Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 

Keterlibatan S6K1 dalam fungsi mitokondria dan struktur dalam sel HeLa ☆ 
Jisoo Park a, b, Quangdon Tran sebuah, Kisun Mun sebuah, Kouhei Masuda b, So Hee Kwon c, 
Seon-Hwan Kim d, Dong-Hoon Kim e, George Thomas b, Jongsun Park a, b, ⁎ 
Departemen Farmakologi dan Ilmu Kedokteran, Sindrom metabolik dan Cell Signaling Laboratory, Balai Penelitian Ilmu 
Kedokteran, College of Medicine, Chungnam National Univer- sity, Daejeon 35.015 , Korea Selatan b metabolik Penyakit 
Institute, University of Cincinnati, Cincinnati, OH 45.437, USA c Departemen Farmasi, Fakultas Farmasi, Yonsei Institut Ilmu 
Farmasi, Universitas Yonsei, Incheon 21.983, Korea Selatan d Departemen Bedah Saraf, Institut Penelitian Kanker , College of 
Medicine, Chungnam National University, Daejeon 35.015, Korea Selatan e Departemen Farmakologi, Korea University 
College of Medicine, Seoul 02.841, Korea Selatan 
articleinfoabstract Pasal sejarah: Diterima Agustus 201 1 6 Diterima dalam bentuk direvisi 11 September 2016 Diterima 11 
September 2016 Tersedia online 12 September 2016 
☆  Inggris  dalam  dokumen  ini  telah  diperiksa  oleh  setidaknya  dua  editor  profesional,  baik  penutur  asli  bahasa  Inggris.  Untuk 
sertifikat, silakan lihat: sertifikat http://www.textcheck.com/ / NAFctX. 
⁎  Sesuai  penulis  di:  Departemen  Farmakologi  dan  Ilmu  Kedokteran,  Sindrom  Metabolik  dan  Cell Signaling Laboratory, Balai 
Penelitian Ilmu Kedokteran, College of Medicine, Chungnam National University, Daejeon 35.015, Korea Selatan. 
Alamat E-mail: insulin@cnu.ac.kr (J. Park). 
Fungsi  biologis  utama dari mitokondria adalah untuk menghasilkan energi sel melalui fosforilasi oksidatif. Terlepas dari respirasi 
sel,  mitokondria  juga  memainkan  peran  kunci  dalam  proses  signaling,  termasuk  penuaan  dan  metabolisme  cer  bisa-.  Telah 
terbukti  bahwa  tikus  S6K1-KO  resisten  terhadap  obesitas  karena  meningkatkan  dation  beta-oxi-,  dengan  peningkatan  jumlah 
mitokondria  besar.  Oleh  karena  itu,  dalam  laporan  ini,  kemungkinan  keterlibatan  S6K1  dalam  mengatur  mitokondria  dinamika 
dan fungsi telah diteliti di stabil lenti-shS6K1-HeLa 
Kata kunci:fisi S6K1Mitokondria. 
sel Menariknya, sel HeLa S6K1-stabil habis menunjukkan perubahan phenotypical di mitokondria morfologi. Pengamatan ini 
selanjutnya dikonfirmasikan dengan analisis citra rinci bentuk mitokondria. Sesuai perubahan ular molec- juga diamati pada 
sel-sel ini, seperti induksi protein fisi mitokondria (Drp1 dan mTOR sinyal 
Fis1). Konsumsi oksigen meningkat pada sel HeLa S6K1-depeleted dan sel FL5.12. 
Selain itu, metabolisme S6K1 penipisan Energi 
mengarah  ke  peningkatan  produksi  ATP  dalam  sitoplasma  dan  mitokondria.  Namun,  rasio  relatif  ATP  chondrial  mito-  ke 
sitoplasma  ATP  sebenarnya  menurun  dalam  sel  lenti-shS6K1-HeLa  dibandingkan  dengan  sel  kontrol.  Ly  terakhir-,  induksi 
mitophagy  ditemukan  dalam  sel-shS6K1-HeLa  lenti  dengan  perubahan  yang  sesuai  bentuk  mitokondria  analisis  mikroskop 
elektron.  Secara  bersama-sama,  hasil  kami  menunjukkan  bahwa  S6K1  terlibat  dalam  regulasi mitokondria morfologi dan fungsi 
dalam sel HeLa. Penelitian ini akan memberikan wawasan baru ke dalam fungsi S6K1 di sinyal seluler mitokondria-dimediasi. 
© 2016 Elsevier Inc All rights reserved. 
1. Pendahuluan 
Mitokondria  adalah  sumber  penting  energi  untuk  sel.  Oleh  karena  itu,  mereka  mewakili  organel  intraseluler  penting  dalam 
sebagian  besar  jenis  sel.  Mitokondria  juga  memainkan  peran  kunci  dalam  inisiasi apoptosis, dan melibatkan diri dalam berbagai 
kondisi  patologis  termasuk  kanker,  generasi  neurode-,  penuaan,  dan  peradangan  [1].  Berikut  teori  Warburg  tentang  perubahan 
metabolisme  dalam  menanggapi  produksi  glikolitik  dari  ATP,  meskipun de- kehadiran oksigen dalam sel tumor, mutasi mtDNA 
dan  disfungsi  tochondrial  Mi-  telah  diteliti  secara  luas  untuk  mengeksplorasi  mekanisme  kerusakan  yang  mendasari  rantai 
pernapasan, yang 
memaksa  sel-sel  untuk  meningkatkan  glikolisis  untuk  menjaga  pasokan  ATP mereka [2]. Konversi glukosa menjadi laktat, yang 
dapat  terjadi  pada  sel-sel  normal  di  bawah  kondisi  hipoksia,  masih  terjadi  di  jaringan  kanker  meskipun kehadiran oksigen yang 
biasanya  akan  mencegah  glikolisis  melalui  efek  Pasteur.  Sekarang  jelas  bahwa  persisten  glikolisis  aerobik  di  sel-sel  kanker 
tertentu dikaitkan dengan aktivasi onkogen atau inaktivasi penekan tumor [3,4]. 
Fungsi mitokondria sebagai regulator penting dari kematian sel, termasuk apoptosis dan nekrotik. Oleh karena itu, kontrol dari 
mitokondria  harus  diatur  secara  ketat  untuk  mencegah  kematian  sel  [5].  Selain  itu,  mitophagy  dianggap  sebagai  proses  kunci 
pengendalian  kualitas,  yang  merupakan  bagian  selektif  autophagy  untuk  menghapus  rusak  atau  yang  tidak perlu chondria mito- 
[6].  Mitokondria  adalah  organel  dinamis  yang  selalu  secara  eksperimental  ence  fisi  dan  fusi.  Dinamika  mitokondria  ini 
diperlukan  untuk  adaptasi  sel  untuk  mengubah  kondisi  yang  diinginkan  untuk  pertumbuhan  sel,  sion  divi-,  dan  distribusi 
mitokondria  selama  diferensiasi  [7].  Mito-  fusion  chondrial pada mamalia dimediasi oleh protein fusi mitofusin 1 (Mfn1), Mfn2, 
dan atrofi optik 1 (OPA1). Mfn1 dan 
http://dx.doi.org/10.1016/j.cellsig.2016.09.003 0898-6568 / © 2016 Elsevier Inc All rights reserved. 
Isi daftar tersedia diScienceDirect 

