Susu Sci. & Technol.

(2012) 92: 121 - 132 DOI

10.1007 / s13594-011-0052-3

KERTAS ASLI

ELISA sandwich yang sangat sensitif

untuk penentuan glycomacropeptide untuk
mendeteksi cairan whey dalam susu mentah

Norma A. Ch ávez & Juan Jauregui & Laura 
A. Palomares & Karla E. Macías & Mariela 
Jiménez & Eva Salinas

Diterima: 1 Juli 2011 / Direvisi: 23 September 2011 / Diterima: 25 Oktober 2011 /

Diterbitkan online: 18 Januari 2012
# The Author (s) 2012. Artikel ini dipublikasikan dengan akses terbuka di Springerlink.com

Abstrak Industri dan distributor pengolahan susu mengalami masalah pemalsuan

susu cair dengan penambahan whey keju sapi. Baru-baru ini, deteksi penipuan
manipulasi susu dengan whey difokuskan pada identifikasi glycomacropeptide
(GMP). Metode non-imunologi saat ini untuk mendeteksi GMP dalam produk susu
mahal dan memakan waktu atau memiliki sensitivitas yang rendah. Dalam studi ini,
tes sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) baru untuk deteksi dan
kuantifikasi whey dalam susu mentah dikembangkan, menggunakan antibodi
anti-GMP kelinci poliklonal. Kurva kalibrasi dibuat dengan menganalisis standar susu
mentah yang mengandung konsentrasi berbeda dari whey keju cair (0,02 -
20%). Metode ini memiliki batas deteksi 0,047% ( v / v) dan batas kuantifikasi
0,14% ( v / v). Antibodi menunjukkan spesifisitas tinggi dan tidak ada reaksi silang dengan
komponen susu (selain κ- kasein) dan berhasil mendeteksi GMP pada produk komersial
susu. Rasio perolehan kembali antara 95,62% dan 113,88% untuk semua matriks yang
diuji. Koefisien variasi intra-assay dan interassay masing-masing adalah <6% dan <7%.
Akhirnya, dapat disimpan selama 3 bulan dalam bentuk kit yang siap pakai, dengan tetap
menjaga keakuratan dan reproduktifitasnya.

NA Ch ávez: J. Jauregui: KE Macías
Departamento de Ingenier ía Bioquímica, Universidad Autónoma de Aguascalientes, Av. 
Universidad # 940, 20131 Aguascalientes, Ags, México

LA Palomares
Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnolog ía, Universidad Nacional 
Autónoma de México, Apartado Postal 510‑3, 62250 Cuernavaca, Morelos, México

M. Jim énez: E. Salinas (*)
Departamento de Microbiolog ía, Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de 
Aguascalientes, Av. Universidad # 940, 20131 Aguascalientes, Ags, México e‑mail: 
emsalin@correo.uaa.mx
122 NA Chavez dkk.

高 灵 敏 夹 心 酶 联 免 疫 法 检 测 乳 清 中 酪 蛋 白 糖 巨 肽

摘 要 乳 品 生 产 企 业 和 销 售 商 们 经 常 会 遇 到 在 液 奶 及 乳 制 品 中 加 入 干 酪 乳 清 的 问 题 。 近 年 来,
通 过 分 析 酪 蛋 白 糖 巨 肽 ( GMP) 的 含 量 来 确 定 乳 中 是 否 掺 杂 干 酪 乳 清 。 非 免 疫 法 检 测 乳 制 品 中
GMP 既 昂 贵 又 耗 时, 而 且 灵 敏 度 低 。 目 前, 开 发 了 一 种 新 的 夹 心 酶 联 免 疫 ( ELISA) 法 实 现 了 原
料 乳 中 乳 清 掺 假 问 题 的 定 性 和 定 量 检 测 。 该 方 法 以 多 克 隆 兔 抗 酪 蛋 白 糖 巨 肽 作 为 抗 体, 以 已
知 浓 度 的 液 态 干 酪 乳 清 ( 0,02 - 20%) 为 标 准 品 建 立 校 正 曲 线 。 方 法 的 检 测 限 为 0,047% (v / v),
定 量 限 为 0,14% (v / v) 。 抗 体 具 有 专一 性, 与 乳 中 其 它 成 分 ( κ- 酪 蛋 白 除 外) 没 有 交 叉 反 应, 能
够 成 功 的 用 于 乳 制 品 中 酪 蛋 白 糖 巨 肽 的 检 测 。 对 实 验 样 品 检 测 的 检 测 回 收 率 在 95,62% ∼
113,88% 。 批 间 和 批 内 变 异 系 数 分别 小 于 6% 和 7% 。 该 抗 体 在 三个 月 内, 其 准 确 度 和 重 复 性 保
持 不 变, 并 且 可 以 随 时 取 用 。

