LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

ACARA I PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

ACARA II PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

Dosen Pembimbing: Rozana Zuhri, S.Pd., M.Si

Disusun Oleh:

Dhea agustin NPM 18020611008

Eka Satya N NPM 18020611009

Indah Putri Z NPM 18020611012

Rikar Geri NPM 18020611020

Wahyu Yulaiha NPM 18020611026

Kelompok Praktikum / kelas : 1 / B

Nilai Tanggal dan Paraf

LABORATORIUM PENDIDIKAN BIOLOGI PROGRAM STUDI PENDIDIKAN

BIOLOGI STKIP YPM BANGKO

2020/2021
ACARA I PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

HARI/TANGGAL: 16 NOVEMBER 2020

A. Tujuan Praktikum

1. Mengetahui cra pembuatan Media

2. Mengetahuai cara dan macam-macam sterilisasi

B. Tinjauan Pustaka

Sterilisasi adalah suatu proses di mana kegiatan ini bertujuan untuk membebaskan alat
ataupun bahan dari berbagai macam mikroorganisme. Suatu bahan bisa dikatakan steril
apabila bebas dari mikroorganisme hidup yang patogen maupun tidak baik dalam bentuk
vegetatif maupun bentuk nonvegetatif (spora) (Subaghdja, 2010).

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, jika
ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada jasad renik yang dapat berkembang baik.
Sterilisasi harus dapat membunuh renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri
(Fardiaz,1992).

Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri

masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung
sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan
mikrobia akan diluluhkan (Lay dan Hatowo, 1992).

Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara
sterilisasi yang umum digunakan secara rutin di laboratorium Mikrobiologi ialah dengan
pemanasan. Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi
panas lembab, bila tanpa kelembaban disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering
(Ammi, dkk., 2013).

Menurut Ratna (1993), berikut ini adalah jenis proses sterilisasi:

a. Sterilisasi basah atau sterilisasi panas lembab

Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf atau sterilisator uap yang
mudah diangkat (portable) dengan menggunakan air jenuh bertekanan pada suhu 121oC
selama 15 menit. Maka sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa
saja yang dapat ditembus uap air (misalnya minyak) dan tidak rusak bila dipanaskan
dengan suhu yang berkisar antara 110oC dan 121oC. Bahan-bahan yang biasanya
disterilkan dengan cara ini antara lain medium biakan yang umum, air suling, peralatan
laboratorium, biakan yang dibuang, medium yang tercemar, dan bahan-bahan dari karet.

Ada 4 hal utama yang harus diingat bila melakukan sterilisasi basah:
 1. Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan betul-betul dari
ruang sterilisator;

2. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkena uap, karena itu tabung dan labu
kosong harus diletakkan dalam posisi tidur agar udara tidak terperangkap di dasarnya;

3. Bahan-bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus permeabel terhadap uap;

4. Suhu sebagaimana yang terukur oleh termometer harus mencapai 121oC dan
dipertahankan setinggi itu selama 15 menit.

b. Sterilisasi kering

Sterilisasi kering atau sterilisasi panas kering dapat diterapkan dengan cara
pemanasan langung sampai merah, meayangkan di atas nyala api, pembakaran dan
sterilisasi dengan udara panas (oven). Pemanasan kering sering digunakan dalam
sterilisasi alat-alat gelas di laboratorium.

Dalam sterilisasi panas kering, bahan yang sering disterilkan adalah pipet, tabung
reaksi, cawan petri dari kaca, dan barang-barang pecah belah lainnya. Bahan-bahan yang
disterilkan harus dilindungi dengan cara membungkus, menyumbat atau menaruhnya
dalam suatu wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven.
Sebelum melakukan sterilisasi udara panas kering ini terlebih dahulu membungkus alat-
alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil, setelah itu atur pengatur suhu oven
menjadi 160oC dan alat disterilkan selama 2 jam.

Menurut Ratna (1993), berikut adalah tabel daftar suhu dan waktu yang biasa digunakan
untuk sterilisasi panas kering dengan oven:

Suhu (oC)

Waktu (jam)

170

1,0

160

2,0

150

2,5

140

3,0
c. Sterilisasi uap

Uap panas pada suhu 100oC dapat digunakan dalam bentuk uap mengalir. Metode ini
mempunyai keterbatasan. Penggunaan uap mengalir dilakukan dengan proses sterilisasi
bertingkat untuk mensterilkan media kultur. Metode ini jarang memuaskan untuk larutan
yang mengandung bahan-bahan karena spora sering gagal tumbuh di bawah kondisi ini,
karena bentuk vegetatif dari kebanyakan bakteri tidak membentuk spora. Temperatur suhu
titik mati bervariasi, tetapi tidak ada bentuk non spora yang bertahan.

