudian
dimasukkan dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditimbang (W0).
Kemudian ekstrak dipijarkan hingga arang habis, didinginkan dan ditimbang
(W2). Dihitung kadar abu bahan yang telah dikeringkan.
 2) Kadar abu tidak larut asam, dilarutkan abu dari hasil penetapan kadar abu
total sebanyak 25 mL asam sulfat encer P didihkan selama 5 menit.
Kemudian disaring menggunakan kertas saring yang sebelumnya telah
ditimbang (C). Kemudian kertas saring tersebut dicuci dengan air panas dan
dimasukkan dalam krus silikat. Kemudian ekstrak dipijarkan dan ditimbang
(W3). Dihitung kadar abu tidak larut asam pada bahan yang telah
dikeringkan (Harbone, 1987).
f) Skrining Fitokimia
1. Uji Senyawa Alkaloid
0,5 gram ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dimasukan dalam tabung
reaksi, ditambah 1 mL asam sulfat H2SO42N dipanaskan selama 30 menit.
Didiamkan hingga larutan memisah, lapisan asam sulfat diambil dibagi kedalam
3 tabung reaksi. Tabung 1 ditambah 2 tetes pereaksi wagner, hasil positif
ditandai adanya endapan coklat. Tabung 2 ditambah 2 tetes pereaksi meyer,
hasil positif ditandai adanya endapan putih. Tabung 3 ditambah 2 tetes pereaksi
dragendorff, hasil positif ditandai adanya endapan jingga (Harbone, 1987).

2. Uji Senyawa Flavonoid

0,2 gram ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dimasukan dalam tabung
reaksi, ditambahkan 2 tetes larutan asam sulfat pekat (H2SO4). Diamati
perubahan warna menjadi merah tua atau kuning menandakan adanya senyawa
flavonoid (Harbone, 1987).
3. Uji Senyawa Tanin
0,5 gram ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dimasukan kedalam tabung
reaksi, ditambahkan larutan FeCl 1% 1 – 2 tetes, apabila berubah warna
menjadi hitam, sampel dinyatakan positif mengandung tanin (Nirwana, 2015).
4. Uji Senyawa Saponin
0,5 gram ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dimasukan kedalam tabung
reaksi, ditambahkan 5 Ml air (H2O) diambil dikocok selama 1 menit, busa yang
terbentuk menunjukan adanya saponin. (Harbone, 1987).
5. Uji Steroid dan Terpenoid
0,5 gram ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dimasukan dalam tabung
reaksi, sampel dilarutkan 0,5 mL kloroform lalu ditambah 0,5 mL asam asetat
anhidrat selanjutnya ditambah dengan 1-2 mL H2SO4 pekat. Hasil positif berupa
cincin kecoklatan atau violet menunjukan adanya triterpenoid, sedangkan warna
hijau kebiruan menunjukan adanya steroid (Nirwana, 2015).
g) Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
1. Penetasan telur
Penetasan Artemia salinaLeach dilakukan dengan cara merendam telur
Artemia salina Leach dalam air laut buatan, air laut buatan dibuat dengan cara
melarutkan 40 gram dalam 2 L air suling kemudian disaring, wadah penetesan
disekat menjadi dua bagian yaitu bagian terang dan bagian gelap dengan sekat
berlubang, sebanyak 1 gram telur Artemia salina Leach dimasukan ke dalam
aquarium yang berisi air laut 2 L, telur dimasukan ke dalam wadah bagian
gelap, bagian terang diberi penerang lampu 40 watt serta dimaserasi selama 48
jam, telur akan menetas setelah kurang lebih 24-39 jam lalu menjadi larva
(Mudjiman, 1991; Muaja, 2013). Larva yang aktif akan bergerak menuju tempat
terang melalui lubang pada sekat, setelah 48 jam larva diambil menggunakan
pipet selanjutnya digunakan sebagai hewan uji (Meyer, dkk., 1982).
 2. Persiapan sampel
a) Eksrak daun cengkeh
Larutan induk 1000 ppm dari 50 mg ekstrak daun cengkeh yang
dilarutkan dalam 50 ml air laut buatan, diambil variasi konsentrasi 25 ppm,
50 ppm; 100 ppm; 150 ppm; 200 ppm; dan 300 ppm. Setiap konsentrasi
diambil dari larutan induk dan dilarutkan dengan air laut buatan hingga batas
10 Ml (Meyer, dkk., 1982).
b) Ekstrak daun pepaya
Larutan induk 1000 ppm dari 50 mg ekstrak daun cengkeh yang
dilarutkan dalam 50 ml air laut buatan, diambil variasi konsentrasi 25 ppm,
50 ppm; 100 ppm; 150 ppm; 200 ppm; dan 300 ppm. Setiap konsentrasi
diambil dari larutan induk dan dilarutkan dengan air laut buatan hingga batas
10 mL (Meyer, dkk., 1982).
c) Kombinasi ekstrak daun Cengkeh dan daun Pepaya
Larutan induk 1000 ppm dari 50 mg ekstrak, masing-masing ekstrak yang
diambil 25 mg daun cengkeh dan 25 mg daun pepaya dilarutkan dalam 50 ml
air laut buatan, kemudian diambil variasi konsentrasi 25 ppm, 50 ppm; 100
ppm; 150 ppm; 200 ppm; dan 300 ppm. Setiap konsentrasi diambil dari
larutan induk dan dilarutkan dengan air laut buatan hingga batas 10 mL
(Meyer, dkk., 1982).
3. Uji Toksisitas
Larutan uji dengan konsentrasi 25 ppm; 50 ppm; 100 ppm;150 ppm; 200
ppm; dan 300 ppm. Masing-masing dipipet sebanyak 10 mL dimasukan ke
dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ekor larva udang yang berumur 2 hari,
setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan dan dibandingkan dengan
kontrol, larutan kontrol yang digunakan adalah air laut yang tidak diberi ekstrak
sampel dan diambil 10 mL ditambah larva 10 ekor larva udang. Tabung
percobaan disimpan dibawah pencahayaan lampu. Setelah 24 jam dilakukan
pengamatan terhadap jumlah larva yang mati. Kriteria standar untuk menilai
kematian larva udang adalah bila larva udang tidak menunjukan pergerakan
selama beberapa detik observasi (Ramdhani, 2010). Setelah dilakukan
pengamatan kemudian tingkat toksisitas ditentukan dengan menghitung jumlah
larva yang mati (Widiyatni, 2010).

