ASISTEN KELOMPOK:
1. Dapat memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat
dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi serta mampu menyiapakan dan
membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi.
2. Dapat mengamati hasil dari proses sterilisasi alat dan bahan pada pengujian
mikrobiologi.
Mikrobiologi merupakan suatu istilah luas yang berarti studi tentang organisme hidup
yang terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Mikrobiologi mencakup studi
tentang bakteri (bakteriologi), virus (virologi), khamir dan jamur (mikologi); protozoa
(protozoologi), beberapa ganggang, dan beberapa bentuk kehidupan yang tidak sesuai untuk
dimasukkan ke dalam kelompok tersebut di atas.
1
· Panas tersembunyi yang berlimpah
· Kemapuan untuk membentuk kondensasi air
· Kontraksi volume yang timbul selama kondensasi
2
Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena sterilisasi ini
menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan tidak menghancurkan
mikroorganisme tersebut. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya
akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Filter biasanya terbuat
dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus karena
virus tidak akan tersaring dengan metode ini.
Kegunaan:
- Untuk sterilisasi media yang tidak tahan terhadap pemanasan, misalnya Urea
Broth ataupun untuk sterilisasi vaksin, serum, enzim, vitamin.
- Meminimalkan kuman udara masuk untuk ruangan kerja secara aseptis
Faktor- faktor dari filter bakteri yaitu keseimbangan permukaan antara bahan dari
filter dengan bakteri dari larutan, tekanan yang digunakan, waktu filtrasi, muatan
listrik dan filter, pH dari bahan yang disaring dan absorpsi dari protein dan bahan lain
(Validation of Pharmaceutical Processes : 151).
4. Sterilisasi kimia
Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh
mikroorganisme dan sporanya. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk
mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir
jalur sterilisasi. Sterilisasi gas biasanya digunakan untuk bahan yang tidak bisa
difiltrasi, tidak tahan panas dan tidak tahan radiasi atau cahaya.
Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi
gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri
tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi
melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan,
persyaratan desain khusus pada bahan pengemas (Pharmaceutical Technology : 281).
Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen
oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida,
kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi,
makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi
gugus –SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga
protein mengalami kerusakan dan mikroba mati.
3
Gas Etilen Oksida : Efektif membunuh semua jenis mikroba, virus, fungi,
kelemahannya mudah terbakar dan hanya untuk suhu kurang dari 60OC.
Gas Ozon : Membunuh pathogen, salah satunya prion (penginfeksi protein)
Gas Klorin : Membunuh spora bakteri
Formaldehid : Sterilisasi vaksin
H2O2 : Membunuh patogen.
Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian
mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembap) dan metode sterilisasi panas
kering.
Media merupakan bahan nutrisi yang disiapkan unutk pertumbuhan mikroba. Agar-
agar merupakan kompleks merupakan kompleks polisakarida, dihasilkan oleh alga laut dan
digunakan untuk pemadat pada makanan. Keunggulan agar yaitu mencair pada suhuy yang
sama dengan air, namun tetap dalam keadaan cair sampain suhu 400C (Suryanto dan Munir,
2006).
4
Macam-Macam Media Pertumbuhan :
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin
media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga
menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat
dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media
tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri
yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan
membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair
maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk
mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi
anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga
diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya
adalah NB (Nutrient Broth), LB(Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara
pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan
ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara
detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat
diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya,
misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba,
misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga
media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang
pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium
5
yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan
menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4%
untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum,
kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri
yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana
untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood
Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.
Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu
mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji
kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba.
Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia.
Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar
karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron
Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran
koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.
Syarat media yang akan digunakan itu harus mengandung zat hara untuk mikroba,
mempunyai tegangan osmosis, tegangan pemukaan, pH, dan lingkungan yg sesuai, tidak
toxic, harus steril (Syafa'atin Ani, DRA. 2010. Panduan Laboratorium Mikrobiologi. Bandung).
Pada praktikum ini, media yang dipergunakan adalah media berupa Nutrient agar dan
Nutrient broth.