Seluler 
homepage jurnalSignaling:www.elsevier.com/locate/cellsig 
 
Mfn2  yang  terkait  Dynamin  GTPases diperlukan untuk fusi membran tochondrial Mi- luar. OPA1 juga GTPase terkait Dynamin, 
dipersyaratkan  ulang  untuk  fusi  dari  membran  mitokondria  bagian  dalam  [8].  Fisi  mitokondria  dimediasi  oleh  terkait  Dynamin 
protein  1  (Drp1),  yang  merupakan  GTPase  besar.  Drp1  adalah  protein  sitosol  yang  dapat  translokasi  ke  membran  mitokondria 
bagian  luar,  yang  menyebabkan  fisi  mitokondria.  Drp1  berinteraksi  dengan  empat  reseptor  mitokondria  teins  pro:  fisi  1  (Fis1), 
faktor  mitokondria  fisi  (MFF),  dan  mitokondria  dinamika  protein  dari  49 kDa dan 51 kDa (MiD49 dan MiD51, masing-masing) 
[9-11]. 
Protein  ribosom S6 kinase beta-1 (S6K1, juga dikenal sebagai p70S6 kinase-p70S6K1) adalah suatu protein kinase yang dapat 
memfosforilasi  S6,  yang  mengarah  ke  sintesis  protein  pada  ribosom  [12].  S6K1  bertindak  hilir  PI3K  jalur  sinyal  [13].  Telah 
terbukti  bahwa  tikus  S6K1-kekurangan  yang  tahan  terhadap  obesitas  karena peningkatan beta-oksidasi [14]. Penghambatan atau 
penghapusan  S6K1  juga  mengakibatkan  produksi  tertunda  dari  sel-sel  lemak  dengan  menghalangi  tahap  awal  pembentukan 
adiposit.  Ini  puncak-Cates  bahwa  fungsi S6K1 di adiposit dikaitkan dengan obesitas [15]. S6K1 juga terlibat dalam pemanjangan 
otot  dan  pertumbuhan  [16].  Ketidak  tive  S6K1  dapat  mengikat  faktor  inisiasi  eukariotik  3  (eIF3)  dan  menghilangkan  adanya 
kemungkinan  oleh mTOR / fosforilasi Raptor-dimediasi. Yang dihasilkan S6K1 bebas dapat memfosforilasi target hilir, termasuk 
S6 [17,18]. 
Dalam  studi  saat  ini,  kami  menemukan  bahwa  lentivirus-dimediasi  S6K1  knock-  turun  mengakibatkan  mitokondria 
terfragmentasi  dengan  peningkatan  oksigen con sangkaan. Selain itu, penipisan S6K1 mengarah ke peningkatan produksi ATP di 
ATP  sitoplasma  dan  mitokondria.  Namun,  rasio  tive  eratnya  produksi  ATP  mitokondria  bergantung  menurun  dalam 
sel-shS6K1-HeLa  lenti  dibandingkan  dengan  kontrol  sel.  Secara  bersama-sama,  hasil  kami  jelas  menunjukkan  bahwa  S6K1 
mungkin terlibat dalam regulasi mitokondria morfologi dan fungsi dalam sel HeLa. 
2. Bahan dan metode 
2.1. Antibodi dan reagen 
Semua  antibodi  komersial  yang  dibeli  dari  berikut  ini:  Anti  S6K1  antibodi  (Abnova);  Anti-Mfn2,  anti-Opa1,  anti-Drp1  dan 
anti-Fis1  (Abcam);  Anti-VDAC,  anti-AIF,  anti-pT389-S6K1  dan  anti-COX4  (sel  signaling);  anti-Hsp60  dan  antibodi  anti-aktin 
(Sigma-Aldrich).  Horseradish  peroksidase-conjugated  anti-tikus  IgG  atau  anti-kelinci  IgG  antibodi  sekunder  yang  dibeli  dari 
Invitrogen. CCCP itu pur- dikejar dari Sigma-Aldrich. Rapamycin dan staurosporin yang pur- dikejar dari Calbiochem. 
2.2. Kultur sel dan stimulasi 
sel  HeLa  dipertahankan  dalam  dimodifikasi  Eagle  menengah  Dulbecco  (DMEM)  ditambah  dengan  10%  serum  janin  sapi, 2 
mmol  / L dari tamine glu-, 100 unit / mL penisilin, dan 100 mg / mL streptomycin (Life Technologies ). The shRNA membangun 
menargetkan  S6K1  dijelaskan  sebelumnya  [19].  Sel  HeLa  terinfeksi  pendek  jepit  rambut  non-silenc-  ing  (shNS)  atau 
shS6K1-Lentivirus  selama  24  jam.  Setelah  pemilihan  sel  dengan  0,5  mg  /  mL  puromycin,  dikumpulkan  baris  sel  stabil  untuk 
shNS  dan  shS6K1  didirikan.  Sel  FL5.12  IL-3  tergantung,  stabil  mengungkapkan shS6K1 adalah hadiah dari Dr David Plas [20]. 
Dalam  percobaan  lain,  sel-sel  HeLa  secara  sementara  transfected  dengan  gangguan  singkat  NS  RNA  (dosa),  siS6K1 RNA atau 
siS6K2  RNA  menggunakan  oligofectamine  (Invitrogen)  agen  kembali  mengikuti  petunjuk  yang  diberikan  oleh  produsen. 
Kemudian  sel-sel  ini diobati dengan 30 pM CCCP selama 1 jam, 1 pM Rapamycin selama 2 jam atau 10 pM Staurosporin selama 
2 jam. 
2.3. Analisis imunoblot 
Analisis  western  blot  dilakukan  sebagai  dijelaskan  sebelumnya  [21-23].  Setelah  selesai  kondisi  eksperimental,  sel 
ditempatkan di atas es dan diekstraksi dengan buffer lisis yang mengandung 50 mM Tris-HCl, 
1905 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 
pH  7,5,  1%  v  /  v  Nonidet  P-40,  120  mM  NaCl,  25  mM  sodium  fluoride,  40  mM  β-gliserol  fosfat,  0,1  mM  natrium 
orthovanadate,  1  mM  phenylmethylsulfonyl  fluoride,  1  mM  Benzamidine, dan 2 pM microcystin-LR. Total lisat sel diselesaikan 
oleh  15,  12  dan  10%  SDS-  PAGE  dan  ditransfer  ke  membran  Immobilon-P  (Millipore).  Filter  diblokir  selama 1 jam dalam 1 × 
tri-buffered  penyangga  saline  (TBS;  140  mM  NaCl,  2,7  mM  KCl,  250  mM Tris-HCl, pH 7,4), yang mengandung 5% susu skim 
dan  0,2%  Tween-20,  diikuti  oleh  inkubasi  semalam  dengan  antibodi  Firat  yang  tepat  diencerkan  1000  lipatan  pada  4  °  C. 
Antibodi  sekunder  horseradish  peroksidase-conjugated  anti-tikus  IgG  atau  anti-kelinci  IgG  (Invitrogen),  diencerkan  5000  kali 
lipat  dalam  buffer  blocking.  Deteksi  ekspresi  protein  divisualisasikan  oleh  chemiluminescence  ditingkatkan,  ac-  cording  untuk 
instruksi pabriknya (GE Healthcare, Biologi). 
2.4. Analisis pencitraan confocal 
sel  HeLa  ditumbuhkan  pada  coverslips  kaca  sampai  mereka  50%  sampai  70%  konfluen  dan  kemudian  transfected  dengan 
pDsRed2-Mito konstruksi (CLONTECH) dengan menggunakan Lipofectamine atau jet PEI reagen diikuti oleh tion infec- dengan 
GFP-LC3B  adenovirus.  Setelah  24  jam,  sel-sel  tetap  dalam  paraformaldehyde  4%  pada  suhu  kamar  selama  10  menit  dan 
permeabilized  di  0,2%  Triton  ×  100  selama  5  menit  pada  suhu  kamar.  Kemudian  coverslips  yang dipasang dengan Vectashield 
(Vector Laboratories, Burlingame, CA), dan divisualisasikan menggunakan Zeiss mikroskop confocal. 
2.5. Pengukuran konsumsi oksigen 
sel  HeLa  Stabil  (shNS  dan  shS6K1)  ditumbuhkan  selama  1  hari.  5  ×  105  sel  ditambahkan  ke  sumur individu piring 96-baik 
BD  Oksigen  Biosensor  System  (BD  Biosciences)  dalam  rangkap  tiga,  diikuti oleh DMEM untuk volume akhir 200ul per sumur. 
Cawan kemudian dipertahankan selama 30 menit pada 37 ° C dalam inkubator dilembabkan dengan 5% CO 
2. 
Piring  membaca  pada  Safire  multimode  lempeng  spektrofotometer pada 
10 menit interval untuk 170 menit. 
2.6. Fluoresensi-diaktifkan sel menyortir (FACS) analisis 
Analisis  aliran  cytometry  dilakukan  sebagai  dijelaskan  pra  viously  [24,25].  Massa  mitokondria  per  sel  diukur dengan FACS 
menggunakan  MitoTracker  Hijau  FM  (Molekuler  Probe).  Potensi  brane  mem-  mitokondria  dievaluasi  dengan 
tetramethylrhodamine,  etil  ester  (TMRE-Molekuler  Probe).  Spesies  oksigen  reaktif  mitokondria  (ROS)  diukur  dengan  2  ', 
7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (H 
2 
DCFDA).  Sel  HeLa  dikumpulkan  oleh  trypsinization,  ditangguhkan  dalam  0,5  mL  PBS,  diwarnai  dengan  100  nM 
MitoTracker  Hijau  FM,  100  nM  TMRE  atau  100  nM  DCFDA  selama  30  menit  pada  suhu  kamar  dalam  gelap  dan  dianalisis 
dengan FACS Calibur (BD Bioscience). 
2.7. ATP pengukuran dari kompartemen subselular 
Galur  ATP  diukur  dengan  Firefly-luciferase  konstruksi  (pcDNA3.1  /  Zeo-CHA-Luc)  dan  mitokondria  ATP  diukur  dengan 
Firefly-luciferase  membangun  terkonjugasi  dengan  menargetkan  COX8  mitokondria  urut  (pcDNA3.1  /  Zeo-CHA -COX 8-Luc) 
sebagai  dijelaskan  sebelumnya  [26].  Secara  singkat,  emisi  cahaya  diukur  dalam  luminometer  di  5-s  interval  sampai  nilai 
maksimum  pendaran  dicapai.  Untuk  menormalkan  untuk  variabilitas  ekspresi  luciferase  dalam  sel  transfected,  nilai-nilai 
pendaran  relatif  di  setiap  kompartemen  sel  yang  dinyatakan  sebagai  rasio  terhadap  total  potensi  pendaran  diukur  pada  Aliquot 
sama sel segaris sama dengan luciferase assay kit (Promega) di hadapan kelebihan ATP (konsentrasi akhir, 0,5 mmol / L). 
 