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran identitas dari
tanaman yang akan diteliti dan menghindari kesalahan dalam pengambilan bahan
tanaman. Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Prodi S1 Farmasi
STIKes Bhakti Mandala Husada Slawi.
2. Pembuatan Ekstrak
Daun Cengkeh (Syzygium aromaticum L) dan daun pepaya (Carica papaya L)
sebelum dibuat simplisia dilakukan sortasi terlebih dahulu dengan memilih daun yang
segar, tidak cukup tua. Setelah disortasi daun dicuci dengan air mengalir dan
ditiriskan. Pencucian dilakukan untuk menghilangkan pengotor yang melekat pada
daun sedangkan penirisan dilakukan untuk mengurangi kadar air pada saat proses
pencucian. Simplisia dikeringkan dibawah sinar matahari ditutup dengan kain hitam
yang bertujuan agar senyawa aktif yang terdapat didalamnya tidak rusak (Sugianti,
2007). Pengeringan bertujuan untuk mempermudah pembuatan serbuk menurunkan
kadar air sehingga tidak ditumbuhi jamur, dan menjamin agar kualitasnya tetap baik
 sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lama (Anonim, 1986). Sampel yang telah
kering diserbuk untuk untuk memperluas permukaan serta membantu pemecahan
dinding dan membran sel, sehingga mempermudah dan memaksimalkan proses
ekstraksi.
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserasi. Metode
maserasi adalah suatu metode pemisahan senyawa dengan cara perendaman
menggunakan pelarut organik pada temperatur ruangan. Proses maserasi sangat
memnguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena selain murah dan mudah
dilakukan, dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan
membran sel akibat perbedaan tekanan antara didalam dan diluar sel, sehingga
metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut. Cairan
pelarut yang mengalir kedalam sel dapat menyebabkan protoplasma membengkak dan
bahan kandungan sel akan larut sesuai dengan kelarutanya (Lenny, 2006). Cairan
penyari yang digunakan adalah etanol 96% karena lebih mudah melarutkan senyawa
metabolit sekunder yang ingin didapatkan. Etanol juga tidak beracun, kapang dan
kuman sulit tumbuh, netral, absorbsinya baik dan panas yang diperlukan untuk
pemekatan lebih sedikit.
Sebanyak 500 gram serbuk daun Cengkeh (Syzygium aromaticum L) dan daun
pepaya (Carica papaya L). Masing-masing diekstraksi dengan pelarut etanol 96%
selama 3 hari disertai beberapa pengadukan. Dilakukan pengadukan untuk
meningkatkan kontak antara sampel dan pelarut sehingga proses ekstraksi lebih
sempurna. Maserat yang sudah didapat selanjutnya disaring untuk memisahkan filtrat
dan residu. Filtrat yang diperoleh dipisahkan pelarutnya dengan menggunakan rotary
evaporator. Ekstrak selanjutnya diuapkan pada waterbath untuk menghasilkan ekstrak
kental bebas pelarut. Ekstrak daun cengkeh yang dihasilkan berwarna coklat pekat
kehijauan dan akstrak daun pepaya berwarna hijau kehitaman. Setelah didapat ekstrak
kental, selanjutnya dapat dihitung rendemen dari masing-masing ekstrak. Menurut
Anonim (2000) rendemen merupakan perbandingan antara ekstrak yang diperoleh
dengan simplisia awal sedangkan tujuan dari perhitungan rendemen adalah untuk
mengetahui presentase perolehan hasil ekstrak sehingga nantinya dapat diketahui
jumlah simplisia yang dibutuhkan untuk membuat sejumlah ekstrak kental tertentu.
Hasil rendemen ekstrak daun Cengkeh (Syzygium aromaticum L) didapat sebesar
2,48% dan daun pepaya (Carica papaya L) didapat sebesar 5,88%.
3. Standarisasi Ekstrak
Standarisasi ekstrak adalah serangkaian parameter, prosedur dan cara pengukuran
yang hasilnya merupakan unsur-unsur terkait paradigma mutu kefarmasian, mutu
dalam arti memenuhi syarat standar, termasuk jaminan stabilitas sebagai produk
kefarmasian umumnya (Anonim, 2000).
Uji standarisasi ekstrak yang dilakukan yaitu :
a) Uji Organoleptik
Hasil uji organoleptik ekstrak daun cengkeh berbentuk cairan ekstrak berwarna
coklat pekat dengan rasa pahit beraroma bau khas, sedangkan pada daun pepaya