Dalam prakteknya, suatu perpanjangan pemaparan uap selama 20-60 menit akan
membunuh semua bentuk vegetatif bakteri tapi tidak akan menghancurkan spora. Untuk
meyakinkan penghancuran spora, dilakukan sterilisasi bertingkat. Proses ii dilakukan dengan
waktu yang bervariasi, dari 20-60 menit setiap hari selama 3 hari. Setiap hari setelah
sterilisasi bahan disimpan pada inkubator pada 37oC. Prinsip dari metode ini adalah pada saat
pemaparan pertama, uap membunuh bakteri vegetatif tapi tidak sporanya. Tapi pada saat
bahan disimpan pada inkubator atau pada suhu ruangan selama 24 jam, spora akan tumbuh ke
dalam bentuk vegetatif. Spora yang telah tumbuh ini akan dimatikan pada pemanasan hari ke
dua. Kesuksesan dari proses ini tergantung pada spora yang berkembang ke bentuk vegetatif
selama masa istirahat.

d. Penyaringan (filtrasi)

Penyaringan telah banyak digunakan untuk mensterilkan medium laboratorium dan

larutan yang dapat mengalami kerusakan jika dipanaskan. Penyaringan dengan ukuran pori-
pori 0,45 mikron atau kurang akan menghilangkan jasad renik yang terdapat di dalam larutan
tersebut. Penyaring yang banyak digunakan terbuat dari gelas sinter, selulsa dan asbestos atau
penyaring Seitz. Pori-pori dari penyaring tersebut berkiras antara 0,22 sampai 10 mikron.
Pori-pori yang lebih kasar biasanya digunakan untuk penjernihan sebelum digunakan pori-
pori yang lebih halus, sehingga tidak terjadi penyumbatan. Penyaring yang biasa digunakan
untuk bakteri tidak dapat menahan atau menyaring virus atau mikoplasma.

Beberapa contoh bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini adalah serum, larutan
bikarbonat, enzim, toksin, bakteri, medium sintetik tertentu, dan antibiotik.

Ada beberapa macam filter, yaitu:

1. Filter Swinny

Sebuah adaptasi dari filter seitz, filter swinny mempunyai adaptor khusus yaitu terdiri
dari lapisan asbes, bersama dengan layer dan pencuci. Keutamaan untuk digunakan filter
swinny dibungkus dengan kertas dan autoklaf. Bagian yang dipotong dihubungkan pada spoit
werlock dan cairan dimasukkan ke potongan asbes dengan menggunakan tekanan pada sal
spoit.

2. Filter Fritted-Glass
 Permeabilitas dari filter berbanding lurus dengan ukurannya. Setelah potongan
dibentuk, potongan disegel dengan pemanasan di dalam gelas pirex seperti corong buhcner.

3. Filter Berkefeld dan Mandler

Mandler terbuat dari tanah silika murni, asbestos dan kalium sulfat. Berkefeld juga
tersusun dari tanah silika murni. Masing-masing filter bermuatan negatif.

4. Filter Selas

Filter ini secara kimia bersifat resisten terhadap semua larutan yang tidak menyerang
silika.

5. Filter Candles-Pasteur-Chamberland

Terbuat dari pori porselen tak berkaca dengan pori kecil yang menghasilkan filtrasi
lambat.

e. Sterilisasi dengan desinfektan

Desinfektan adalah zat yang dapat membunuh bakteri. Senyawa kimia yang banyak
digunakan sebagai esinfektan antara lain: larutan AgNO3, CuSO4, HgCl2, ZnO, serta alkohol
dan campurannya. Zat-zat yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri
dapat dibagi atas garam-garam, logam, fenol, dan senyawa-senyawa lain yang sejenis,
formaldehida,yodium, alkohol, klor, zat warna, detergen, sulfonamida, dan antibiotik.
Umumnya bakteri yang muda kurang daya tahannya terhadap desinfektan daripada bakteri
yang tua. Kepekatan, konsentrasi dan lamanya berada di bawah pengaruh desinfetan
merupkan faktor-faktor yang berperan dalam sterilisasi jenis ini.

f. Sterilisasi gas

Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membnih
mikroorganisme dan sporanya. Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi
gas adalah etilena oksida, asam parasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin. Cara ini
diterapkan pada suhu kamar selama 2-18 jam tergantung pada bahan kimianya. Hal-hal yang
perlu diperhatikan dapat sterilisasi gas antara lain:

1) Lamanya waktu yang diperlukan sesudah perlakuan untuk menghilangkan semua sisa
bahan kimia yang digunakan;

2) Daya bahan bakar yang bersangkutan;

3) Persyaratan peralatan;

4) Biaya pelaksanaan.
g. Sterilisasi dengan radiasi

Sterilisasi dengan radiasi dapat dilakukan dengan sinar gamma (sinar UV kadang juga
digunakan tetapi tidak begitu baik karena daya tembusnya lemah) namun penggunaannya
terbatas karena menuntut persyaratan keamanan dan biaya tinggi.

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang

disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis
mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada
medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anorganik ditambah sumber
karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganisme lainnya memerlukan suatu medium
yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks
lainnya (Volk,1993).,

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang
berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat
dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba.
Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus
memenuhi syarat-syarat, antara lain:

- Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba,
- Harus mempunyai tekanan osmosis,
- Tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan
tumbuh,
- Tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba,
- Harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang
ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Sutedjo, 1991).

Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri
dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal
dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali
dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan
indikator. Komposisi media bakteri dapat dimodifikasi sehingga dapat digolongkan menjadi
media umum, media selektif (bakteri tertentu saja yang dapat tumbuh) dan media diferensial
(bakteri tumbuh dengan memberikan ciri-ciri tertentu) (Achmad, 2007).

Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi
padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agar-
agar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang diekstraksi dari alga marin genus
Gelidium, namun sebagian besar mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai
makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).

Media dapat digolongkan berdasarkan bentuk, susunan kimianya, dan fungsinya.

Berdasarkan bentuknya terdiri dari media padat, media semi padat, dan media cair. Bahan
makanan yang dbutuhkan mikroorganisme dibagi menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber
energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumber
nitrogen (Pujiati, 2012).

Menurut Pelczar (1996), klasifikasi medium berdasarkan fungsinya digolongkan

menjadi 7 golongan, yaitu:

1. Medium umum, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan yang bertujuan

menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum. Contoh: Nutrien Agar (NA) untuk
menstimulasi pertumbuhan bakteri, Potato Dextose Agar (PDA) untuk menstimulasi
pertumbuhan fungi.

2. Medium khusus, merupakan medium untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan
kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu. Contoh: medium
tetes tebu untuk Saccharomyces cerevisiae.

3. Media diperkaya (enrichment media), merupakan media yang ditambahkan bahan-

bahan tertentu untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Hal ini dilakukan
untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang jumlahnya sedikit dalam suatu campuran
berbagai mikroba. Contoh: Chocolatemedia dan Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar.

4. Media selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu yang akan
menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan yang ada dalam suatu spesimen.
Inhibitor yang digunakan berupa antibiotik, garam dan bahan-bahan kimia lainnya.

5. Media differensial, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan kimia atau

reagensia tertentu yang menyebabkan mikroba yang tumbuh memperlihatkan perubahan-
perubahan spesifik sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.

6. Medium penguji (Assay medium), merupakan medium dengan susunan ertentu yang
digunakan untuk pengujian senyawa-senyawa tertentu dengan bantuan bakteri. Contoh:
medium untuk menguji vitamin-vitamin, antibiotik, dan lain-lain.

7. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang digunakan untuk
menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan. Contoh: medium untuk menghitung jumlah
bakteri E. Coli air sumur.

Medium harus mengandung nutrien yang merupakan substansi dengan berat molekul
rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah degradasi dari nutrien dengan molekul
yang kompleks. Nutrien dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup,
yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh (Label, 2008)

NA (Nutrien Agar) adalah medium yang digunakan sebagai media pertumbuhan

bakteri. Nutrient agar adalah medium yang diklasifikasikan sebagai medium sintetik
terstruktur karena tersusun oleh komponen yang pasti jenis dan kuantitasnya. NA di buat
dengan komposisi agar–agar yang sudah dipadatkan sehingga NA juga bisa disebut sebagai
nutrisi padat yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Fungsi agar–agar hanya sebagai
pengental namun bukan zat makanan pada bakteri, agar dapat mudah menjadi padat pada
suhu tertentu. Medium Nutrient Agar adalah salah satu medium padat yang memiliki
komposisi yaitu agar–agar yang telah di panaskan dan mencair dengan suhu 950C (Sandra,
2013).

C. Skema kerja

1. Membuat medium umum untuk bakteri (Nutrient Agar/NA dan Nutrien Broth/NB

a. NB manual

Beef extract........................................................................... 3 gram

Peptone ................................................................................. 5 gram

Aquades.................................................................................. 1000 ml

b. NB instant

NB instant.............................................................................. 20 gram
NB........................................................................................... 1000 ml

c.NA manual

Beef extract............................................................................. 3 gram

Peptone ................................................................................... 5 gram

Agar-agar................................................................................. 15 gram
Aguades.................................................................................... 1000 ml

d. NA instan

NA ........................................................................................... 20 gram
Aguades....................................................................................1000 ml

a. Masukkan beef extract, peptone, agar-agar dan aguades ke dalam beaker 1000ml

b. Panaskan di atas kompor pemanas, aduk hingga homogen atau hampir mendidih

c. Masukkan kedalam tabung reaksi masingmasing 10 ml untuk media tegak dan 5:7 ml
untuk media miring

d. Semua tabung medium ditutup dengan dengan kapas yang telah dibungkus dengan kain
kasa

e. Sterilkan dengan autoklaf

f. Setelah disterilkan untuk media tegak biarkan tabung dalam keadaan berdiri dan untuk
media miring tabung miringkan dengan catatan media tidak sampai menyentuh tutup tabung
2. Membuat medium untuk jamur (Potato Dextrose Agar)

a. Manual

Kentang ...................................................................... 200 gram

Dextrose ..................................................................... 10 gram

Agar-agar ................................................................... 15 gram

Aguades....................................................................... 1000 ml

b.Instan (disesuaikan dengan kemasan PDA instan)

PDA ............................................................................. 39 gram

