NAMA : NIDA NURHIDAYAH

NIM :170105044

TUGAS : RIVIEW JURNAL

MAKUL : ANALISIS FARMASI (SP)

Judul NEW APPROACH FOR SIMULTANEOUS ANALYSIS OF COMMONLY

USED ANTIGOUT DRUGS BY HPLC/UV METHOD; APPLICATION IN
PHARMACEUTICAL AND BIOLOGICAL ANALYSIS
Jurnal Microchemical
Halaman 717-728
Tahun 2019
Penulis Noha M. Hosny, Katherine Huddersman, Samia M. El-Gizawy, Noha N. Atia
Reviewer Nida Nurhidayah
Tanggal 19 Februari 2020

Pendahuluan Asam urat adalah penyakit rematik yang umum. Selama empat dekade
terakhir,studi global telah menemukan peningkatan serum asam urat
rata-rata yang merupakan produk akhir dari metabolisme endogen dan
eksogen purin dalam manusia . Jadi, pengobatan ini bertujuan untuk
meringankan gejala yang menyerang, mencegah serangan di masa
depan, dan menurunkan konsentrasi plasma-urat. Hal Ini dapat dicapai
dengan menggunakan obat penurun asam urat. Obat-obatan ini
diklasifikasikan menjadi tiga kelompok utama; xanthine oksidase
inhibitor (XOIs),uricosurics, dan uricase rekombinan . Febuxosat
(FBX) adalah XOI selektif non-raksa yang disetujui oleh Badan
Pengawas Obat dan Makanan AS (FDA) pada tahun 2009. FBX
mengurangi produksi asam urat dengan memblokir pusat pterin
molybdenum. Pada bentuk xanthine oksidase teroksidasi dan
bertanggung jawab untuk konversi hipoksantin dan xantin menjadi
asam urat . Lebih lanjut, Probenecid (PRD) adalah salah satu agen
uricosuric yang dianggap sebagai terapi lini kedua untuk manajemen
gout yang bertindak dengan meningkatkan urat ginjal.

Di sisi lain, serangan radang sendi gout akut adalah paling baik diobati
 sesegera mungkin dengan Obat Antiinflamasi Non-Steroidal (NSAID).
Aspirin atau salisilat lain tidak cocok karena mereka dapat
meningkatkan konsentrasi plasma-urat. Colchicine (CLN) adalah
alternatif yang efektif bagi mereka yang tidak dapat mentolerir
NSAID. Hal ini mengurangi pembengkakan dan menurunkan kristal
asam urat yang menyebabkan nyeri pada sendi yang terkena . Semua
pedoman terbaru mendukung kombinasi XOI, uricosurics dan / atau
CLN ketika monoterapi tidak efektif . Case et al. menggambarkan efek
sinergis PRD yang ditambahkan ke rejimen FBX untuk pasien dengan
hiperurisemia refrakter. Ditemukan bahwa kombinasi PRD dan FBX
berhasil mengurangi asam urat ke tingkat target terutama pada pasien
dengan penyakit ginjal kronis [5]. Juga, Yamanaka et al.
merekomendasikan peningkatan dosis bertahap FBX plus CLN dosis
rendah untuk memberikan pengurangan flare gout yang efektif
dibandingkan dengan FBX saja. Selain itu, kombinasi CLN dan PRD
banyak diresepkan untuk mencegah radang sendi gout pada orang yang
sering mengalami serangan gout parah.Sampai sekarang, dua metode
(HPLC dan HPTLC) dilaporkan untuk estimasi simultan kombinasi
CLN-PRD dalam bentuk sediaan
Tujuan penelitian Metode kromatografi cair kinerja tinggi yang inovatif, sederhana,
cepat, spesifik, dan sensitif dengan ultraviolet deteksi (HPLC / UV)
didirikan dan divalidasi untuk penentuan kombinasi simultan dari tiga
obat antigout yang umum diresepkan yaitu; Colchicine (CLN),
Probenecid (PRD) dan Febuxostat (FBX) dalam bentuk sediaan dan
dalam sampel urin manusia.
Bahan dan Prosedur Obat-obatan dan pelarut seperti CLN (≥95%), PRD (≥98%) dan FBX
Penelitian
(≥98%). Kemudian Asetonitril kelas HPLC, metanol (99,9%) dan
asam format 90%. Semua bahan kimia dan pelarut bekas lainnya
adalah dari Kelas HPLC.