Natrium Agar (NA) merupakan suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari algae
marin tertentu, diolah untuk membuang substansi yang tidak dikehendaki. Natrium agar
digunakan sebagai bahan pemadat media, agar yang lebur dalam larutan cair akan
membentuk gel bila suhu dikurangi sampai di bawah 45°C. Agar tidak merupakan sumber
6
nutrien dari bakteri. Medium (NA) berdasarkan kimianya merupakan medium non
sintetik/semi alamiah, berdasarkan konsistensinya merupakan medium padat.
Pada saat penyimpanan, media nutrient agar tidak boleh dibekukan. Hal ini dilakukan untuk
menghindari kondensasi dan menetes ke permukaan agar yang dapat memfasilitasi
pergerakan organisme dalam koloni (Serendip, 2005).
Bahan-bahan untuk NA: ekstrak khamir 3 gram, pepton 5 gram, NaCl 5 gram, agar-agar 15
gram, air suling 1 L (Anonim, 2006).
Sedangkan Nutrien Broth (NB) merupakan gabungan ekstrak daging sapi (sumber
karbohidrat) dan pepton (untuk menumbuhkan mikroba). Ekstrak daging sapi merupakan
suatu ekstrak jaringan yang empuk, dikonsentrasikan menjadi pasta. Ekstrak daging sapi
mengandung substansi jaringan hewan yang dapat larut dalam air, meliputi karbohidrat,
senyawa nitrogen organik, vitamin yang dapat larut dalam air, dan garam-garaman. Pepton
merupakan produk yang dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein seperti
aging, kasein, dan gelatin. Pencernaan bahan-bahan protein dicapai dengan asam atau
enzim, banyak pepton yang berbeda-beda (bergantung pada protein yang digunakan dan
metode pencernaannya) tersedia untuk digunakan dalam media bakteriologis. Pepton
berbeda-beda dalam kemampuannya untuk menunjang pertumbuhan bakteri. Pepton
adalah sumber utama nitrogen organik, dapat pula mengandung vitamin dan kadang-kadang
karbohidrat, bergantung kepada jenis bahan berkandungan protein yang dicernakan.
(Pelczar, Michael J, Jr dan E.C.S.Chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi (Terjemahan).
Jakarta : Universitas Indonesia)
Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama
dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut.
1. Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.
2. Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.
3. 3. Atur pH sampai 7,0.
4. 4. Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.
5. 5. Sterilisasi dengan autoklaf.
Fungsi pepton adalah protein dan banyak mengandung N2. Beef ext berisi garam mineral dan
lainnya, agar-agar sebagai zat pengentalnya.
(Dwidjoseputro D. Prof.Dr. 1964. Dasar-dasar mikrobiologi. Malang : Djambatan)
7
Perbedaan Natrium Agar (NA) dan Nutrien Broth (NB) adalah NA ada pengentalnya
yaitu agar, dan media NA digunakan untuk umum tidak untuk mikroba yang spesifik,
sedangkan NB tidak ada pengentalnya dan digunakan untuk bakteri yang spesifik.
(Syafa'atin Ani, DRA. 2010. Panduan Laboratorium Mikrobiologi. Bandung)
III. 2. Bahan
- Nutrient Agar (NA)
- Nutrient Broth (NB)
8
bakteri/jamur
1. Pada persiapan dan sterilisasi Orange Jernih Tidak ada koloni
alat, alat-alat yang akan bakteri/jamur
disterilisasi dicuci bersih dan
dikeringkan. Semua alat-alat
yang memiliki mulut (seperti
tabung reaksi, erlenmeyer,
botol media, gelas ukur, labu
takar, pipet) ditutup dengan
kapas. Pertama-tama diambil
kain kasa dan diletakkan di atas
mulut setiap alat, kemudian
diambil sepotong kapas dan
dilipat kedua ujungnya sehingga
berbentuk segi empat (besarnya
tergantung besar mulut). Kapas
digulung hingga membentuk
silinder yang cukup padat,
dimasukkan ke dalam mulut alat
dan diikat dengan benang
kasur. Untuk erlenmeyer, gelas
ukur, labu takar ditutup lagi
dengan aluminium foil dan
diikat kembali dengan benang
kasur. Untuk tabung reaksi,
kesepuluh tabung reaksi
dikumpulkan dan dibungkus
dengan kertas putih, diikat
dengan benang kasur. Untuk
cawan petri, di bungkus
seluruhny dngan kertas putih.