2.8. Mikroskop elektron transmisi 
sel HeLa Stabil (shNS dan shS6K1) yang tetap dalam larutan 2,5% glutaraldehid dengan Osmium Oxide 4 (Oso1% 
4) 
penyanggaselama  1  jam  pada  4  °  C,  dehidrasi  dengan  etanol  pada  suhu  4  °  C. 
Kemudian  sel  menyusup  dalam  1:  1  mix-  mendatang  propilena  oksida  dan  Epon  dan  akhirnya  tertanam  dalam  Epon  oleh 
lymerization po- pada 60 ° C selama 48 jam. Analisis ultrastructural dilakukan pada mikroskop elektron SPIRIT G2. 
2.9. Analisis 
statistikData  dinyatakan  sebagai  mean  ±  SE  dari  setidaknya  tiga  percobaan  terpisah.  Perbedaan  antara  kelompok  dianalisis 
menggunakan t-test dan P Pelajar b 0,05 (*) dianggap signifikan, dan pb 0,01 (**) dianggap sangat signifikan. Analisis kuantitatif 
dari hasil dilakukan dengan menggunakan Gambar J software (versi 1.45). 
1906 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 

A 
Lenti- shNS 
10ìm 
Lenti- shS6K1 
10ìm 

BCD 
S 
0.0 
Pemanjangan 
Heywood 
Kekompakan Shape Factor 
bundar Factor 
Shape 
Factor)timah U (rotcafep 
4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 
** 
3.0)timah U (rotcafe 
2,5 
2,0 

** 
0,0 shNS shS6K1 
shNS shS6K1 
0,6) timah U 
(0,5 

** 
1,5 
ROTC 
0,4 
1,0 
afe 
0,3 
ah 
1,0 0,5 
pah S 
0,5 
pah S 
0,2 
0,1 
0,0 (N = 40) (N = 30) (N = 40) ( N = 30) (N = 40) shNS shS6K1 
(N = 30) 
Gambar.  1.  Efek  S6K1  pada  mitokondria  morfologi  dalam  sel  HeLa.  (A)  Stabil  lentivirus-shNS  (Lenti-shNS)  atau  sel 
lentivirus-shS6K1  HeLa  (Lenti  -shS6K1)  ditumbuhkan  dalam  penutup  kaca  dan  secara  sementara  transfected  dengan 
pDsRed2-mito.  Setelah  24  h-posttransfection,  sel-sel  tetap  dan dianalisis dengan confocal mikroskop-pencitraan. hasil ini adalah 
wakil  dari  tiga  percobaan  independen.  Skala bar mewakili 10 sel um. (B) gambar-gambar confocal dari Lenti-shNS (n = 40) atau 
Lenti-shS6K1  (n  =  30)  yang  selanjutnya  dianalisis  untuk  morfologi  mitokondria.  faktor  Pemanjangan  bentuk  i  s  didefinisikan 
sebagai  akar  kuadrat  dari  rasio  dari  dua  momen  kedua  dari  partikel  sekitar  sumbu  utamanya.  (C)  Heywood  faktor  bundar 
didefinisikan  sebagai  fungsi  dari  perimeter  P  dan  daerah  A.  bundar  lingkaran  adalah  1.  (D)  faktor  bentuk  Kekompakan  adalah 
fungsi dari momen kedua kutub partikel dan lingkaran yang sama daerah A. kekompakan lingkaran adalah 1. hasilnya mean ± SD 
dari tiga percobaan independen. Asterisk, pb 0,05; ganda tanda bintang, pb 0,01. 
3. Hasil 
3.1. Pengurangan S6K1 di HeLa sel hasil di fisi mitokondria 
Berdasarkan  studi  fungsi  S6K1  dalam  diferensiasi  adiposit  awal  [15],  sel-sel  HeLa  stabil  untuk  S6K1  knockdown  yang 
dihasilkan  menggunakan  shS6K1-lentivirus.  Kami  mengamati  perubahan  morfologi  di  Dria  mitochon-  dalam  sel  HeLa 
S6K1-knowdowned  (Gambar.  1A)  berdasarkan  co-ekspresi  Mito  Red.  Oleh  karena itu, analisis citra rinci untuk bentuk chondria 
mito-  S6K1-dimediasi  dilakukan  di shS6K1-HeLa sel stabil menggunakan sever- metode al berbeda. Faktor bentuk perpanjangan 
didefinisikan  sebagai  akar  kuadrat  dari rasio dari dua momen kedua partikel sekitar sumbu ruh-prinsip nya. Nilai-nilai yang lebih 
rendah  dari  faktor  bentuk  elongasi  dalam  sel  shS6K1-HeLa  menunjukkan  mitokondria  yang  lebih  kecil  (Gambar.  1B).  Faktor 
bentuk  lain  yang  sangat  umum  adalah  Heywood  bundar  faktor  (Gambar.  1C),  yang  merupakan  tion  func-  dari  perimeter  P  dan 
daerah A. bundar lingkaran adalah 1, 
 
sedangkanuntuk  “bintang  laut”  footprint  jauh  b1  .  Faktor  bentuk  kekompakan  (Gambar.  1D)  adalah  fungsi  dari  momen  kedua 
kutub  dari  partikel  dan  lingkaran  daerah yang sama A. kekompakan lingkaran adalah 1, sedangkan pada penampang I-beam jauh 
b1.  Secara  bersama-sama,  hasil  analisis  citra  jelas  menunjukkan  bahwa  mitokondria  dari  sel-sel  HeLa  S6K1-  knockdown  lebih 
kecil  dan  lebih  terfragmentasi  daripada  (shNS)  sel  kontrol  non-dibungkam.  Untuk  lebih  mengevaluasi  tingkat  fragmentasi 
chondria  mito-,  sel  staurosporin-diperlakukan  disiapkan,  karena  diketahui  bahwa  perubahan  morfologi  mitokondria  selama 
apoptosis,  sehingga  lebih  kecil,  bulat,  dan  lebih  banyak  organel  [27,28].  Seperti  ditunjukkan  pada  Gambar.  2A,  tingkat 
fragmentasi mitokondria pada 
tahun 1907 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 