berbentuk cairan kental berwarna hijau kehitaman dengan rasa pahit beraroma bau
khas (Anonim, 2000).
b) Susut Pengeringan
Penetapan susut pengeringan ekstrak merupakan salah satu parameter non
spesifik yang tujuanya memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya
senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Parameter susut pengeringan pada
dasarnya adalah pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada temperatur 1050C
selama 30 menit hingga berat konstan, yang dinyatakan sebagai nilai persen
 (Anonim, 2000). Nilai minimal atau rentan yang diperbolehkan terkait dengan
kemurnian dan kontaminasi, angka yang dipersyaratkan tidak boleh lebih dari 10%
(Anonim, 2000). Berdasarkan hasil penelitian diperoleh nilai susut pengeringan
ekstrak daun cengkeh yaitu 1,41% dan nilai susut pengeringan ekstrak daun pepaya
yaitu 1,01%. Hasil dari susut pengeringan ini sesuai dengan literatur secara umum
yang menyatakan bahwa nilai susut Penetapan susut pengeringan ekstrak
merupakan salah satu parameter non spesifik yang tujuanya memberikan batasan
maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses
pengeringan.
c) Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan untuk memberikan batasan minimal atau rentang
tentang besarnya kandungan air didalam bahan. Hasil uji kadar air daun cengkeh
adalah 6,06% dan daun pepaya adalah 2,19%. Hasil uji kadar air daun cengkeh dan
daun pepaya telah memnuhi syarat dimana persyaratan kadar air tidak boleh lebih
dari 10% (Anonim, 2000).
d) Kadar Abu
Penetapan kadar abu total bertujuan untuk memberikan gambaran kandungan
mineral baik senyawa organik maupun anorganik yang berasal dari proses awal
sampai terbentuk ekstrak sedangkan tujuan penetapan kadar abu tidak larut asam
adalah mengevaluasi ekstrak terhadap bahan-bahan yang mengandung silika seperti
tanah dan pasir (Saifudin, dkk., 2011). Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh
kadar abu total pada ekstrak daun cengkeh 0,11%, kadar abu tidak larut asam -
59%, sedangkan pada ekstrak daun pepaya sebesar 0,9% dan kadar abu tidak larut
asam -69%. Kadar abu larut asam mempunyai nilai lebih kecil dari kadar abu total
karena dalam mineral atau logam yang ada dalam kadar abu larut asam hanya
logam-logam tertentu saja yang masih ada. Kadar abu maupun kadar abu tidak
larut asam yang diperoleh nilai kecil berarti tidak tercemar oleh logam maupun
logam berat karena pada proses pemanasan pada uji akan menghilangkan logam
berat (Alegantina, dkk., 2013).
4. Skrining Fitokimia
Hasil skrining fitokimia menunjukan bahwa ekstrak daun cengkeh mengandung
flavonoid, alkaloid, tanin, saponin, steroid, hasil uji sesuai dengan penelitian lain yang
menunjukan bahwa ekstrak daun cengkeh mengandung flavonoid, alkaloid, saponin,
tanin, dan steroid (Sudibyo, dkk., 2002; Yunita, dkk., 2009). Sedangkan ekstrak daun
pepaya mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, steroid, triterponoid, hasil ini sesuai
dengan penelitian lain yang yang menunjukan bahwa ekstrak daun pepaya
mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, steroid dan triterponoid (Sudibyo, dkk.,
2002; Yunita, dkk., 2009).
5. Hasil Uji Toksisitas Metode BSLT
Uji toksisitas dengan menggunakan metode BSLT merupakan uji toksisitas akut
dimana efek toksik dari suatu senyawa dapat ditentukan dalam waktu singkat yaitu
rentang waktu 24 jam setelah pemberian dosis. Metode BSLT dipilih karena efek
toksik dari suatu senyawa dapat ditentukan dalam waktu singkat, mudak dikerjakan,
murah cukup akurat, hanya membutuhkan sejumlah kecil material uji dan memiliki
tingkat kepercayaan hingga 95% suatu senyawa dikatakan bersifat toksik jika LC50
<1000 µg/ml (Mayer, dkk., 1982) yaitu konsentrasi dimana suatu senyawa dapat
menyebabkan terjadinya 50% kematian hewan uji larva Artemia salina Leach.
Pembuatan air laut buatan yang dibuat dengan menggunakan 20 gram garam yang
