Pembahasan eClass II 2012

Biselmol

1. Suatu electrophoretic mobility shift assay (EMSA) dilakukan untuk melihat interaksi antara
DNA dan protein. Suatu fragmen DNA dari bagian hulu (upstream) sekuens gen X diberi
label radioaktif dan digunakan sebagai probe. Probe DNA ini diinkubasi dengan (+) atau
tanpa (-) ekstrak nucleus yang diisolasi dari jaringan A (tulang); B (paru-paru); C (otak); dan
D (kulit). Kompleks protein DNA kemudian difraksinasi (dipisahkan) pada gel poliakrilamid
nondenaturing. Gel kemudian didedahkan pada film autoradiografi dan hasilnya ditunjukkan
oleh gambar berikut ini.

a. Jaringan mana yang mengandung suatu aktivitas pengikatan (misalnya protein) yang
mengenali bagian hulu sekuens dari gen X? Apakah faktor transkripsi sama pada masing-
masing jaringan? Berilah alasan untuk jawaban anda.
Jawab:
Dari hasil elektroforesis tampak adanya pita pada gel A dan D. Oleh karena itu,
jaringan yang mengandung aktivitas pengikatan/factor transkripsi yang mengenali
promoter (upstream sequence) dari gen X adalah jaringan tulang (A) dan jaringan
kulit (D). Bila dilihat, jarak migrasi komplek DNA-protein pada A dan D tidak
sama. Hal ini menandakan bahwa bobot molekul antara kedua kompleks (pada A
dan D) tidak sama, sehingga kemungkinan besar factor traskripsi pada masing-
masing jaringan berbeda.

b. Jika aktivitas pengikatan dimurnikan, uji seperti apa yang dapat dilakukan untuk
memverifikasi bahwa factor ini benar-benar merupakan suatu factor transkripsi?
Terangkan dengan jelas. (Hint: uji dapat dilakukan secara in vitro atau in vivo; istilah
yang dapat anda gunakan yaitu RNA polymerase II, gen reporter, dan plasmid )
Jawab:
Uji verifikasi dapat dilakukan baik secara in vitro atau in vivo. Prinsip yang dipakai
dalam uji ini adalah prinsip dari pengaturan ekspresi gen pada eukaryote. Bila uji
dilakukan secara in vitro, molekul yang dideteksi adalah RNA gen X yang
dihasilkan melalui reaksi in vitro dengan bahan-bahan sebagai berikut:
- DNA template
- RNA polymerase II dan factor transkripsi umum yang berasosiasi dengannya
- empat macam NTP (bukan dNTP) berlabel radioaktif

Inkubasi dilakukan dengan dan tanpa protein putative sebagai factor transkripsi
dari gen X. Hasil positip bila terdapat pita RNA berlabel melalui elektoforesis dan
autoradiografi.
Uji secara in vivo melibatkan konstruksi gen pada plasmid bakteri. Untuk lebih
jelasnya bisa saudara lihat pada gambar berikut ini (so sorry in English).

The assay system requires two plasmids. One plasmid contains the gene encoding
the putative transcription factor (protein X ). The second plasmid contains a
reporter gene (e.g., lacZ ) and one or more binding sites for protein X. Both
plasmids are simultaneously introduced into cells that lack the gene encoding
protein X. The production of reporter-gene RNA transcripts is measured;
alternatively, the activity of the encoded protein can be assayed. If reporter-gene
transcription is greater in the presence of the X-encoding plasmid, then the protein
is an activator; if transcription is less, then it is a repressor. By use of plasmids
 encoding a mutated or rearranged transcription factor, important domains of the
protein can be identified.

c. Jika gene X ditranskripsi pada jaringan paru-paru dan otak, tetapi tidak pada tulang dan
kulit, tipe faktor transkripsi apakah yang terikat? Beri spekulasi tentang identitas factor
lain yang mungkin dapat membentuk kompleks pada promoter gen X pada jaringan
tulang dan kulit.
Jawab:
Bila dilihat dari hasil elektroforesis yang tidak menampakkan pita sama sekali pada
gel B dan C, berarti tidak terdapat kompleks DNA probe-protein. Akan tetapi,
dengan tidak adanya aktivitas pengikatan tersebut, gen X aktif ditranskripsi dan
berlaku sebaliknya (pada A dan D). Oleh karena itu, tipe factor transkripsi yang
terikat adalah repressor. Identitas repressor yang membentuk kompleks pada
promoter gen X di jaringan tulang dan kulit bisa berupa protein histon H1.