A 
shNS shS6K1 shNS + Stauro 
10ìm 

B 
Pemanjangan Shape Factor 
4,5 
4.0) timah U 
3.5 

* 
** 
(ro 
3.0 
tcaf 
2,5 
ep 
2,0 
ah S 
1,5 
1,0 
0,5 
0,0 
shNS shS6K1 
shNS + Stauro 
(N = 140) (N = 70) (N = 50) 
Gambar.  2.  Perbandingan  mitokondria  fragmentasi  antara  sel  shS6K1  dan  staurosporin-diperlakukan shNS sel. (A) shNS- Stabil 
atau  sel  shS6K1-HeLa  ditanam  di  cover-kaca  dan  yang  secara  sementara transfected dengan pDsRed2-mito. Secara terpisah, sel 
shNS-HeLa  diobati  dengan  10  pM  staurosporin  selama  2  jam  untuk  menginduksi  peristiwa  apoptosis.  Setelah  24  jam 
pasca-transfeksi,  sel-sel  dianalisis  dengan  confocal  mikroskop-pencitraan.  hasil  ini  perwakilan  dari  tiga  percobaan  independen. 
Skala  bar  mewakili  10  pM.  (B)  gambar-gambar  confocal  dari  shNS-  (n  =  40),  sel  shS6K1-HeLa  (n  =  70)  atau  staurosporin 
diperlakukan-Lenti-shNS  sel  dianalisa  lebih  lanjut  untuk  morfologi  mitokondria dengan metode faktor bentuk elongasi. hasilnya 
rata-rata SD ± tiga expe independen riments. Asterisk, pb 0,05; ganda tanda bintang, pb 0,01. 
sel  shS6K1  adalah  keadaan  antara  antara  bahwa  sel-sel  shNS  dan  staurosporin-diperlakukan  shNS  sel.  Faktor  bentuk  elongasi 
juga  menunjukkan  bahwa  ukuran  mitokondria  dalam  sel  shS6K1  adalah  penengah  antara  yang  di  sel  shNS  dan  sel  shS6K1 
staurosporin-diperlakukan (Gambar. 2B). 
3.2. Perubahan mitokondria dinamika terkait protein dalam sel shS6K1-HeLa 
Untuk  mengevaluasi  mekanisme  kemungkinan  tion  fragmentasi  mitokondria,  mitokondria terkait Dynamin protein, termasuk 
Mfn2, Opa1, Drp1, dan Fis1, dipantau. Analisis Western blot dari mitokondria 
 
1908 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 

A 
Anti-Opa1 
shNS shS6K1 
Anti-Mfn2 
nietorpfo 
250)%, ni 
200 
shNS shS6K1 
** 
** * Anti-Drp1 
(Anti-aktin 
R 
0 
Mfn2 Opa1 Drp1 Fis1 S6K1 

B 
Anti COX4 
Anti-Hsp60 
noisserp 
tcaotder 
150 
Anti-Fis1 
100 
Anti-S6K1 
xeevitale 
apmoc 
50 
 
**) 
shNS shS6K1 
Anti-VDAC 
Mito 
outer-%(niet 
200 180 
** 
shNS membran 
shS6K1 
Anti-AIF 
ruangantarmembran 
** 
Matrix 
0 R 
VDAC AIF COX4 Hsp60 

C 
mTOR 
UCP2 
orpfon 
160 140 
Mito innermembran 
ois 
120 
se 
100 rpxe 
80 60 
evi 
40 kisah 
20 
shNSshS6K1 
CPT1 
oksidasiLipid 
nietorp 
500 
PGC1- 
shNS 
Mitokondria 
f 
shS6K1 biogenesis 
Keterpisahan 
(0 
  
R)%,ni 
400 
** 
* 
mTOR CPT1 PGC1- pMyc Myc UCP2 
Gambar. 3. Pengaruh S6K1 pada mitokondria protein dinamis dalam sel HeLa. (A) Jumlah lisat sel dibuat dari shNS- atau 
shS6K1-HeLa sel. sampel ini untuk Western blotting menggunakan antibodi terhadap mitokondria dinamis protein (Mfn2, OPA1, 
Drp1 dan Fis1). Penipisan S6K1 dipantau dengan antibodi anti-S6K1 (panel kiri). (B ) Protein mitokondria termasuk VDAC 
(mitokondria outermembrane), AIF (mitokondria ruang antar), COX4 (mitokondria innermembrane) dan Hsp60 (matrix) 
dianalisis dengan Barat blotting (panel kiri). (C) metabolik protein terkait termasuk mTOR, CPT1 untuk oksidasi lipid, 
PGC1-alpha untuk mitokondria biogenesis, phospho-Myc dan UCP2 untuk uncoupling energi, juga dianalisis dengan blotting 
barat. Hasilnya wakil dari orang-orang dari tiga percobaan independen. (Kiri panel). Kepadatan relatif diperoleh dengan 
densitometri. Ekspresi relatif protein dihitung dengan menormalkan semua nilai densitometri dengan yang aktin di setiap jalur. 
Hasilnya rata-rata SD ± dari tiga percobaan independen. Asterisk, pb 0,05; ganda tanda bintang, pb 0,01. (Panel kanan). 
onois 
tcaot 
300 
** 
pMyc (T58 / S62) 
serp 
dera 
200 
Myc 
xe 
p 
aktin 
evitale 
100 moc 
 
rapamycin, protein terkait Dynamin mengungkapkan bahwa protein mitokondria fisi 
yang merupakan inhibitor diketahui mTOR 
sinyal, mengakibatkan (Drp1 dan Fis1) meningkat dalam sel shS6K1 (Gambar. 3A), sementara ada 
peningkatan konsumsi oksigen dibandingkan dengan 
kontrol yang tidak diobati ada perubahan signifikan dalam protein mitokondria fusi (Mfn2 dan 
sel-sel (Gambar. 4A). Mirip dengan pengamatan ini, 
penipisan S6K1 dipromosikan Opa1). Menariknya, protein mitokondria termasuk VDAC, AIF, 
peningkatan konsumsi oksigen dalam sel HeLa 
(Gambar. 4B). Konsisten dengan COX4, dan Hsp60 meningkat pada sel shS6K1 (Gambar. 3B), menunjukkan 
ini, hasil yang sama diperoleh dalam sel FL5.12 IL3 
tergantung dengan itu massa mitokondria dapat ditingkatkan dalam sel shS6K1. Untuk lebihin 
deplesi S6K1(Gambar. 4C), menunjukkan bahwa 
downregulation dari mTOR / vestigate perubahan metabolik mungkin dalam sel shS6K1,reg- metabolisme 
S6K1menandakan konsumsi oksigen meningkat dalam 
sel HeLa dan ulators, termasuk CPT1 dan UCP2, yang dipantau oleh Barat menghapuskan 
FL5.12 sel. analisis. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 
3C, ekspresi CPT1, yang terkait dengan oksidasi lipid, meningkat pada sel shS6K1 bersama-sama dengan PGC1a, yang dikenal 
untuk mengatur mitokondria biogenesis (Gambar. 3C, atas 2 
3.4. CCCP-dimediasi produksi ROS adalah meningkat 
dalam sel shS6K1-HeLa dan panel-3). Serupa dengan laporan sebelumnya [14], ekspresi UCP2 lebih tinggi dalam sel shS6K1 
dibandingkan dengan kontrol (bawah panel 2). Bagaimana- 
Untuk lebih mengevaluasi peristiwa terkait 
mitokondria, termasuk mito- pernah, tidak ada perubahan signifikan dalam molekul sinyal lain, di- 
massa chondria, mitokondria membran potensial 
(MMP) dan reaktif cluding mTOR dan Myc (Gambar. 3C). 
spesies oksigen produksi (ROS), sel-sel shS6K1 diberi label dengan penanda acara khusus dan dianalisa oleh sel 
fluoresensi-diaktifkan menyortir (FACS). Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5A, S6K1 protein yang menurunkan regulasi 3,3. 
Pengaruh mTOR / S6K1 sinyal pada konsumsi oksigen 
dalam sel shS6K1-HeLa. Perubahan massa mitokondria dipantau dengan pewarnaan sel dengan massa marker spesifik 
mitokondria, mito- Berdasarkan hasil sebelumnya kami (Gambar. 1-3), efek mTOR / S6K1 
GFP. Tidak ada perubahan signifikan dalam massa 
mitokondria dengan sinyal pada fungsi mitokondria dievaluasi dengan mengukur 
penipisan atau pengobatan sel dengan CCCP, yang 
dapat menyebabkan konsumsi oksigen dengan piring Oksigen Biosensor System (BDS6K16K1. 
mitokondria khusus autophagy (Gambar. 5B) Dalam 
Selain itu, tingkat yang sama Biosciences, San Jose, CA, USA). Pretreatment sel HeLa dengan 
MMP diamati di kedua shNS sel dan sel shS6K1, sementara 