Aquades......................................................................... 1000 ml

a. Kupaslah kentang lalu bersihkan, iris dadu sepanjang 1 cm kemudian dimasak dalam
500 ml aguades dan biarkan mendidih, jaga agar volume tetap
b. Saring ekstrak kentang dan ambil filtratnya
c. Tambahkan dekstrose dan agar-agar serta aguades panaskan pada api sedang sambil
diaduk hingga homogen atau mendidih
d. Masukkan pada tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk media tegak dan 5:7 ml
untuk media miring
e. Semua tabung medium ditutup dengan dengan kapas yang telah dibungkus dengan
kain kasa
f. Sterilkan dengan autoklaf
g. Setelah disterilkan untuk media tegak biarkan tabung dalam keadaan berdiri dan
untuk media miring tabung miringkan dengan catatan media tidak sampai menyentuh
tutup tabung

2. Sterilisasi cara kimia

 Alkohol 70 %
a. Semprotkan alkohol pada tangan dan meja yang akan digunakan untuk pengamatan
b. Bersihkan meja dengan lap bersih

3. Sterilisasi cara fisika

 3 cawan Petri
 Kertas HVS
 Plastik
 Karet
 Autoklaf
a. Bungkus masing'masing cawan Petri dengan kertas HVS kemudian masukkan ke
dalam plastik
b. Istilah autoklaf dengan aguades setinggi batas sarangan .
c. Aturlah suhu sebesar 121 derajat C, dengan tekanan 1 atm dan aturlah waktu yang
akan digunakan sampai pada angka 15-20 menit .
d. Pastikan lubang uap dalam keadaan tertutup (CLOSE)
e. Tarik tuas power sampai ketitik ON lalu tekan tombol ON, apabila lampu hijau
menyala maka dapat dipastikan autoklaf dalam keadaan bekerja .
f. Setelah alarm berbunyi maka tarik tuas power hingga ke titik OFF kemudian bukalah
lubang uap dengan cara memutarnya kearah OPEN .
g. Diamkan autoklaf selama 15 menit untuk mematikan bahwa uap telah keluar dan
autoklaf dalam keadaan tidak panas.
h. Bukalah tutup autoklaf dan keluarkan alat-alat yang telah steril
D. Hasil pengamatan
E. Pembahasan

Sterilisasi merupakan suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup
terutama mikroba. Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi, yaitu
masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Alat yang akan digunakan dalam suatu
penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua
bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan.

Ada empat cara yang sering digunakan dalam sterilisasi dengan pemanasan, yaitu sterilisasi
dengan pemijaran, dengan udara panas (kering), dengan uap panas dan sterilisasi dengan air
panas bertekanan. Sterilisasi dengan pemijaran dilakukan dengan cara memijarkan pada api
lampu spiritus (mengusahakan pada api bagian tengah yang berwarna kebiruan). Teknik
pemijaran ini dilakukan untuk alat jarum inokulasi, ose atau alat lain yang terbuat dari platina
atau nikhrom. Sterilisasi dengan udara panas menggunakan oven (Hot Air Sterilizer).

Alat lain yang digunakan dalam sterilisasi adalah autoklaf. Autoklaf yang berfungsi untuk
sterilisasi dengan uap panas bertekanan. Sterilisasi dengan autoklaf diperlukan panas basah
selama 15 menit pada temperatur 121oC dan dengan tekanan 2 atm.

Selain itu, dalam pengerjaan hal-hal yang berkaitan dengan mikroorganisme, bukan hanya
alat yang perlu disterilkan, tetapi juga telapak tangan kita agar tidak melakukan kontaminasi
terhadap alat-alat yang kita pegang. Untuk itu digunakan alkohol yang disemprotkan dengan
hand sprayer. Alkohol disemprotkan secukupnya, kemudian kita harus memastikan seluruh
permukaan telapak tangan telah terbalut alkohol. Hal ini dilakukan agar telapak tangan kita
benar-benar steril.

Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroba. Selain untuk menumbuhkan mikroba, medium dapat pula untuk
isolasi, memperbanyak mikroba, pengujian sifat – sifat fisiologi dan perhitungan mikroba.

Dalam praktikum kali ini medium yang digunakan adalah NA (Nutrient Agar). NA
digunakan untuk media pertumbuhan bakteri. Pembuatan media ini diawali dengan
melarutkan5 gram NA pada 250 ml aquades pada gelas elemeyer , setelah itu aduk hingga
larutan tercampurdan panaskan menggunakan Bunsen .kemudian dimasukkan ke dalam
autoklaf dengan temperature 121 ͦC dalam waktu 15 menit dan dengan tekanan 2 ATM yang
mana masih dalam kondisi tertutup dengan alumunium foil. Tujuan dari penutupan untuk
menjaga larutan NA dari kontaminasi dari luar.

Setelah pembuatan NA (nautrient agar )di lanjutkan dengan pembuatan medium PDA
(potato dextrose agar )pembuatan media ini diawali dengan melarutkan 3,95 gr PDA pada
100 ml aquades pada gelas elemeyer ,setelah itu aduk hingga tercampur .kemuan panaskan
menggunakan Bunsen setelah itu masuukkan ke dalam autoklaf dalam waktu 15 menit yang
mana dalam kondisi tertutup dengan alumunium foil ,tujuan ini untuk menjaga larutan tifak
terkontaminasi dari luar.
F. Daftar pustaka

Adam,MR. 2001. Microbiology of Fermented Food .Elsivier Applied Science Publisher,Ltd.