Prosedur Analitik
1. Prosedur kromatografi umum
Dua puluh mikroliter dari standar kerja atau solusi sampel dari
campuran yang diteliti diinjeksi pada Perkin Elmer Series 200 HPLC
Sistem. Pemisahan dilakukan pada kolom GraceSmart RP C18
(panjang dalam 250mm × 4,6mm, ukuran partikel 5 μm, ukuran pori
120 Å). Kemudian, elusi isokratis dilakukan oleh mobile phas terdiri
dari air suling asetonitril-ganda, 55:45, v / v, mengandung Asam
format 0,5% (difilter dengan membran Nylon 66 dan didegradasi oleh
sonication sebelum digunakan). Total jangka waktu adalah 10 menit.
Kemudian Laju aliran dan panjang gelombang diprogram melalui
versi Tota lChrom Workstation. Setelah itu, Laju aliran pertama kali
ditetapkan pada 1,0 mL / menit selama 7 menit diikuti dengan 1,2 mL /
menit selama 3 menit terakhir. Detektor UV / VIS juga diprogram
secara paralel dengan run time pada tiga panjang gelombang yang
sesuai dengan obat yang diteliti. Pemrograman detektor diatur pada
350 nm dari 0 hingga 4,5 menit, 249 nm dari 4,5 hingga 7,0 menit dan
320 nm dari 7,0 hingga 10,0 menit untuk CLN, PRD, dan FBX.
2. konstruksi kurva kalibrasi
Solusi standar kerja setara campuran CLN-PRD-FBX
hingga (0,040, 0,10, 10,0, 20,0, 30,0, 40,0 dan 50,0 μg / mL masing-
masing obat) disiapkan dalam fase seluler. Kemudian, pengujian
dilakukan. Nilai daerah puncak (μV ∗ Dt) dari setiap obat diplot
terhadap konsentrasi akhir obat (μg / mL) untuk mendapatkan grafik
kalibrasi. Setelah itu, persamaan regresi yang sesuai dihitung.
3. Prosedur untuk tablet
Untuk campuran terner CLN-PRD-FBX; Colchicine, Probecid® dan
Tablet berlapis film Goutifade kemudia diteliti. Tablet ini secara
terpisah ditimbang, digiling dan dicampur. Berat akurat bubuk
campuran dari setiap formulasi farmasi, setara hingga 50,0 mg masing-
masing obat dipindahkan ke dalam 50 mL yang dikalibrasi labu. 25,0
mL metanol ditambahkan dan sonikasi dilakukan untuk 15 menit.
Selanjutnya, selesai untuk menandai dengan metanol dan filtrasi
melalui membran nilon SUPELCO dilakukan untuk dapatkan 1,0 mg /
mL larutan sampel stok. Pengenceran sesuai solusi filtrat dibuat
dengan sistem seluler untuk mendapatkan solusi sampel yang bekerja.
Setelah itu dilakukan prosedur umum. Selanjutnya Untuk campuran
biner CLN-PRD; Sepuluh tablet Goutyless® (mengandung, 0,5 mg
CLN ditambah 500 mg PRD per tablet) ditimbang, digiling lalu
dicampur. Berat akurat bubuk campuran dilarutkan dalam metanol,
disonikasi dan disaring untuk menyiapkan larutan sampel stok
mengandung 1,0 dan 1000,0 mg / mL CLN dan PRD. Setelah itu,
solusi sampel saham CLN-PRD tepat diencerkan oleh fase gerak untuk
mendapatkan sampel yang berfungsi
solusi CLN dan PRD dengan perbandingan 1: 1000. Setelah itu
dilakukan prosedur umum.
4. Prosedur untuk sampel urin berduri
Dilaporkan bahwa pada pasien dengan fungsi ginjal normal dan
ekskresi ginjal 10-20% dan 77-88% dari total CLN dan PRD; masing-
masing [41–45]. Jadi, metode yang dikembangkan digunakan untuk
analisis campuran biner CLN-PRD dalam sampel urin di hadapan
FBX sebagai standar internal (IS). Dalam tabung uji gelas bersih
kering, sampel urin bebas obat dikumpulkan dari sukarelawan sehat.
Kemudian Ke dalam serangkaian tabung centrifuge bawah meruncing,
alikuot 2,0 mL urin manusia dibubuhi 150 μL 1,0 mg / mL FBX yang
digunakan sebagai IS (konsentrasi akhir IS = 30,0 μg / mL). 1,0 mL
larutan standar kerja dari campuran CLN-PRD yang diteliti juga
ditambahkan dan diikuti oleh pengenceran menjadi 5,0 mL dengan
asetonitril (untuk mendapatkan konsentrasi akhir mulai dari 0,040
hingga 50,0 μg / mL). Disiapkan sampel berduri yang vortex dan
disentrifugasi pada 4000 c / s selama 30 detik dan pada kekuatan
18.659 g selama 5 menit; masing-masing. Setelah itu, dilakukan
penyaringan sampel urin berduri dilakukan dengan bantuan (0,2 μm)
filter jarum suntik Whatman ™ Nylon. Filtrat yang diperoleh
disuntikkan langsung pada sistem HPLC seperti yang disebutkan
sebelumnya (Bagian 2.5.1) percobaan kosong sampel urin bebas obat
dilakukan dengan cara yang sama tidak termasuk obat. Untuk
membuat kurva kalibrasi CLN dan PRD, perbandingan luas puncak
obat yang diteliti dengan IS terhadap konsentrasi obat yang berbeda
 dalam sampel urin diproses dengan analisis regresi linier kuadrat
terkecil.
5. Prosedur untuk sampel urin nyata
Karena sensitivitas metode yang dikembangkan, analisis CLN-PRD
kombinasi dalam sampel urin tercapai. Selain itu, 40-65% dari total
dosis CLN yang diserap tidak berubah dalam urin setelah pemberian
oral 1,0 mg . Sementara, PRD diekskresikan dalam urin terutama
sebagai monoacyl glucuronide dan obat utuh . Tablet goutyless (diberi
label mengandung 0,5 mg CLN ditambah 500 mg PRD per tablet)
diberikan secara oral kepada tiga sukarelawan manusia yang sehat
berusia 32 tahun, berat rata-rata mereka adalah 80 Kg). Mereka tidak
minum obat apa pun selama dua minggu sebelum percobaan. Sampel
urin dikumpulkan dalam botol kaca setelah 6,0 jam posterior untuk
menerima obat. 2,0 mL sampel urin yang dikumpulkan dipindahkan
ke tabung centrifuge bawah meruncing dan dibubuhi 120,0 μL 1,0 mg
/ mL FBX (konsentrasi akhir IS = 30,0 μg / mL) kemudian
diselesaikan hingga 2,0 mL dengan asetonitril. Sampel yang
disiapkan ini vorteks selama 30 detik dan disentrifugasi pada 4000 c /
s; 18.659 g-force selama 5 menit. Kemudian, langkah filtrasi sampel
urin dilakukan dengan menggunakan (0,2 μm) filter jarum suntik
Whatman ™ Nylon. 30 μL larutan bening yang diperoleh langsung
dimuat pada katup injeksi dan 20 μL diinjeksikan pada sistem HPLC
sebagaimana disebutkan di atas (Bagian 2.5.1). Eksperimen kosong
dibuat dengan cara yang sama tanpa obat-obatan. Semua percobaan
termasuk cairan biologis dilakukan sesuai dengan hukum dan
pedoman fakultas yang relevan, dan etika penelitian.
Hasil dan 1. Panjang gelombang analitik
Pembahasan Thermo Scientific-Evolution 220 UV-VIS spektrofotometer dengan
Cuvet kuarsa 1 cm digunakan untuk menentukan panjang gelombang
serapan maksimum dari obat tersebut. Seperti yang ditunjukkan pada
Gambar. 1, CLN memiliki dua panjang gelombang maksimum yaitu
pada 246 dan 350 nm, 230 dan 249 nm untuk PRD dan 320 nm untuk
FBX. Sebagai hasil dari perbedaan yang diamati dalam panjang
gelombang yang diukur ini, pemrograman panjang gelombang
dirancang untuk mencapai sensitivitas dan spesifisitas yang lebih
tinggi untuk kuantisasi obat yang diteliti dengan metode yang
diusulkan. Tiga panjang gelombang (350, 249 dan 320 nm) dipilih
untuk analisis CLN, PRD dan FBX; masing-masing. Deteksi dilakukan
dengan menggunakan detektor UV / VIS PerkinElmer Series 200 dan
diprogram dengan perangkat lunak TotalChrom Workstation versi
6.3.4. Pemrograman detektor diatur pada 350 nm dari 0 hingga 4,5
menit, 249 nm selama 2,5 menit dan 320 nm selama 3 menit terakhir
dari total waktu berjalan (10 menit)
2. Fase Gerak