AB 
sel-selHeLa tinuecnecseroulfevita 
12 
t 
0 
C 
0 
10 
Un Rapa 
inue 
12 
8 
CNEC 
10 
6 
sero 
8 
6 
4 
le R 
0 
ulfevita 
4 
2 
le R 
2 
shNSshS6K1) 
(sel memancarkan) nim (memancarkan FL5.12 tinuecn NIM 
16 
14 
ecs 
12 
ero 
10 
Ulf 
8 
EVIT 
6 
ale 
4 
R 
 
2 1 2 3 4 5 6 7 
Waktu (min, X10) 
Gambar.  4.  Perubahan  oksigen  konsumsi  oleh  mTOR  penghambatan  atau  deplesi  S6K1.  (A)  sel  HeLa  pra-perawatan  dengan  1 
pM  Rapamycin  selama  2 jam. volume yang sama dari sel dikemas dipisahkan menjadi Aliquot di sumur dari 96 sumur BD piring 
Oksigen  Biosensor.  The  fluoresensi  di  setiap  sumur  itu  direkam  dengan  Safire  multimode  lempeng  spektrofotometer.  hasilnya 
mean ± SD dari tiga percobaan independen. (B) shNS- atau shS6K1-stabil sel HeLa ditumbuhkan, dikumpulkan dan diukur untuk 
konsumsi  oksigen  dengan  BD  piring  oksigen  Biosensor.  (C)  shNS  stabil  -  atau  sel  shS6K1-FL5.12  ditumbuhkan,  dikumpulkan 
dan  diukur  untuk  konsumsi  oksigen  dengan  BD  Oxy  gen  Biosensor  piring.  Fluoresensi  di  setiap  sumur  tercatat  dengan  Safire 
multimode lempeng spektrofotometer. Hasilnya rata-rata SD ± dari tiga percobaan independen. 
1909 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 
 
pengobatan  CCCP  dapat  menurunkan  MMP  di  kedua  jenis  sel  (Gambar.  5C).  In-  terestingly,  ada  peningkatan  yang  signifikan 
dalam produksi ROS pada sel shS6K1 setelah perawatan CCCP, sementara tingkat ROS dalam kontrol 
1910 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 

AB 
C mitokondria Mem. 
D Potensial (TMRE) 
shNS 
shNS 
shNS 
shNS + CCCP 
+ CCCP (1 hr) 
(1 hr) 
shS6K1 
shS6K1 
shS6K1 + CCCP 
shS6K1 + CCCP (1 hr) 
(1 hr) 
Gambar.  5.Analysis  parameter  terkait  mitokondria  dalam  shNS  stabil  -  dan  sel  shS6K1-HeLa  (A)  analisis  Western  blot  untuk 
ekspresi  S6K1  dalam  sel  shNS-  dan  shS6K1-HeLa  stabil.  Hasilnya  wakil  dari  orang-orang  dari  tiga  percobaan  independen. 
Sel-sel  diperlakukan  dengan  30  uM  CCCP  selama  1  jam,  diikuti  dengan  pewarnaan  sel  (B) dengan pewarna MitoTracker Hijau 
FM  untuk  massa  mitokondria,  (C)  dengan  tetramethylrhodamine,  etil  ester  (TMRE) untuk potensial membran mitokondria, atau 
(D) dengan 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (H 
2 
D
CFDA) untuk produksi ROS. Setiap parameter mitokondria diukur dengan menggunakan aliran cytometry. Hasil ini adalah 
perwakilan dari tiga percobaan independen. 
shNS shS6K1 
S6K1 
aktin 
seltidak  berubah  secara  signifikan  setelah  pengobatan CCCP (Gambar 5D.); ini menunjukkan bahwa S6K1 mungkin memainkan 
peran diduga di CCCP-dimediasi produksi ROS. 

Mitokondria Mass (Mito-GFP) 

shNS 
shNS + CCCP (1 hr) 
shS6K1 
shS6K1 + CCCP (1 hr) 

mitokondria ROS (H 

2 
DCFDA) 
 
1911 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 
Stau A Rapa 
shNS shS6K1 
1 hr B 
(+) Con 2 jam S6K1 

S6K1 
aktin 
aktin 
shNS 
Kontrol 
shS6K1 
Rapa 1jam 
Stau 2 jam 
dosa 
siS6K1 
siS6K2 
Rapa 2 hr 

C 
dosa siS6K1 siS6K2 

S6K1 
aktin 
Gambar.  6.  Pengaruh  S6K2  pada  massa  mitokondria  dalam  sel  HeLa.  (A)  Stabil  sel shNS- dan shS6K1-HeLa dikumpulkan dan 
diwarnai  dengan  MitoTracker  Hijau  FM  pewarna  untuk  massa  mitokondria.  Sel-sel  terpisah  HeLa  pra-perawatan  dengan  1  pM 
Rapamycin  selama  1  jam,  diikuti  dengan  pewarnaan  sel  dengan  pewarna  MitoTracker  Hijau  FM.  Mitokondria  massa  diukur 
dengan  menggunakan  FACS.  Hasil  ini  adalah  perwakilan  dari  tiga  percobaan  independen.  Ekspresi S6K1 juga dipantau dengan 
antibodi  anti-S6K1  (panel  atas).  Sel  (B)  HeLa  pra-perawatan  dengan  1  pM  Rapamycin  selama  2  jam  atau  10  pM  Staurosporin 
selama  2  jam,  dilanjutkan  dengan  pewarnaan  sel  dengan  pewarna  MitoTracker  Hijau  FM.  Mitokondria  massa  diukur.  Hasil  ini 
adalah  perwakilan  dari  tiga  percobaan  independen.  Sel  (C)  HeLa  secara  sementara  transfected  dengan  dosa-dosa,  siS6K1  atau 
siS6K2  RNA-duplex.  Setelah  24  jam  pasca-transfeksi,  sel-sel  diwarnai  dengan  MitoTracker  Hijau  FM  pewarna  untuk  massa 
mitokondria. Mitokondria massa diukur. Hasil ini adalah perwakilan dari tiga percobaan independen. 

pS6K1 (T389) 
Rapa 2 jam 
 
3,5. S6K2 adalah pemain kunci dalam modulasi massa mitokondria dalam sel HeLa 
Untuk  lebih  mengeksplorasi  efek  mTOR  /  S6K1  sinyal  pada  massa  mitokondria,  shS6K1-HeLa  sel  stabil  dianalisis  dengan 
FACS  dengan  mitokondria  massa  penanda  tertentu,  mito-GFP  .  Seperti  ditunjukkan  pada  Gambar.  6A,  penghambatan  mTOR  / 
S6K1  sinyal  (rapamycin  atau  penipisan  S6K1)  tidak  mengubah  massa mitokondria. Namun, pengobatan sel dengan staurosporin 
mengakibatkan  ketinggian  massa mitokondria (Gambar. 6B, panel tom bot-), meskipun kedua rapamycin dan staurosporin efektif 
menghambat  S6K1  fosforilasi pada T389, menunjukkan aktivasi S6K1 (Gambar. 6B, panel atas). Menariknya, S6K2 deplesi oleh 
siS6K2 mampu 
1912 J. Taman et al. / Seluler Signaling 28 (2016) 1904-1915 

AB 
HA 
shNS shS6K1 
shNS shS6K1 
Rapa 
Rapa ha- Luciferase 
HA 
HA-COX8- Luciferase 
S6K1 
S6K1 
aktin 
aktin)% 
(tnuoma PTA 
EVIT) 
400 
-Rapa + Rapa 
0 
shNS shS6K1 R 
shNS shS6K1 
sitoplasma ATP mitokondria ATP 