dilarutkan dalam 1 L air, dan ditambah NaHCO3 (Natrium Bikarbonat atau soda kue),
selanjutnya di cek pH hingga mencapai pH 8-9 karena pH tersebut baik untuk
kelangsungan hidup Artemia salina Leach (Reskianingsih, 2014), NaHCO3 digunakan
agar menjaga pH tetap pada range 8-9. Kemudian air laut buatan disaring dengan
menggunakan kertas saring dengan tujuan untuk memisahkan dari pengotor yang
dimungkinkan terdapat dalam air laut buatan. Digunakan air laut buatan sebagai
kontrol negatif untuk melihat apakah respon kematian dari sampel dan bukan dari air
laut buatan (Mutia, 2010).
Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah Artemia salina Leach yang
berusia 48 jam karena memiliki saluran pencernaan yang terbentuk lengkap sehingga
peka terhadap suatu zat yang dimasukan, penggunaan Artemia salina Leach dalam
metode BSLT karena Artemia memiliki kesamaan tanggapan/respon dengan mamalia,
misalnya DNA- dependent RNA polymerase serupa dengan yang terdapat pada
mamalia dan organisme yang memiliki ouabaine sensitive Na+ dan K+ dependent
ATPase. Jika RNA polymerase dihambat, maka DNA tidak dapat mensintesis RNA
dan DNA tidak dapat terbentuk sehingga sintesis protein juga terhambat. Protein
merupakan komponen utama sel yang berfungsi sebagai unsur struktur, hormon,
imunoglobulin dan berperan dalam transport oksigen. Jika protein tidak terbentuk
maka metabolisme sel terganggu dan pada akhirnya dapat menyebabkan kematian sel
(Panjaitan, 2011).
Proses penetasan telur menjadi larva membutuhkan penerangan untuk pencahayaan
agar larva bergerak ke tempat yang terang karena larva bersifat fitotropik (Amaliya,
dkk., 2013), penetasan juga membutuhkan aerator sebagai sumber oksigen untuk
kalangsungan hidup Artemia. Larva udang Artemia salina Leach yang baru menetas
berwarna kemerah-merahan dan masih mengandung cadangan makanan sehingga
Artemia dapat bertahan hidup selama ±2 hari setelah menetas tanpa diberi makanan.
Kriteria standar untuk menilai lematian larva udang Artemia salina Leach tidak
menunjukan pergerakan selama 10 detik pada saat observasi (Resty dan Fita, 2017).
Untuk mencari nilai LC50 yang akurat perlu dibuat beberapa dosis yang mematikan,
konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini yaitu 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150
ppm, 200 ppm dan 300 ppm dan dibuat kontrol negatif berupa air laut dan larva
Artemia salina Leach tanpa penambahan ekstrak untuk menguji pengaruh air laut
maupun faktor lain yang berpengaruh terhadap kematian larva sehingga dapat
dipastikan bahwa kematian larva hanya karena pengaruh ekstrak yang ditambahkan
(Zaki, 2015).
Penelitian ini dilakukan dengan 3 kali pengulangan (triplo) untuk mendapatkan
data yang lebih baik dan lebih akurat. Masing-masing konsetrasi dan kontrol negatif di
isi 10 ekor larva, sehingga larva yang digunakan bejumlah 180 ekor untuk setiap kali
perlakuan. Presentase kematian larva Artemia salina Leach pada setiap sampel
masing-masing konsentrasi ekstrak etanol daun Cengkeh (Syzygium aromaticum L)
dan daun pepaya (Carica papaya L) menunjukan bahwa berbagai konsentrasi
memperlihatkan pengaruh yang berbeda terhadap kematian larva Artemia salina
Leach.
LC50 merupakan indikasi ketoksikan suatu bahan atau senyawa yang dapat
menyebabkan kematian 50% pada hewan uji. Semakin besar nilai LC50 berarti
menunjukan toksisitasnya semakin kecil dan sebaliknya semakin kecil nilai LC50
semakin besar toksisitasnya (Nisfi, 2010).
Nilai LC50 dari ekstrak etanol daun cengkeh, daun pepaya dan kombinasi ekstrak
daun cengkeh dan daun pepaya dengan perbandingan (1:1) berturut-turut 89,841
µg/mL; 38,244 µg/mL; dan 73,229 µg/mL. Hasil LC50 kurang dari 1000 µg/mL maka
ketiga bahan uji dapat dinyatakan memiliki aktivitas toksisitas. Mayer, dkk., (1982)
menyatakan bahwa suatu ekstrak dikatakan memiliki aktivitas antikanker jika nilai
LC50 kurang dari 1000 µg/mL setelah waktu kontak 24 jam. Tingkat toksisitas suatu