New York.

Burrows, W., J.M. Moulder, and R.M. Lewert. 2004. Texbook of Microbiology. W.B.
Saunders Company. Philadelphia.

Bergey’s. 2005. Manual of Systematic Bacteriology. Department of Microbiologyand

Molecular Genetics: Michigan State University

Cappuccino,JG.& Sherman,N. 2000. Microbiology: A Laboratory Manual. The

Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc. California.

ACARA II PENGAMBILAN SAMPEL DAN PEMBIAKAN MIKROORGANISME

HARI/TANGGAL: 16 NOVEMBER 2020

A. TUJUAN PRAKTIKUM
- Mempelajari langkah-langkah pengambilan sampel
- Mempelajari morfologi koloni mikroba pada media agar nutrisi padat
B. TINJAUAN PUSTAKA

Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan kompleks. Ratusan spesies
mikroba menghuni bagian tubuh kita, seperti mulut, saluran pencernaan dan kulit. Udara,
tanah, dan air yang merupakan komponen alam sebagai tempat tinggal kita juga dihuni
oleh beragam mikroorganisme (Hadioetomo, 1985).
Untuk mempelajari mikroba, kita perlu membiakkannya pada media terlebih
dahulu. Namun sebelum kita melakukan pembiakan mikroba, hal yang penting untuk
dilakukan adalah melakukan pengambilan sampel. Teknik pengambilan sampel
merupakan suatu aspekpenting yangharus diperhatikan ketika melakukan penelitian
mikrobiologi. sampel yang diambil haruslah merupakan representasi dari seluruh bagian
yang diteliti. Untuk itu diperlukan teknik yang benar agar terhindar dari kesalahan yang
mengakibatkan sampel menjadi bias. Setelah itu kita juga harus mengenal tentang
pertumbuhan mikroba.
Menurut Benefield dan Randall (1980) pertumbuhan bakteri sederhana
didefinisikan sebagai peningkatan jumlah mikroorganisme per unit  waktu. Kebanyakan
bakteri bereproduksi dengan cara membelah diri, di mana akan terbentuk dua sel baru dari
satu sel induk. Waktu yang dibutuhkan untuk membentuk dua sel baru tersebut
dinamakan waktu generasi. Waktu generasi bervariasi tergantung pada spesies dan
kondisi pertumbuhan, ada yang hanya beberapa menit ada yang sampai beberapa jam.
Jika bakteri ditanam dalam suatu larutan biak, maka bakteri akan terus tumbuh sampai
salah satu faktor kebutuhannya mencapai minimum dan pertumbuhan menjadi terbatas.
Kalau sepanjang peristiwa ini tidak terjadi tidak terjadi penambahan nutrisi atau
penyaluran keluar produk–produk metabolisme, maka pertumbuhan dalam lingkungan
hidup seperti ini mematuhi hukum– hukum, yang tidak hanya berlaku bagi organisme
bersel tunggal saja, tetapi juga untuk organisme bersel banyak dengan pertumbuhan yang
dibatasi secara genetik (Burrows, 2004).Dapat dilihat dibawah teknik-teknik berikut: 

2.1 Teknik Pengambilan Sampel

       Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut
merupakan prosedur pengambilan sampel.
1. Sampel tanah
     Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara
pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan
mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan
hingga ujung perakaran.
2. Sampel udara
      Jika mikroba yang diinginkan adalah berada di udara sekitar, misalnya di kamar mandi,
ruangan dan lain-lain, maka caranya hanya dengan membuka tutup cawan petri yang berisi
media steril selama ±5 menit.
3. Sampel air
       Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal dari air
sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air.
Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali,
jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa
saat dan mulut kran dibakar.

2.2 Fase Pertumbuhan Bakteri 

      Pertumbuhan mikroba dalam suatu medium mengalami fase-fase yang berbeda, yang
berturut-turut disebut dengan fase lag,  fase exponensial, fase stasioner, dan fase kematian.
Pada fase kematian exponensial tidak diamati pad kondisi umum pertumbuhan kultur bakteri,
kecuali bila kematian dipercepat dengan penambahan zat kimia toksik, panas atau radiasi
(Sofa, 2008).
Fase lag merupakan fase yang dilakukan mikroorganisme untuk beradaptasi dengan
lingkungannya yang baru sebelum memulai pertumbuhan. Waktu yang dibutuhkan untuk
berkembang biak cukup lama, kecepatan pertumbuhan berada pada titik yang rendah
mendekati nol dengan waktu generasi yang panjang. Ukuran serta kecepatan aktivitas
metabolisme berada pada kondisi maksimum. Fase log akan pendek jika inokulum yang
dipakai adalah bakteri pada pertumbuhan eksponensial dan media memiliki komposisi yang
sama dengan media pertumbuhan sebelumnya. Inokulasi bakteri pada fase stasioner atau
inokulasi ke media dengan komposisi berbeda akan menghasilkan fase lag sepuluh sampai
dua puluh jam lebih lama.