CD 
A 
400 
-Rapa 300 
+ Rapa 
200% 
(tnuoma 
300 
100 
PTA e 
 
200 
vit 
100 le R 
ale 
0 
tnuom APTA lato T detal 
800 
R 
shNS shS6K1 shNS shS6K1 
-Rapa + Rapa 
Cyto-ATP Mito-ATP 
100% 
700 
600 
shNS shS6K1 shNS shS6K1 
-Rapa + Rapa 
Cyto-ATP Mito-ATP 
Gambar.  7.  Perubahan  produksi  ATP  intraseluler  di  shNS-  stabil  atau  sel  S6K1-HeLa.  stabil  shNS-  atau  S6K1-HeLa  sel secara 
sementara  transfected  dengan  (A)  pcDNA3.1  /  Zeo-CHA-Luc  atau  (B)  pcDNA3.1  /  Zeo-CHA-COX8-Luc  selama  24  jam.  sel 
HeLa pra-perawatan dengan 1 uM rapamycin selama 1 jam dan diukur untuk kegiatan luciferase. hasil mewakili rata-rata ± SD (n 
=  3)  dari  rasio  antara  sitoplasma  atau  mitokondria pendaran per Total potensi luminescence (yaitu, luminescence maksimal yang 
dapat  diperoleh  dengan  kelebihan  eksogen  ATP  dalam  sel  transfected  segaris). Ekspresi setiap protein dipantau (panel atas). (C) 
Hasil  mewakili  rata-rata  ±  SD  (n  =  3)  dari  akumulasi  pendaran  dari  pendaran sitoplasma dan mitokondria dalam tiga percobaan 
independen.  (D) Hasil mewakili rata-rata ± SD (n = 3) rasio persen relatif antara luminescence sitoplasma dan mitokondria dalam 
tiga percobaan independen. 
PT 
0 
neew 
500 
TEB 
400 
oit 
300 
R 
200 u 
100 
 evitalemucc 
A airdnohcotim / losotyc 
31 
peningkatan massa mitokondria dalam sel HeLa (Gambar. 6C), menunjukkan bahwa S6K2 penting untuk mengendalikan massa 
mitokondria dalam sel-sel ini. 
3.6. Produksi ATP meningkat pada sel shS6K1-HeLa 
Untuk  lebih  mengevaluasi  fungsi  mitokondria,  konsentrasi  ATP  di  toplasm  cy-  dan  mitokondria  diukur.  Menggunakan  dua 
ditargetkan  vektor  luciferase  ekspresi  [26],  jumlah  sitosol  dan  tingkat  ATP  mitokondria  diukur.  Secara  umum,  produksi  ATP 
ditingkatkan  dalam  sel  shS6K1-HeLa  (Gambar.  7A  dan  B),  terlepas  dari  penghambatan  mTOR  sinyal.  Total  ATP  juga  lebih 
tinggi pada sel shS6K1 (Gambar. 7C). Menariknya, rasio 
80% 
54 
60% 
69 
59 
70 
40% 
0% 
41 
30 20% 
46 
 
produksi  ATP  antara  sitoplasma  dan  mitokondria  menunjukkan  bahwa proporsi produksi ATP mitokondria sebenarnya menurun 
dalam  sel  shS6K1-HeLa  (Gambar.  7D).  Mitokondria-ATP:  rasio  sitoplasma-ATP  dalam  sel  shNS  HeLa  adalah  69%:  31%, 
sedangkan  mitokondria-ATP:  sitoplasma-ATP  dalam  sel  shS6K1-HeLa  adalah  59%:  41%; rasio ini tidak SETELAH fected oleh 
mTOR  inhibitor,  rapamycin,  menunjukkan  bahwa  S6K1  dapat  berfungsi  sebagai  saklar  metabolisme  terhadap  produksi  ATP 
mitokondria-dependent. 
3.7. Mitokondria spesifik autophagy ditingkatkan dalam sel siS6K1-HeLa 
Sejak  proporsi  produksi  ATP  mitokondria  bergantung  menurun  (Gambar.  7D),  mitokondria spesifik autophagy adalah moni- 
tored  menggunakan  adenovirus  GFP-LC3  (autophagy  penanda)  dan  tetramethylrhodamine  etil  ester  (  Red-TMRE;  mitokondria 
spesifik dye), sel-permeant, kationik, pewarna fluorescent merah-oranye yang read ily diasingkan oleh mitokondria aktif. Analisis 
gambar  mikroskopis  confocal  sel  lenti-shS6K1-HeLa  mengungkapkan  bahwa  tumpang  tindih  antara  GFP-LC3  dan  sinyal 
Merah-TMRE  secara  signifikan meningkat dibandingkan dengan yang di lenti-shNS sel kontrol (Gambar. 8A), seperti ditegaskan 
oleh  analisis  kuantitatif  confocal  gambar  (gambar.  8B).  Selanjutnya,  mikroskop elektron menunjukkan bahwa mitokondria yang 
menyimpang  atau  tidak  berfungsi  meningkat  dalam  sel  lenti-shS6K1-HeLa,  sedangkan  mitokondria  sehat  yang melimpah di sel 
lenti-shNS HeLa (Gambar 8C.); this indicates that S6K1 is required for mitophagy and mitochondrial function. 
4. Discussion 
S6  kinase  1  (S6K1)  modulates  nutrient  and  growth  factor  signals  to  control  cell  growth and survival [29]. S6K1 also plays a 
role  in  regulating  energy  metabolism  in  vivo,  since  S6K1-knockout  mice  are resistant to obesity due to enhanced beta-oxidation 
with  an  increased  number  of  large  mitochondria  [14].  Unexpectedly,  it  has  been  found  in  studies  of  S6K1  function  in  early 
adipocyte  differentiation  that  S6K1  depletion  re- sults in mitochondrial fragmentation in lenti-shS6K1-HeLa cells (Figs. 1 and 2) 
[15].  Therefore,  a  detailed  analysis  of  S6K1  function  in  mitochon-  dria  morphology  and  function  was  further  conducted. 
Confocal  micro-  scopic  analysis  with  mitochondria-specific  marker  (mito-Red)  showed  that  S6K1  depletion  promoted 
mitochondria  fragmentation  compared  to  controls  cells  (Fig.  1A).  Further analysis of mitochondrial images from lenti-shNS and 
lenti-shS6K1  stable  cells,  with  several  different  methods,  supported  that  S6K1  reduction induced mitochondrial frag- mentation 
(Fig.  1B–1D).  However,  the  levels  of  mitochondria  fragmen-  tation  in  lenti-S6K1  HeLa  cells  were  lower  than  in 
staurosporin-treated  HeLa  cells  (Fig.  2A).  This  result was further confirmed by the analysis of elongation shape factor (Fig. 2B), 
which  indicated  that  S6K1-mediated  mitochondrial  fragmentation  differs  from  apoptosis-induced  mitochon-  dria  fission. 
Furthermore,  mitochondria-fission  proteins,  including  Drp1  and  Fis1,  were  increased  in  S6K1-depelted cells (Fig. 3A), whereas 
there  was  no  obvious  change  in  the  levels  of  mitochondria  fusion  proteins  (Mfn2  and  Opa1);  this  explains  the  phenotypical 
changes  of  mitochondria  in  shS6K1  cells.  With  respect  to S6K1 function in mi- tochondria, Rajapakse and colleagues suggested 
that  hyperactive  S6K1  in  eNOS  uncoupling  leads  to  endothelial  dysfunction  and  vas-  cular  aging  [30].  They  also  showed  that 
resveratrol-  or  rapamycin-  mediated  S6K1  inhibition  rescued  endothelial  NO  production,  sug-  gesting  that  S6K1  function  is 
associated  with  mitochondria  function.  In  addition,  it  has  been  shown  that  resveratrol  treatment  protects  mice  against 
diet-induced-obesity and insulin resistance [31]. In agreement with these previous studies [14], our results (Fig. 3B) demonstrated 
that  reduction  in  S6K1  leads  to  the  induction  of  mito-  chondrial  proteins  including  VDAC,  AIF, COX4, and Hsp60 in shS6K1- 
HeLa  cells,  indicating  that  mitochondria  mass  may  be  increased  in  shS6K1-HeLa  cells.  Furthermore,  consistent  with  previous 
reports [14], UCP2 expression is higher in shS6K1-HeLa cells compared to controls (Fig. 3C, bottom 2nd panel). 
1913 J. Park et al. / Cellular Signalling 28 (2016) 1904–1915 
Schieke  and  colleagues  showed  that  siRNA-mediated  S6K1  knockdown  did  not  change  the  oxygen consumption in Jurkat T 
cells  [32]. In contrast to these results, treatment of HeLa cells with rapamycin promoted the enhancement of oxygen consumption 
(Fig.  4A).  In addition, shS6k1-HeLa cells showed increased oxygen consumption (Fig. 4B). Similar results were also observed in 
stable  shS6K1-FL5.12 cells, which are hematopoietic (Fig. 4C). It will be in- teresting to explore this discrepancy in different cell 
types. 
To  further  investigate  the  putative  S6K1-mediated regulation of mito- chondrial events, a mitochondria-event specific marker 
was  used  for  FACS  analysis  with  shS6K1-HeLa  cells.  In  contrast  to  Fig.  3B,  there  were  no  obvi-  ous  changes  in mitochondria 
mass  in  shNS-  and  shS6K1-HeLa  cells.  The  treatment of cells with CCCP, which can induce mitochondria-specific au- tophagy, 
was  not  able  to  change  the  mitochondria  mass  in  these  cells  (Fig.  5B).  The  MMP  was  also  not  significantly  altered  under 
S6K1-depeleted  conditions  (Fig.  5C).  However,  CCCP-induced  ROS  production  is  more  sen-  sitive in shS6K1-HeLa cells (Fig. 
5D),  indicating  that  S6K1  is  important  in  CCCP-mediated  ROS  production.  Unexpectedly,  we  observed  an  effect  of  S6K2  on 
mitochondria  mass  changes,  whereas  S6K1  depletion  or  rapamycin  treatment  has a negligible effect on mitochondria mass (Fig. 
6C).  It  has  been  suggested  that  mTOR  signaling  is  regulated  by  the  levels  of ATP in cells, independent of amino-acid signaling 
[33],  thus,  mTOR  acts  as  an  ATP  sensor.  In  this  regard,  ATP  levels  in  shS6K1-HeLa cells were increased in the cytoplasm and 
mitochondria  compared  to  controls  (Fig.  7A  and  B).  Similarly,  total  ATP  was  increased  in  shS6K1-HeLa  cells  (Fig.  7C). 
However,  the  ratio  of  ATP  production  between  cytoplasm  and mitochondria was altered in S6K1-depeleted cells (Fig. 7D), sug- 
gesting  that  mitochondria-dependent  ATP  production  decreased  in  shS6K1-HeLa cells due to mitochondria fragmentation (Figs. 
1 and 2). Interestingly, treatment of cells with rapamycin did not affect S6K1-mediated ATP control, suggesting that S6K1 kinase 
activity  is  not directly involved in regulating ATP levels in these cells (Fig. 7). These results suggest that S6K1 may function as a 
metabolic  switch  toward  mitochondria-dependent  ATP  production  in  an  mTOR  signal-  ing-independent  manner.  It  has  been 
well-established  that  inhibi-  tion  of  mTOR  signaling  is  required  for  the  first  step  of  autophagy  [34].  Similarly 
mitochondria-specific  autophagy  was  increased  in  siS6K1-trtasfected  cells  (Fig.  8A)  with  the  statistical  significance  (Fig.  8B). 
Transmission  electron  microscopy  (TEM)  further  con-  firmed  the  presence  of  malfunctioning  mitochondria  and  mitophagy  in 
these  cells  (Fig.  8C).  Talaber  and  colleagues  have recently reported that monomeric GTPase, Rab4 overexpression enhanced the 
induc-  tion  of  autophagy  and  accumulation  of  mitochondria  in  HeLa  cells  [35].  Rab4-mediated  Drp1  depletion  is  required  for 
these  phenome-  na  in  autoimmune  disease  conditions  [36].  In  consistent  with  these  observation,  the  upregulation  of  Drp1  was 
found  in  shS6K1-HeLa  cells  (Fig.  3A)  with  the  elevation  of  mitophagy  (Fig.  8).  However  the  diminished  ATP  production  in 
Systemic  Lupus  Erythematosus  patients  [37],  coupled  with  Rab4-regulated  mitochondria  preserva- tion, was not correlated with 
our  observations  (Fig.  7).  This  discrep-  ancy  is  probably  due  to  the  difference  in  cell  types  since  Lupus  is  caused  by  the 
contribution  of  various  signaling  pathways.  Taken  to-  gether,  S6K1  is  involved  in  the  control  of  mitochondria morphology and 
mitochondria  function  in  HeLa cells. These observations clearly support novel S6K1 functions in mitochondria-mediated cellular 
signaling. 
Conflict-of-interest/financial disclosure statement 
None. 
Acknowledgement 
We  would  like  to  thank  Dr.  David  Plas  (Univ.  of  Cincinnati)  for  providing  shS6K1-FL5.12  stable  cells.  This  work  was 
financially supported by National Research Foundation of Korea (NRF) grants 
 