Beberapa uji coba dilakukan untuk memilih fase gerak yang optimal
untuk pemisahan campuran terner CLN-PRD-FBX. Asetonitril,
etanol, dan metanol diuji sebagai pelarut organik. Kemudian
ditemukan resolusi yang baik, area puncak tinggi dan puncak tajam
diperoleh saat asetonitril digunakan sebagai pengubah organik.
Sedangkan, metanol dan etanol memberikan puncak asimetris dengan
CLN (luas) dan FBX (bercabang dua). Juga, persentase pengubah
organik yang dipilih bervariasi (dari 10% hingga 90%). Setelah
meningkatkan asetonitril ≥70%, obat yang diuji dielusi lebih cepat
dengan hasil resolusi yang tidak tepat. Ketika hasil asetonitril
menurun ≤40%, pemisahan yang baik diamati dalam waktu yang lebih
lama (> 11 menit). Jadi, 55% asetonitril hingga 45% air dipilih sebagai
rasio fase gerak optimal. Untuk meningkatkan bentuk puncak. Lalu
asam format, asetat, orto-fosfat serta trietilamin diuji sebagai aditif
fase gerak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aditif Asam
memberikan pemisahan yang lebih baik dari obat yang diteliti daripada
trietilamin. Puncak buruk dari PRD (pKa = 3,53) dan FBX (pKa =
3,08) diamati dengan menggunakan trietlamin. Asam format (0,5%)
adalah asam yang dipilih yang memberikan puncak simetris dengan
daerah puncak yang lebih tinggi. Akhirnya, asam format (0,5% v / v)
dilarutkan dalam campuran asetonitril dan air (dalam perbandingan 55:
45, v / v; pH = 2,31 ± 0,02) ditemukan sebagai eluen optimum yang
memberikan resolusi terbaik dan puncak tajam dari obat yang
 diselidiki terpisah dalam waktu yang wajar. Waktu retensi (tR) adalah
3,597, 5,357 dan 8,250 untuk CLN, PRD dan FBX.
3. Laju aliran