Fase lag mengindikasikan waktu yang diperlukan bakteri untuk mensintesis enzim
yang dibutuhkan dalam metabolisme nutrisi baru. Setelah aklimatisasi sel akan mengalami
fase percepatan pertumbuhan eksponensial, di mana nutrisi digunakan untuk membentuk
materi sel baru. Pada tahap ini waktu yang dibutuhkan untuk berkembang biak semakin
pendek

        Pada tahap fase eksponensial ini waktu yang dibutuhkan untuk berkembang biak atau
waktu generasi berada pada kondisi minimal atau konstan, kecepatan pertumbuhan spesifik
berada pada kondisi maksimal atau konstan. Terjadinya kondisi ini ditandai dengan nilai
DNA/sel, RNA/sel, protein/sel dan kerapatan sel berada pada kondisi konstan, sedangkan
untuk ukuran sel biasanya minimum. Karena kecepatan pembelahan diri relatif konstan maka
tahap ini paling cocok untuk menetapkan kecepatan pembelahan diri dan kecepatan
pertumbuhan. Selain dapat juga digunakan untuk mempelajari faktor – faktor lingkungan dan
untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam menggunakan substrat (Burrows,
2004).

        Pada fase ini nutrien telah habis, konsentrasi tinggi dari hasil metabolisme yang bersifat
toksik, serta mempunyai kepadatan populasi yang tinggi. Fase stasioner merupakan fase
keseimbangan antara pertumbuhan dan kematian sel. Sebenarnya dalam fase ini sel berada
pada tahap tidak melakukan aktivitas (suspended animation), dengan berakhirnya fase
stasioner akan diikuti dengan mulainya fase kematian. Pada fase ini proses metabolisme
berhenti, laju kematian meningkat dan ada kemungkinan sel – sel dihancurkan oleh pengaruh
enzim yang berasal dari sel itu sendiri (autolisis). Ketika proses lisis terjadi nutrien
intraselular terlepas ke dalam medium yang kemudian dapat digunakan oleh mikroorganisme
lain yang masih hidup (Adam, 2001).
2.3FaktoryangMempengaruhiPertumbuhanBakteri
    Bakteri dapat tumbuh dengan baik pada lingkungan yang lembap. Jika keadaan lingkungan
menjadi kering, kegiatan metabolismenya terhenti. Dalam keadaan ini bakteri akan
membentuk spora yang dapat bertahan hidup dalam jangka waktu yang lama. Sel bakteri
mempunyai tekanan osmosis tertentu, sehingga menghendaki lingkungan yang tekanan
osmosisnya sama dengan tekanan osmosis sel (isotonis). Jika sel bakteri berada pada
lingkungan yang hipertonis (misalnya dalam larutan gula/garam yang pekat) pertumbuhannya
akan terhambat karena dapat menyebabkan plasmolisis, yaitu terlepasnya membran sel dari
dinding sel (Burrows, 2004).

Beberapa jenis bakteri dapat hidup dengan baik pada pH tinggi (lingkungan bersifat
basa) maupun pada pH rendah (lingkungan bersifat asam), namun kebanyakan bakteri
memerlukan pH antara 6,5 – 7,5. Thiobacillus ferrooxidans dapat tumbuh dengan baik pada
pH 1,3.Pada umumnya radiasi cahaya menyebabkan kerusakan pada bakteri nonfotosintetik.
Cahaya dengan panjang gelombang yang pendek jika dipaparkan pada bakteri akan
menyebabkan ionisasi komponen sel yang dapat berakibat pada kematian. Oleh karena itu
energi radiasi dari sinar X, sinar gamma, dan sinar ultraviolet banyak digunakan untuk
sterilisasi bahan makanan. Beberapa bahan kimia seperti antibiotik dan desinfektan dapat
merusak dan mematikan sel bakteri, sehingga keberadaan bahan kimia dapat menghambat
pertumbuhan bakteri (Cappuccino, 2000).

2.4 Media Pertumbuhan Bakteri

 Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-
zat makanan atau nutrisi yang diperlukan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme khususnya bakteri memanfaatkan nutrisi di dalam media berupa molekul-
molekul terkecil yang dirakit untuk menyusus komponen sel. Dengan media, pertumbuhan
dapat dilakukan dengan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni, juga memanipulasi
komposisi media pertumbuhannya. Bahan dasar adalah air sebagai pelarut dari agar dimana
agar tersebut berfungsi sebagai pemadat media (Soni, Ahmad, 2010).
Bahan yang didinokulasikan pada medium tersebut disebut inoculum. Dengan
menginokulasi medium agar nutrient (nutrient agar) dengan metode cawan gores atau dengan
metode cawan tuang. Sel-sel mikroba akan terpisah sendiri-sendiri. Jika dua sel pada
inoculum asal terlalu berdekatan letaknya pada medium agar, maka koloni yang terbentuk
dari masing-masing sel dapat bercampur dengan sesamanya, atau paling tidak bersentuhan,
jadi massa sel dapt diamati dalam medium agar, bukanlah suatu biakan yang murni (Pelczar,
2008).
 Setiap mikrobia dapat diinkubasi dengan media tertentu sesuai dengan sifat-sifat
karakteristik biosintesisnya. Media PCA (plate count agar) dan NA (nutrient agar) biasa
digunakan untuk pemupukan bakteri dan media PDA (potato dextrose agar) biasanya
digunakan untuk pemupukan jamur (Fardiaz, 1994).
Penurunan jumlah bakteri disebabkan oleh perbedaan daya tahan mikroba terhadap kadar
garam sangat bervariasi, tergantung dari sifat dinding sel dan tekanan osmotic internal
mikroorganisme tersebut. Selain itu juga penurunan jumlah total bakteri ,menunjukkan fase
menuju kematian dan fase kematian. Pada fase ini sebagian populasi jasad renik mulai
mengalami kematian karena beberapa faktor yaitu nutrient di dalam medium sudah habis, dan
energy cadangan di dalam sel sudah habis (Erungan et al., 2009).
 