from  the  Korean Government (MEST) (NRF-2012M3A9B6055302, NRF-2014R1A1A3050752, NRF-2015R1A2A2A01003597, 
NRF- 2015R1D1A3A0101569 4). 
References 
[1] C. Desler, LJ Rasmussen, Mitochondria in biology and medicine–2012, Mitochondri- 
on 16 (2014) 2–6. 
1914 J. Park et al. / Cellular Signalling 28 (2016) 1904–1915 

BA 
GFP-LC3 Red-TMRE 
de R - ot 
a 
O 
70 
i M 
) % ( 
60 
50 

* 
htiwae 
3 CL - P 
40 
ra 
FG 
30 gnippalr 
dn 
20 10 
ev 
0 
shNS shS6K1 
17.17 % 44.59 % 

C 
Lenti-shNS Lenti-shS6K1 
500nm 
100nm 
Fig.  8.  Enhancement  of  mitophagy  in  shS6K1-HeLa  cells.  (A)  Stable  shNS- or S6K1-HeLa cells were infected with GFP-LC3B 
adenovirus  (GFP-LC3)  for  24  h.  The  cells  were  stained  with  tetramethylrhodamine,  ethyl  ester  (Red-TMRE)  for  20  min.  The 
sample  was  analyzed  by  confocal  microscope.  (B)  The  results  was  calculated  as  a  percent  of  merged  area  (yellow)  from  total 
GFP-LC3  stained  area.  8  images  were  analyzed  for each sample. Asterisk, pb 0.05; double asterisk, pb 0.01. (C) Lenti-shNS and 
Lenti-shS6K1  HeLa  cells  were  prepared  for  transmission  electron  microscopic  analysis.  Mitochondrial  ultrastructure  was 
analyzed  by  transmission  electron  microscopy.  Bottom  panels  are  the  magnification  of  the  indicated  area.  These  results  are  a 
representative  of  three  independent  experiments.  Sca  le  bars  for  top  panel  and  bottom  panel  represent  500  nm  and  100  nm, 
respectively. 
shNS shS6K1 
GFP-LC3 Red-TMRE 
[2] H. Pelicano, DS Martin, RH Xu, P. Huang, Glycolysis inhibition for anticancer treat- 
ment, Oncogene 25 (34) (2006) 4633–4646. [3] RA Cairns, IS Harris, TW Mak, Regulation of cancer cell metabolism, Nat. 
Rev. Can- 
cer 11 (2) (2011) 85–95. [4] WH Koppenol, PL Bounds, CV Dang, Otto Warburg's contributions to current con- 
cepts of cancer metabolism, Nat. Rev. Cancer 11 (5) (2011) 325–337. [5] HM Ni, JA Williams, WX Ding, Mitochondrial 
dynamics and mitochondrial quality 
control, Redox Biol. 4 (2015) 6–13. [6] I. Kim, S. Rodriguez-Enriquez, JJ Lemasters, Selective degradation of mitochondria 
by mitophagy, Arch. Biochem. Biophys. 462 (2) (2007) 245–253. 
 