uUntuk pipet ukur, dimasukkan
kapas di mulut pipet engan
ujung yang lainnya dibungkus
9
aluminium foil dan dibungkus
seluruhnya dengan kertas
bersih. Semua alat pada
percobaan ini dikelompokkan
secara umum ke dalam alat-alat
yang presisi, disterilkan dengan
autoklaf pada suhu 121°C,
selama 15-20 menit. Setelah
disterilisasi, alat-alat kemudian
dikeluarkan dan di diamkan
pada suhu kamar.
2. Pada pembuatan dan sterilisasi Kuning Jernih Tidak ada koloni
media serta larutan pengencer, bakteri/jamur
komposisi yang dibutuhkan
untuk membuat media
diperhatikan. Nutrien agar
ditimbang sebanyak 5 gram
untuk pembuatan 250 ml,
nutrien Broth ditimbang 1,69
gram untuk pembuatan 130 ml.
Masing-masing media yang
telah ditimbang dimasukkan ke
dalam erlenmeyer yang sudah
diberi etiket. Ditambahkan
aakuades, lalu dipanaskan di
atas nyala api bunsen sambil
diaduk sampai larutan tidak
keruh lagi/jernih. Di diamkan di
suhu ruangan dan ditunggu
sampai dingin. Setelah dingin,
diletakkan kain kasa di atas
mulut erlenmeyer, kemudian di
gulung-gulung kapas hingga
padat dan masuk ke alam mulut
10
erlenmeyer dan di ikat
menggunakan benang kasur.
Kemudian dilapisi kembali
dengan aluminium foil dan
diikat dengan benang kasur.
Disterilisadi dengan autoklaf
121°C, selama 15-20 menit. Di
keluarkan dari autoklaf dan
disimpan pada suhu kamar.
V. Perhitungan
20 gram X
1000 ml 250 ml
1000 X = 5000
X = 5 gram
13 gram X
1000 ml 130 ml
1000 X = 1690
X = 1,69 gram
11
VI. Pembahasan
Hasil yang diperoleh adalah pada NA maupun NB keduanya tidak ditumbuhi koloni
bakteri/jamur. NA berubah warna menjadi orange dan bebentuk agar (padat) sedangkan NB
berwarna kuning dan larutannya jernih sekali.
Menurut kelompok kami dari kelima metode sterilisasi yang sudah dijelaskan tadi,
yang paling efektif adalah sterilisasi uap air panas (panas lembap). Karena selain dapat
hampir semua alat bisa disterilisasi dengan cara tersebut, metode ini juga hanya
membutuhkan waktu sterilisasi yang singkat sekaligus lebih cepat dari metode lainnya, pada
sterilisasi ini hanya dibutuhkan waktu 15- 20 menit pada derajat 121 C. Selain itu dalam segi
biaya pun lebih murah dari pada metode sterilisasi yang lain, seperti sterilisasi dengan cara
radiasi dan sterilisasi kimia membutuhkan dana yang lebih besar. Serta sterilisasi tersebut
untuk sterilisasi secara besar-besaran, seperti sterilisasi di industri.
1. Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diperoleh suatu kesimpulan, dimana
sterilisasi merupakan suatu proses pemusnahan mikroba yang tidak kita inginkan dengan
cara membunuh mikroorganisme tersebut.
4. Medium NA pada tahap akhir berwarna kuning, sedangkan medium PDA berwarna
kuning pucat. Medium NA berguna untuk menumbuhkan bakteri dan medium PDA
berguna untuk menumbuhkan fungi.
12
VIII. Daftar Pustaka
2009 rgmaisyah
13
Prosedur Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
http://www.ojimori.com/2011/07/09/prosedur-pembuatan-media-nutrient-agar-na/
Ojimori News
Hadioetomo, R.S. 1993. M ikrob iologi Dasar dalam P raktik : Teknik dan
P rosedur Dasar Lab o rato rium. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Lay, B.W & S. Hastowo. 1992.M ikro b io lo gi. Rajawali Pers, Jakarta.
14