C. SKEMA KERJA

1. Carilah lahan yang akan diambil sampel tanahnya

2. Cabuti rumput atau tanaman lain yang mungkin

tumbuh di atas bagian lahan yang akan diambil sampel
ta tanahnya

3. Pasang sarung tangan

4. Tancapkan auger. Jika tidak ada auger, bisa dilakukan dengan

sendok atau spatula steril. Tanah yang diambil minimal 4 cm dari
permukaan

5. Masukkan tanah ke dalam plastic klip steril

 6. Timbang 1 gram sampel tanah dengan prosedur aseptis

7. Masukkan ke dalam tabung eppendoorf

8.Tambahkan 10 ml buffer phosphate

9. Kocok -kocok tabung sebanyak 25 kali

10. Segera lakukan langkah pembiakan terhadap sampel .

B. Pengambilan Sampel Bakteri pada Permukaan Daun

Alat:

- Sarung tangan steril

- Neraca
- Spatula steril
- Beaker glass 100ml steril

Bahan: |

O,1 % larutan pepton dengan kandungan 1 Y tergitol Sayuran

Langkah Kerja:

- Kenakan sarung tangan steril

- Timbang 5 gram sayuran dengan prosedur aseptis
- Masukkan sayuran ke dalam glass beaker
- Tambah 45 ml larutan pepton, aduk menggun sampai 30 menit
- Diamkan selama 30 menit
- Homogenkan selama 10-15 detik
- Segera lakukan langkah pembiakan terhadap sampel

C. Teknik Swab dengan Pelarut

Alat :

- Template 10 x 10 cm steril
- Swab steril (2 buah)
- Glass beads (3 buah)
- Tabung eppendorf 14 ml steril
- Gunting steril

Bahan :

- Aguades steril

Langkah Kerja :

1. Masukkan aguades steril sebanyak 10 ml

2. Tentukan permukaan yang akan diambil sampelnya, letakkan template di atas
permukaan tersebut
3. Basahi swab pertama, usap permukaan bagian dalam template menggunakan swab
dengan arah mendatar
4. Balik swab, ulangi mengusap permukaan dengan arah membujur
5. Patahkan pangkal swab yang terpegang oleh tangan, masukkan swab ke dalam tabung
eppendorf
6. Ambil swab kering, ulangi langkah 3 sampai 5.
7. Kocok -kocok tabung eppendorf sebanyak 25 kali
8. Segera lakukan langkah pembiakan terhadap sampel

D. Teknik Pengambilan Sampel Bakteri Kulit (Teknik Swab)

Alat :
- Swab steril
Bahan :
- Larutan NaCl 0,85 %

Langkah Kerja:

1. Celupkan swab steril ke dalam larutan NaCl 0,85 8 2.

2. Oles permukaan kulit dengan swab s
3. Oles swab ke media agar
4. Inkubasi selama 24 jam
5. Lakukan pengamatan terhadap koloni bakteri

E. Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah
mikroba yang tersuspensi dalam cairan.

F. Pembiakan Sampel Cair dengan Metode Pour Plate

Alat :
- Laminar Air Flow
- Erlenmeyer
- Bunsen
- Pipet 1 ml steril
- 3 Cawan yang berisi media NA
- Kertas label
Bahan :
- Alkohol 70 46

Sampel bakteri (bakteri tanah, permukaan daun, dan debu)

Langkah Kerja :

1. Beri label masing masing cawan

2. Pipet 0,1 ml sampel, masukkan ke dalam cawan petri steril
3. tuangkan media NA kedalam cawan petri yang ada sampel mikrobanya
4. Panaskan di atas Bunsen
5. Biarkan dingin (di dalam cawan, ratakan sampel bakteri dengan memutar cawan petri
seperti angka 8 secara perlahan).
6. Balik cawan, inkubasi selama 24 atau 48 jam pada suhu ruang atau pada 30'C
7. Lakukan pengamatan terhadap koloni mikroba meliputi :
 jumlah koloni
 warna koloni
 bentuk koloni
 ukuran koloni
 mengkilat atau suram
 dan sketsa atau gambar koloni
D. Hasil pengamatan
E. Pembahasan