2. Suatu gen protein kinase (PK) tertentu dispekulasi mengalami splicing secara differensial
pada jaringan otot. Gen ini terdiri atas tiga sekuens ekson dan dua sekuens intron dan pada
sel fibroblast mengkode protein seberat 38.5-kD. Para peneliti telah memindahkan beberapa
bagian dari genom atau cDNA copy dari gen PK ke dalam sel otot dan sel fibroblast. (lihat
konstruksi pada bagian a dari gambar). Sistem ekspresi menggunakan suatu promoter yang
aktif pada kedua tipe sel dan diberi label epitop kecil pada ujung C yang disebut V5 yang
menyumbang sekitar 5.5 kD pada protein fusi. Bagian b dari gambar menunjukkan hasil
percobaan immunopresipitasi yang didesain untuk menganalisis produk ekspresi dari sel
yang ditransfeksi gen. Kontrol negative (Neg) dari sel otot yang tidak ditransfeksi dipakai
sebagai pembanding. Penanda bobot molekul dalam satuan kD ditunjukkan di sebelah kiri.
Protein hasil immunopresipitasi ditunjukkan seperti pada bagian b kemudian ditempatkan
pada perangkat uji protein kinase dengan dua substrat yang berbeda yaitu A dan B untuk
melihat aktivitas dari protein yang diekspresikan.
a. Apa yang dapat anda simpulkan mengenai differential splicing dari gen PK pada sel
fibroblast vs. sel otot?
Jawab:
Differential splicing dari gen PK pada kedua jenis sel tersebut berbeda. Pada sel
fibroblast splicing terjadi dengan skema sebagai berikut (tanda panah
menunjukkan splice site):

dan hasil splicing adalah penggabungan ekson 1, 2, dan 3 yang menghasilkan

protein seberat 38,5 kD. Bila ditambah dengan sekuen V5, BM total menjadi 44 kD.
 Hal ini didukung oleh hasil elektroforesis protein (lihat yang dilingkari biru pada
gambar b). Protein yang dikode oleh ketiga ekson tersebut memiliki aktivitas kinase
optimum bila diberi substrat A.

Sedangkan pada sel otot, splicing terjadi dengan skema sebagai berikut:

dan menghasilkan penggabungan ekson 1 dan 3 (ekson 2 dan kedua intron dibuang.
Hal ini juga didukung oleh hasil elektroforesis (lihat yang dilingkari merah pada
gambar b). Protein yang dihasilkan memiliki aktivitas kinase optimum bila diberi
substrat B.

b. Sekuen/sekuen-sekuen mana yang berperan terhadap regulasi alternative splicing? Apa

alasan anda?
Jawab:
Sekuens yang berperan dalam regulasi alternative splicing pada sel fibroblast adalah
kedua sekuens intron. Sedangkan pada sel otot adalah kedua sekuens intron dan
ekson 2

c. Bagaimana dengan ada atau tidak adanya ekson 3 dapat merubah aktivitas katalitik dari
protein yang dikode PK? Data mana yang mendukung kesimpulan anda? Uraikan
jawaban anda.
Jawab:
Adanya ekson 3 akan meningkatkan aktivitas katalitik dari protein yang dikode
PK. Hal ini dapat dilihat dari grafik pada bagian c. Bila splicing menghasilkan
gabungan ekson 1 dan 2, aktivitas katalitiknya sama dengan control negative yang
lebih rendah dari splicing yang menghasilkan gabungan ekson 1 dan 3 serta
gabungan ekson 1,2,dan 3.