[7] AM van der Bliek, Q. Shen, S. Kawajiri, Mechanisms of mitochondrial fission and fu- 
sion, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5 (6) (2013). [8] B. Westermann, Mitochondrial fusion and fission in cell life and 
death, Nat. Rev. Mol. 
Cell Biol. 11 (12) (2010) 872–884. [9] S. Gandre-Babbe, AM van der Bliek, The novel tail-anchored membrane protein Mff 
controls mitochondrial and peroxisomal fission in mammalian cells, Mol. Biol. Cell 19 (6) (2008) 2402–2412. [10] OC Loson, Z. 
Song, H. Chen, DC Chan, Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 
recruitment in mitochondrial fission, Mol. Biol. Cell 24 (5) (2013) 659–667. [11] CS Palmer, KD Elgass, RG Parton, LD 
Osellame, D. Stojanovski, MT Ryan, Adaptor proteins MiD49 and MiD51 can act independently of Mff and Fis1 in Drp1 recruit- 
ment and are specific for mitochondrial fission, J. Biol. Chem. 288 (38) (2013) 27584–27593. [12] JR Grove, P. Banerjee, A. 
Balasubramanyam, PJ Coffer, DJ Price, J. Avruch, JR Woodgett, Cloning and expression of two human p70 S6 kinase 
polypeptides differ- ing only at their amino termini, Mol. Cell. Biol. 11 (11) (1991) 5541–5550. [13] J. Chung, TC Grammer, KP 
Lemon, A. Kazlauskas, J. Blenis, PDGF- and insulin-de- pendent pp70S6k activation mediated by phosphatidylinositol-3-OH 
kinase, Nature 370 (6484) (1994) 71–75. [14] SH Um, F. Frigerio, M. Watanabe, F. Picard, M. Joaquin, M. Sticker, S. Fumagalli, 
PR Allegrini, SC Kozma, J. Auwerx, G. Thomas, Absence of S6K1 protects against age- and diet-induced obesity while 
enhancing insulin sensitivity, Nature 431 (7005) (2004) 200–205. [15] LS Carnevalli, K. Masuda, F. Frigerio, O. Le Bacquer, SH 
Um, V. Gandin, I. Topisirovic, N. Sonenberg, G. Thomas, SC Kozma, S6K1 plays a critical role in early adipocyte 
differentiation, Dev. Cell 18 (5) (2010) 763–774. [16] JM Van Dyke, JL Bain, DA Riley, Stretch-activated signaling is modulated 
by 
stretch magnitude and contraction, Muscle Nerve 49 (1) (2014) 98–107. [17] MK Holz, BA Ballif, SP Gygi, J. Blenis, 
mTOR and S6K1 mediate assembly of the translation preinitiation complex through dynamic protein interchange and ordered 
phosphorylation events, Cell 123 (4) (2005) 569–580. [18] MK Holz, J. Blenis, Identification of S6 kinase 1 as a novel 
mammalian target of rapamycin (mTOR)-phosphorylating kinase, J. Biol. Chem. 280 (28) (2005) 26089–26093. [19] P. Tandon, 
CA Gallo, S. Khatri, JF Barger, H. Yepiskoposyan, DR Plas, Requirement for ribosomal protein S6 kinase 1 to mediate 
glycolysis and apoptosis resistance in- duced by Pten deficiency, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (6) (2011) 2361–2365. [20] JF 
Barger, CA Gallo, P. Tandon, H. Liu, A. Sullivan, HL Grimes, DR Plas, S6K1 deter- mines the metabolic requirements for 
BCR-ABL survival, Oncogene 32 (4) (2013) 453–461. [21] Y. Li, J. Park, L. Piao, G. Kong, Y. Kim, KA Park, T. Zhang, J. 
Hong, GM Hur, JH Seok, SW Choi, BC Yoo, BA Hemmings, DP Brazil, SH Kim, J. Park, PKB-mediated PHF20 
phosphorylation on Ser291 is required for p53 function in DNA damage, Cell. Signal. 25 (1) (2013) 74–84. [22] AY Kim, JH 
Kwak, NK Je, YH Lee, YS Jung, Epithelial-mesenchymal transition is associated with acquired resistance to 5-fluorocuracil in 
HT-29 Colon cancer cells, Toxicol. Res. 31 (2) (2015) 151–156. 
1915 J. Park et al. / Cellular Signalling 28 (2016) 1904–1915 
[23] IS Kim, SY Yang, JH Han, SH Jung, HS Park, CS Myung, Differential gene expres- sion in GPR40-overexpressing 
pancreatic beta-cells treated with linoleic acid, Kore- an J. Physiol. Pharmacol. 19 (2) (2015) 141–149. [24] JM Cheon, DI Kim, 
KS Kim, Insulin sensitivity improvement of fermented Korean red ginseng (Panax ginseng) mediated by insulin resistance 
hallmarks in old-aged ob/ob mice, J. Ginseng Res. 39 (4) (2015) 331–337. [25] CH Na, JH Hong, WS Kim, SR Shanta, JY Bang, 
D. Park, HK Kim, KP Kim, Iden- tification of protein markers specific for papillary renal cell carcinoma using imaging mass 
spectrometry, Mol. Cell 38 (7) (2015) 624–629. [26] L. Piao, Y. Li, SJ Kim, HS Byun, SM Huang, SK Hwang, KJ Yang, KA 
Park, M. Won, J. Hong, GM Hur, JH Seok, M. Shong, MH Cho, DP Brazil, BA Hemmings, J. Park, Association of LETM1 and 
MRPL36 contributes to the regulation of mitochondrial ATP production and necrotic cell death, Cancer Res. 69 (8) (2009) 
3397–3404. [27] S. Desagher, JC Martinou, Mitochondria as the central control point of apoptosis, 
Trends Cell Biol. 10 (9) (2000) 369–377. [28] S. Frank, B. Gaume, ES Bergmann-Leitner, WW Leitner, EG Robert, F. 
Catez, CL Smith, RJ Youle, The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis, Dev. Cell 1 
(4) (2001) 515–525. [29] SG Dann, A. Selvaraj, G. Thomas, mTOR Complex1-S6K1 signaling: at the crossroads 
of obesity, diabetes and cancer, Trends Mol. Med. 13 (6) (2007) 252–259. [30] AG Rajapakse, G. Yepuri, JM Carvas, S. 
Stein, CM Matter, I. Scerri, J. Ruffieux, JP Montani, XF Ming, Z. Yang, Hyperactive S6K1 mediates oxidative stress and endo- 
thelial dysfunction in aging: inhibition by resveratrol, PLoS One 6 (4) (2011), e19237. [31] M. Lagouge, C. Argmann, Z. 
Gerhart-Hines, H. Meziane, C. Lerin, F. Daussin, N. Messadeq, J. Milne, P. Lambert, P. Elliott, B. Geny, M. Laakso, P. 
Puigserver, J. Auwerx, Resveratrol improves mitochondrial function and protects against meta- bolic disease by activating SIRT1 
and PGC-1alpha, Cell 127 (6) (2006) 1109–1122. [32] SM Schieke, D. Phillips, JP McCoy Jr., AM Aponte, RF Shen, RS 
Balaban, T. Finkel, The mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway regulates mitochondrial ox- ygen consumption and 
oxidative capacity, J. Biol. Chem. 281 (37) (2006) 27643–27652. [33] PB Dennis, A. Jaeschke, M. Saitoh, B. Fowler, SC Kozma, 
G. Thomas, Mammalian 
TOR: a homeostatic ATP sensor, Science 294 (5544) (2001) 1102–1105. [34] YC Kim, KL Guan, mTOR: a pharmacologic target 
for autophagy regulation, J. Clin. 
Invest. 125 (1) (2015) 25–32. [35] G. Talaber, G. Miklossy, Z. Oaks, Y. Liu, SA Tooze, DM Chudakov, K. Banki, A. Perl, 
HRES-1/Rab4 promotes the formation of LC3(+) autophagosomes and the accumu- lation of mitochondria during autophagy, 
PLoS One 9 (1) (2014), e84392. [36] TN Caza, DR Fernandez, G. Talaber, Z. Oaks, M. Haas, MP Madaio, ZW Lai, G. Miklossy, 
RR Singh, DM Chudakov, W. Malorni, F. Middleton, K. Banki, A. Perl, HRES-1/Rab4-mediated depletion of Drp1 impairs 
mitochondrial homeostasis and represents a target for treatment in SLE, Ann. Rheum. Dis. 73 (10) (2014) 1888–1897. [37] P. 
Gergely Jr., C. Grossman, B. Niland, F. Puskas, H. Neupane, F. Allam, K. Banki, PE Phillips, A. Perl, Mitochondrial 
hyperpolarization and ATP depletion in patients with systemic lupus erythematosus, Arthritis Rheum. 46 (1) (2002) 175–190.