Pada praktikum yang dilakukan pada hari jumat tanggal 16 novemer 2020.Pada
praktikum acara ke 2 ini kami melakukan pengambilan sampel dan melakukan
pembiakan sampel dengan cara langkah pertama kita mmberi label masing masing
cawan kemudian ambil pipet 0,1 ml sampel, masukkan ke dalam cawan petri steril
lalu tuangkan media NA kedalam cawan petri yang ada sampel mikrobanya kemudian
panaskan di atas Bunsen dan biarkan dingin (di dalam cawan, ratakan sampel bakteri
dengan memutar cawan petri seperti angka 8 secara perlahan).langkah selanjutnya
balik cawan, inkubasi selama 24 atau 48 jam pada suhu ruang atau pada 30'C

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi

terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini
dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari
morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Dalam pengaplikasiannya dikenal
banyak teknik dalam pengambilan sampel. Dapat dilihat dibawah teknik-teknik
berikut:
2.1 Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel.
Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel.
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka
cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang
diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran
dekat permukaan hingga ujung perakaran.
2. Sampel udara
Jika mikroba yang diinginkan adalah berada di udara sekitar, misalnya di kamar
mandi, ruangan dan lain-lain, maka caranya hanya dengan membuka tutup cawan
petri yang berisi media steril selama ±5 menit.
3. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal
dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol
melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol
 dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka
sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.
2.2 Fase Pertumbuhan Bakteri
Pertumbuhan mikroba dalam suatu medium mengalami fase-fase yang berbeda,
yang berturut-turut disebut dengan fase lag, fase exponensial, fase stasioner, dan fase
kematian. Pada fase kematian exponensial tidak diamati pad kondisi umum
pertumbuhan kultur bakteri, kecuali bila kematian dipercepat dengan penambahan zat
kimia toksik, panas atau radiasi (Sofa, 2008).
Fase lag merupakan fase yang dilakukan mikroorganisme untuk beradaptasi
dengan lingkungannya yang baru sebelum memulai pertumbuhan. Waktu yang
dibutuhkan untuk berkembang biak cukup lama, kecepatan pertumbuhan berada pada
titik yang rendah mendekati nol dengan waktu generasi yang panjang. Ukuran serta
kecepatan aktivitas metabolisme berada pada kondisi maksimum. Fase log akan
pendek jika inokulum yang dipakai adalah bakteri pada pertumbuhan eksponensial
dan media memiliki komposisi yang sama dengan media pertumbuhan sebelumnya.
Inokulasi bakteri pada fase stasioner atau inokulasi ke media dengan komposisi
berbeda akan menghasilkan fase lag sepuluh sampai dua puluh jam lebih lama. Fase
lag mengindikasikan waktu yang diperlukan bakteri untuk mensintesis enzim yang
dibutuhkan dalam metabolisme nutrisi baru. Setelah aklimatisasi sel akan mengalami
fase percepatan pertumbuhan eksponensial, di mana nutrisi digunakan untuk
membentuk materi sel baru. Pada tahap ini waktu yang dibutuhkan untuk berkembang
biak semakin pendek dan terjadi peningkatan kecepatan pertumbuhan (Adam, 2001).
Pada tahap fase eksponensial ini waktu yang dibutuhkan untuk berkembang biak
atau waktu generasi berada pada kondisi minimal atau konstan, kecepatan
pertumbuhan spesifik berada pada kondisi maksimal atau konstan. Terjadinya kondisi
ini ditandai dengan nilai DNA/sel, RNA/sel, protein/sel dan kerapatan sel berada pada
kondisi konstan, sedangkan untuk ukuran sel biasanya minimum. Karena kecepatan
pembelahan diri relatif konstan maka tahap ini paling cocok untuk menetapkan
kecepatan pembelahan diri dan kecepatan pertumbuhan. Selain dapat juga digunakan
untuk mempelajari faktor – faktor lingkungan dan untuk mengetahui kemampuan
mikroorganisme dalam menggunakan substrat (Burrows, 2004).

Pada fase ini nutrien telah habis, konsentrasi tinggi dari hasil metabolisme yang bersifat
toksik, serta mempunyai kepadatan populasi yang tinggi. Fase stasioner merupakan fase
keseimbangan antara pertumbuhan dan kematian sel. Sebenarnya dalam fase ini sel berada
pada tahap tidak melakukan aktivitas (suspended animation), dengan berakhirnya fase
stasioner akan diikuti dengan mulainya fase kematian. Pada fase ini proses metabolisme
berhenti, laju kematian meningkat dan ada kemungkinan sel – sel dihancurkan oleh pengaruh
enzim yang berasal dari sel itu sendiri (autolisis). Ketika proses lisis terjadi nutrien
intraselular terlepas ke dalam medium yang kemudian dapat digunakan oleh mikroorganisme
lain yang masih hidup (Adam, 2001).

F. Daftar pustaka

Admin., 2008, Perkembangan-Mikrobiologi. Diakses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar.

Dwidjoseputro, S., 1992, Mikrobiologi Pangan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Ferdias,

S., 1992, Mikrobiologi Pangan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Lay, B., 1994, Analisis

Mikroba di Laboratorium, Raja Grafindo Persada, Jakarta. Pelczar, Michael, J., 1986, Dasar-
Dasar Mikrobiologi, Universitas Indonesia, Jakarta. DIarsipkan di bawah: microbiology