ekstrak jika LC50 ≤ 30 µg/mL artinya sangat toksik, LC50 ≤ 1000 µg/mL artinya toksik,
dan LC50 ≥ 1000 µg/mL tidak toksik. Gambar 4.4 menunjukan bahwa ketiga bahan uji
memiliki efek toksisitas pada larva Artemia salina Leach yang dapat dilihat dari nilai
LC50. kombinasi ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya dengan perbandingan (1:1)
memiliki nilai LC50 lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak tunggal daun pepaya
dan lebih besar di bandingkan ekstrak tunggal daun cengkeh.
Daun cengkeh mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, dan steroid
Sedangkan daun pepaya mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, steroid,
triterponoid. Campuran kombinasi ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya yang
mengandung senyawa metabolit dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dan
penggabungan kedua jenis tanaman tersebut dapat meningkatkan aktivitas toksisitas.
Mekanisme kematian larva Artemia salina Leach berhubungan dengan fungsi
senyawa alkaloid dan flavonoid menghambat daya makan larva. Cara kerja senyawa-
senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun
perut, apabila senyawa-senyawa ini masuk kedalam tubuh larva, alat pencernaanya
akan terganggu. Senyawa ini akan menghambat reseptor perasa pada daerah mulut
larva. Hal ini mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak
mampu mengenali makananya dan akibatnya larva mati kelaparan (Putri, dkk., 2012).
Menurut woo, dkk., (2013) mekanisme flavonoid sebagai antioksidan melalui
mekanisme pengaktifan jalur apoptosis sel kanker, mekanisme apoptosis sel pada teori
ini akibat fragmentasi DNA. Fragmentasi ini diawali dengan dilepasnya rantai
proksimal DNA oleh senyawa oksigen reaktif seperti radikal hidroksil, selain itu
flavonoid sebagai penghambat proliferasi tumor atau kanker yang salah satunya
dengan menginhibisi aktivitas protein kinase sehingga menghambat jalur transduksi
sinyal dari membran ke sel inti, dengan menghambat aktivitas reseptor tirosin kinase,
karena aktivitas reseptor tirosin kinase yang meningkat berperan sebagai pertumbuhan
keganasan. Flavonoid juga dapat mengurangi resistensi tumor terhadap agen
kemoterapi (Muaja, dkk., 2013).
Hasil nilai LC50 masing-masing kelompok perlakuan dengan 3x replikasi yaitu
ekstrak daun cengkeh, daun pepaya dan kombinasi ekstrak daun cengkeh dan daun
pepaya diuji normalitasnya dengan uji Komogorov-Smirnov Test. Berdasarkan hasil uji
Komogorov-Smirnov Test dapat dikatakan terdistribusi normal, karena nilai
probabilitas > 0,05, maka Ho diterima. Diketahui normalitas LC50 uji toksisitas pada
Artemia seluruh sampel didapatkan harga signifikan 0,475 > 0,05. Selanjutnya diuji
homogenitas Levene Statistic nilai probabilitas 0,711. Probabilitas > 0,05 maka Ho
diterima artinya data homogen. Data terdistribusi normal dan data homogen maka uji
dilanjut dengan ANOVA.
Berdasarkan perhitungan ANOVA dilakukan anlisis data secara statistik
menggunakan SPSS 21 sehingga data yang diperoleh lebih akurat. Tahap pertama
yang dilakukan uji normalitas data yang selanjutnya dilakukan uji homogenitas. Hasil
uji normalitas menyatakan bahwa nilai signifikan sebesar 0,978 > 0,05 jadi dapat
disimpulkan bahwa data terdistribusi normal. Selanjutnya dilakukan uji homogenitas
diperoleh nilai signifikan 0,711 > 0,05 jadi dapat disimpulkan bahwa data homogen.
Data terdistribusi normal dan data homogen artinya bahwa tidak ada perbedaan antara
kombinasi ekstrak daun cengkeh dan daun pepaya terhadap larva Artemia salina
Leach maka nilai uji semua sampel tidak di uji lanjut dengan uji LSD (Least
Significant Different).
KESIMPULAN
1. Ekstrak etanol daun cengkeh dan daun pepaya, memiliki efek toksisitas terhadap larva
Artemia salina Leach dengan nilai LC50 berturut-turut 89,841 µg/mL dan 38,244
µg/mL.
2. Kombinasi ekstrak etanol daun cengkeh dan daun pepaya (1:1) memiliki efek
toksisitas terhadap larva Artemia salina Leach dengan nilai LC50 73,229 µg/mL.

