BAB IV

PEWARNAAN GRAM

Tujuan :
1. Mengetahui cara pengecatan Gram
2. Mengetahui karakter bakteri berdasarkan sifat Gram
3. Mengetahui morfologi sel bakteri gram negatif dan positif

Dasar teori
Berdasarkan Pewarnaan Gram, bakteri diklasifikasikan ke dalam 2 (dua) kelompok
besar yaitu: Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Perbedaan utama di antara keduanya
adalah struktur dan komposisi dinding selnya. Bakteri Gram Positif mampu
mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram, yaitu Gentian Violet, sehingga
nampak berwarna ungu saat pengamatan dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini
tersusun oleh sebagian besar Peptidoglikan, yang mampu mengikat zat warna dan tidak rusak
saat dicuci dengan alcohol. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki komposisi
dinding sel yang sebagian besar tersusun dari lapisan lipid, sehingga pada saat pewarnaan
kurang dapat mempertahankan zat warna utama terutama saat dicuci dengan alcohol (lipid
rusak saat dicuci dengan alcohol), akibatnya kelompok bakteri ini memberikan kenampakan
warna merah (warna dari zat warna ke dua: safranin atau air fuchsin) di akhir kegiatan
pewarnaan Gram. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah Eschericia Coli.
Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium spp,
karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam
untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi
sel jaringan akan berwarna hijau (James 2002).
Sample biakan bakteri berbentuk suspensi homogen agar bakteri dapat menyebar dan
tidak menumpuk pada kaca preparat. Kemudian dikering udarakan atau fiksasi udara agar
bakteri menempel pada kaca preparat. Fiksasi panas atau dikeringkan dengan pemanasan
biasanya di atas spirtus pada pewarnaan gram dapat menyebabkan bakteri tersuspensi mati
atau tidak produktif apabila suhu terlalu tinggi, walaupun dapat melekatkan bakteri pada kaca
preparat. Setelah itu biakan bakteri diteteskan Kristal ungu yang berfungsi memberikan
pewarnaan pada bakteri tersebut. Bakteri akan berwarna ungu. Penetesan Kristal ungu harus
merata pada seluruh area biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat terwarnai
dengan sempurna. Bakteri yang telah diwarnai dikering udarakan selama satu menit sambil
digoyangkan. Lalu dibilas dengan aquades dengam cara mengalirkannya, bukan dengan
penyemprotan secara langsung pada bakteri tersebut karena dapat menyebabkan bakteri rusak
terkena semprotan aquades. Bakteri dikering udarakan kembali. Setelah itu, ditambahkan KI
(Kalium Iodida) agar dapat menyatu dengan ungu Kristal yang membentuk kompleks di
dalam sel sehingga sel tetap berwarna ungu. Kemudian dikering udarakan dan dibilas dengan
aquades. Alkohol 96% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan
penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek Kristal ungu
dan KI (UK-Y) pada gram negative, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif
akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung peptidoglikan.
Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya
menciut karena daya rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga kompleks UK-Y
tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna ungu. Sedangkan pada gram negative lipid
tereksitasi (keluar) dari dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga kompleks UK-Y
keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna atau warna ungu akan luntur karena peluruhan
dinding sel. Setelah dibilas, penambahan safranin yang merupakan cat sekunder atau kontras

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2017 | pengecatan gram

berfungsi untuk mewarnai gram negative yang semula telah luntur pewarnaannya menjadi
warna merah. Hasil akhinya adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu dan bakteri
gram negative akan berwarna merah. Pengamatan gram dapat dilakukan di bawah mikroskop
dengan pembesaran 1000x dan harus menggunakan minyak imersi. Hasil pewarnaan Gram
dapat digunakan untuk mengetahui bentuk morfologi dari keempat jenis isolat yaitu warna
dan bentuk sel bakteri tersebut. Berdasarkan referensi second edition of Bergeys Manual, uji
biokimia untuk Gram negatif adalah uji oksidasi sedangkan untuk Gram positif dapat
dilakukan pewarnaan endospora.

Beberapa perbedaan bakteri gram positif dan negatif :

Bakteri gram positif
Bakteri gram negatif
 Mangandung Mg Ribonukleat  Tidak mengandung Mg
 Sangat sensitif terhadap zat ribonukleat
warna trifenilmetan  Kurang sensitif terhadap zat
 Sensitif terhadap penisilin warna trifenilmetan
 Tahan basa, tidak larut dalam KOH  Sensitif terhadap streptomisin
1%  Sensitive basa, larut dalam KOH
 Kisaran isoelelektrik pH 2,5 – 4 1%
 Biasanya berbentuk kokus atau  Kisaran isoelektrik pH 4,5 – 5,5
batang pembentuk spora kecuali  Biasanya berbentuk batang non
Lactobacillus dan Cyanobacterium spora kecuali neisseria
 Dapat bersifat tahan asam  Tidak tahan asam
 Contoh : Staphylococcus  Contoh : Salmonella thypii ,
albus, Bacillus subtilis Escericia coli

Hasil pewarnaan Gram negatif Hasil pewarnaan Gram positif

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2017 | pengecatan gram

Teknik pewarnaan gram
Alat : Bahan :

 Object Glass  Apusan Bakteri

 Cover Glass  Zat Warna Gentian Violet
 Pipet Tetes  Iodine
 Botol Semprot  Alcohol
 Bunsen  Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin
 Aquades

Prosedur :
 Bersihkan objek glass dengan alkohol kemudian panggang di atas bunsen
hingga kering
 Inokulasikan bakteri sebanyak 1 ose di atas objek glass, ratakan dan fiksasi
diatas bunsen
 Teteskan larutan gram A (kristal ungu) dan didiamkan selama 1 menit lalu
bilas dengan aquadest
 Teteskan gram B (iodium) dan diamkan diamkan selama 2 menit lalu bilas
dengan aquades
 Teteskan larutan peluntur gram C (etanol 70%) selama 30 detik lalu bilas dengan
aquadest
 Teteskan cat penutup gram D (safranin) dan diamkan selama 1/2 menit kemudian
cuci degan aquadest dan kering anginkan
 Amati 10x dan 400x ambil data dan
 Tetesi minyak emersi bila perbesaran 1000X

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2017 | pengecatan gram

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2017 | pengecatan gram