Pengaruh laju aliran pada pemisahan obat yang ditargetkan

diteliti dalam kisaran 0,3-2 mL / menit. tumpang tindih dan resolusi
yang buruk diamati antara CLN dan PRD puncak. Tetapi pada laju
aliran yang lebih rendah ≤0.8, resolusi yang baik dicapai dengan
puncak asimetris yang luas dan jangka waktu yang lebih lama (> 15
menit) untuk seluruh elusi dari obat yang diteliti . Jadi, kami mencoba
memodelkan program aliran gradien untuk meningkatkan resolusi
metode dan mengurangi waktu pemisahan yang diperlukan (hingga <9
menit). Laju aliran diprogram melalui
TotalChrom Workstation versi 6.3.4 perangkat lunak. Ditemukan
bahwa 1,0 mL / mnt untuk 7 mnt pertama diikuti oleh 1,2 mL / mnt
selama 3 mnt terakhir dari total waktu berjalan (10 mnt) adalah
pemrograman aliran optimal untuk CLN, PRD dan elusi FBX dalam
waktu <9 mnt. Dengan demikian, metode yang dikembangkan dapat
berhasil diterapkan untuk pengujian cepat agen antigout ini dalam
tablet dan cairan biologis.
Kesimpulan Untuk pertama kalinya, metode HPLC / UV cepat, spesifik dan sensitif
didirikan untuk estimasi simultan dari tiga obat antigout yaitu;
Kolkisin, Probenecid, dan Febuxostat dalam tablet dan dalam sampel
urin manusia. Pemodelan laju aliran dengan deteksi panjang
gelombang pemrograman telah dikembangkan untuk mendapatkan
hasil yang cepat dan pemisahan yang efisien. Obat-obatan yang
ditargetkan dipisahkan dalam waktu <9 menit menggunakan kolom
GraceSmart RP C18 dengan sistem seluler yang terdiri dari asetonitril:
air (55: 45, v / v; mengandung asam format 0,5% v / v). dalam hal ini
kisaran linearitas untuk semua obat yang diselidiki adalah 0,040-50,0
μg / mL dengan batas deteksi 1,94-6,48 ng / mL. Selain itu,
dikembangkan metode validasi sesuai dengan persyaratan ICH dan
US-FDA dan telah berhasil diterapkan untuk estimasi simultan obat
dalam bentuk murni, dan dalam larutan buatan laboratorium campuran
tablet. Metode yang diusulkan digunakan untuk analisis CLN dan PRD
dalam tablet gabungan mereka dan dalam sampel urin manusia
diperoleh dari sukarelawan sehat dengan pemulihan yang baik. Metode
kami terbukti sesuai untuk kuantisasi obat target bahkan adanya
eksipien, komponen urin, dan metabolit. Selanjutnya, stabilitas
campuran CLN-PRD dalam sampel urin adalah dipelajari. Terakhir,
metode ini cocok untuk pengukuran kontrol kualitas untuk analisis
simultan agen antigout yang dikelola bersama ini dicampuran biner
dan terner mereka.