DAFTAR PUSTAKA
Alam, G. (2002). Bhrine Shrimp Letholity Test (BSLT) Sebagai Senyawa Bioaktif dari
Bahan Alam. Majalah Farmasi dan Farmakologi. Jurusan Farmasi MIPA
Universitas Hasanuddin. 6(2): 432-435.

Anas Y, Puspitasari N, Nuria MC,(2013). Aktivitas Stimulansia Ekstrak Etanol dan Daun
Cengkeh Pada Mencit Jantan Galur Swiss Beserta Identifikasi Golongan
Senyawa Aktifnya. Publikasi Ilmiah.10:13.

Evirza TD, (2013). Daya Hambat Ekstrak Bunga Cengkeh (Syzygium aromaticum)
Terhadap Trichophyton mentagrophytes Dan Candida albicans Secara In Vitro.
Jakarta: Fakultas Farmasi Universitas Pancasila. Skripsi. h.38.

Lisdawati, V. Wiryowidagdo, S., and Kardono, L.B.S. (2006). Brine Shrimp Lethality
Test (BSLT) dari Berbagai Fraksi Ekstrak Daging Buah dan Kulit Biji Mahkota
Dewa (Phaleri macrocarpa). Buletin Penelitian Kesehatan. 34(3). 111-118.