3. Anda sedang mengkloning genom dari virus DNA baru ke dalam plasmid pUC18. Anda
kemudian menebar transforman pada cawan petri ampisilin yang mengandung X-gal dan
mengambil koloni warna biru serta koloni warna putih. Ketika anda memeriksa
sisipan/insersi pada masing-masing plasmid (koloni biru dan putih), anda terkejut karena
menemukan bahwa plasmid dari koloni berwarna biru mengandung insert kecil berukuran 60
bp, sedangkan plasmid dari koloni berwarna putih tidak menunjukkan adanya insert. Jelaskan
mengapa anda bisa memperoleh hasil tersebut. (Hints: plasmid pUC18 memiliki porsi gen
lac Z’ yang hanya mengkode asam-asam amino bagian ujung N, sedangkan plasmid bakteri
 inang memiliki porsi gen lac Z yang hanya mengkode asam-asam amino bagian ujung
karboksil)

Gambar plasmid pUC18

Jawab:

Koloni berwarna biru dengan insert pendek (60 kb) dapat diperoleh karena fungsi lac
Z’ tidak hilang, karena gen ini masih diekspresi meskipun disisipi oleh DNA berukuran
pendek. Namun, gen ini akan menjadi non-fungsional bila insert berukuran panjang.
Koloni berwarna putih yang tidak mengandung insert bisa diperoleh bila sebelum ligasi
dengan insert dilakukan, ujung vector (plasmid) terpotong sedikit oleh nuclease.
Kemudian, jika vector yang terpotong sedikit ini menutup (kedua ujung bergabung)
saat tahap ligasi, gen lac Z’ akan kehilangan fungsinya dan menghasilkan koloni
berwarna putih.

4. (Nilai 10) Anda sedang memetakan gen yang bertanggung jawab untuk penyakit genetis
manusia. Anda menemukan bahwa gen tersebut terpaut terhadap RFLP yang dideteksi
dengan suatu probe yang disebut X-21. Anda menghibridisasi DNA X-21 berlabel pada
DNA-DNA dari suatu deretan sel-sel hybrid tikus-manusia. Tabel berikut ini menunjukkan
kromosom manusia yang ada pada galur sel hybrid dan hasil hibridisasi dengan probe X-21.
Manakah kromosom manusia yang membawa gen penyakit tersebut? Tuliskan alasan
saudara.

Galur sel Kandungan Hibridisasi dengan

kromosom manusia X-21
A 1,5,21 +
B 6,7 -
C 1,22,Y -
 D 4,5,18,21 +
E 8,21,Y -
F 2,5,6 +

Jawab:
Kromosom manusia yang membawa gen penyakit tersebut adalah kromosom nomor 5.
Hal ini tampak dari hasil hibridisasi yang konsisten + bila terdapat kromosom nomor
5.

Jawaban Pertanyaan:
Apa itu alternative splicing?
DNA tersusun atas intron (bagian bukan pengode protein) dan ekson (gen yang
mengode protein). Ketika mRNA pertama kali ditranskripsi, terbentuk mRNA yang
terdiri atas daerah pengode dan bukan pengode. Intron harus dipotong (splicing) agar
mRNA yang ditranslasi seluruhnya terdiri dari bagian pengode gen (ekson).
Pemotongan ini bervariasi (alternative) seperti yang bisa kamu lihat di jawaban
pertanyaan sebelumnya. Ini yang terjadi pada sel penghasil antibodi supaya bisa
menghasilkan beragam antibodi.

Epigenetik secara Molekuler

Epigenetik adalah studi perubahan yang diturunkan dari ekspresi gen atau fenotip
seluler yang disebabkan oleh mekanisme selain perubahan sekuen DNA (makanya
namanya “epi”-genetik), misalnya metilasi DNA atau modifikasi histon.

Secara umum dia melibatkan modifikasi dari aktivasi gen-gen tertentu namun bukan
struktur dasar dari DNA itu sendiri. Biasanya melibatkan protein kromatin yang
berasosiasi dengan DNA. Ini adalah penyebab kenapa sel-sel tertentu hanya
mengekspresikan gen tertentu yang berkaitan dengan aktivitas mereka walau sekuen
DNA-nya sama. Perubahan epigenetik dipertahankan ketika sel membelah (sel anak
mendapatkan perubahan itu). Jika terjadi pada sel telur dan sel sperma yang akan
fertilisasi, anak yang dihasilkan akan mendapatkan perubahan tersebut.