Mahmood, A.A., Sidik, K., Salmah, I. (2005). Wound healing activity of Carica papaya
leaf extract in rats. International Journal of Molecular Medicine and Advance
Sciences, 1(4), 398-401.

Mangan, Y.(2009). Solusi Sehat Mencegah dan Mengatasi Kanker Cetakan Pertama.
Jakarta : Agromedia Pustaka. Halaman viii dan 1.

Meyer, B.N. (1982). Brine shrimp: a convinient general bioassay for active plant
constituent. Planta Medica., 45: 31-4

Meyer, B.N, Ferrigni N.R, Putnam J.E, Nichols D.E, and Mc Laughlin J.L. (1982). Brine
Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents. Journal of
Medicinal Plant Research. Vol. 4.

Milind P, Deepa K. (2011). Clove: A Champion Spice. International Journal of Research

in Ayurveda & Pharmacy.;1:h.47-54.

Mu’nisa A, Wresdiyati T, Kusumorini N, Manalu W. (2012). Aktivitas Antioksidan

Ekstrak Daun Cengkeh. Jurnal Veteriner.;13:272.

Otsuki, Dang, Kumagai, Kondo, Iwata, Morimoto. (2010). Aqueous extract of Carica
papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects.
Journal Ethnopharmacol, 127(3), 760-7.

Pratiwi, E. (2010). Perbandingan Metode Maserasi, Remaserasi, Perkolasi Dan

Reperkolasi dalam Ekstraksi Senyawa Aktif Andrographolide Dari Tanaman
 Sambiloto (Andrographis Paniculata (Burm.F.) Nees). Bogor Argricultural
University: Bogor: P.93-111.

Rorong JA. (2008). Uji Aktivitas Antioksidan Dari Daun Cengkeh (Eugenia
carryophyllus) Dengan Metode DPPH. Chemistry Progress; 1:111.

Sudibyo, Retno S. (2002). Metabolit Sekunder: Manfaat dan Perkembangannya

Dalam Dunia Farmasi. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada.

Sukardiman & Ekasari W. (2006). Uji Anti Kanker dan Induksi Apoptosis Fraksi
Kloroform dari Daun Pepaya (Carica papaya) Terhadap Kultur Sel Kanker.
Penelitian Kesehatan no 24. Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Sukardiman., R. Abdul dan P.N. Fatma. (2004). Uji Praskrining Aktivitas Antikanker
Ekstrak Eter dan Ekstrak Metanol Marchantia planiloba Stephdengan Metode
Uji Kematian Larva Udang dan Profil DensitometriEkstrakAktif. Majalah
Farmasi Airlangga.

Sukandar, D., Hermanto. S., Lestari. E. (2009). Uji Potensi Aktivitas Anti Kanker Ekstrak
Daun Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius Roxb.) Dengan Metode Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT). Jurnal KaryaTulis Ilmiah. 11(1): 32-38.