Kata kunci Glycomacropeptide. Antibodi poliklonal. Whey keju. Susu . ELISA

关 键 词 酪 蛋 白 糖 巨 肽. 多 克 隆 抗 体. 干 酪 乳 清. 乳. 酶 联 免 疫

1. Perkenalan

Susu memiliki nilai gizi dan biologis yang tinggi, oleh karena itu susu merupakan makanan yang
penting untuk dikonsumsi manusia. Namun, dapat dipalsukan dalam banyak hal yang
mempengaruhi kualitasnya dan produk susu hilir, yang merupakan perhatian utama tidak
hanya bagi konsumen tetapi juga untuk industri susu (Oancea 2009 ). Salah satu masalah besar
industri pengolahan dan / atau distributor susu adalah pemalsuan susu cair atau dehidrasi
dengan menambahkan whey keju. Whey keju adalah produk sampingan murah yang diperoleh
selama produksi keju dari susu sapi. Terlepas dari kenyataan bahwa biasanya, penambahan
whey pada susu tidak menimbulkan bahaya kesehatan, namun memiliki implikasi gizi, ekonomi,
dan hukum (Alc ázar et al. 2000 ) dan merupakan penyebab kesulitan keuangan bagi industri dan
/ atau distributor susu besar dan kecil karena rendahnya hasil produk olahan susu hilir seperti
keju.
Penambahan whey keju yang curang ke dalam susu dapat dideteksi dengan menentukan
keberadaan glycomacropeptide (GMP), juga dikenal sebagai caseinomacropeptide (Eigel et al.
1984 ), senyawa spesifik whey keju yang seharusnya tidak ada dalam susu non-adulterated (Ben ítez 
et al. 2001 ). GMP adalah peptida whey yang diturunkan dari kasein bioaktif, diproduksi ketika
susu diolah dengan kimosin selama pembuatan keju, dan κ- kasein dihidrolisis menjadi dua
peptida. Peptida yang lebih besar, para- κ- kasein (residu 1 - 105), dimasukkan ke dalam dadih
sedangkan yang lebih kecil, GMP (residu 106 - 169), menjadi larut dan menjadi bagian dari whey;
itu berisi semua gula dari κ- kasein (Brody 2000 ). Aktivitas biologis yang berbeda telah dikaitkan
dengan GMP. Ini memiliki efek antimikroba, imunomodulator, dan prebiotik (Thom ä‑Worringer 
et al. 2006 ), termasuk mendorong pertumbuhan bifidobacteria (Bruck et al. 2003 ). Sifat
fungsional GMP ini menjadikannya bahan yang menarik untuk digunakan dalam
pengembangan makanan baru dengan kemungkinan manfaat yang mempromosikan
kesehatan (Phelan et al. 2009 ).
Beberapa metode telah dikembangkan untuk mendeteksi dan menghitung GMP
dalam produk susu, termasuk kolorimetri (Fukuda et al. 2004 ), kromatografi
pertukaran kation (L éonil dan Mollé 1991 ), resolusi kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) fase terbalik (Elgar et al. 2000 ; Ferreira dan Oliveira 2003 ) digabungkan
dengan spektrometri massa (Moll é dan Léonil 2005 ), gel poliakrilamida
Sandwich ELISA untuk mendeteksi GMP dalam susu mentah 123

elektroforesis natrium dodesil sulfat (SDS-PAGE), dan elektroforesis selulosa asetat

(Galindo-Amaya et al. 2006 ; Nakano dkk. 2007 ) metode berdasarkan elektroforesis zona
kapiler (Cherkaoui et al. 1997 ; Recio dkk. 1996 , 2000 ; Van Riel dan Olieman 1995 ),
spektroskopi (Meisel 1995 ), dan spektrometri massa (De Noni dan Resmini 2005 ).
Pengujian ini membutuhkan banyak pekerjaan dan waktu, selain peralatan dan bahan
yang mahal, dan oleh karena itu tidak terlalu cocok untuk analisis rutin.
Baru-baru ini, strategi baru berdasarkan uji imunokimia juga telah dikembangkan untuk
menganalisis GMP, seperti biosensor immunoassay (Haasnoot et al. 2004 , 2006 ), imunoblot (Ch ávez 
et al. 2008 ), tes imunokromatografi (Oancea 2009 ), dan penghambatan enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) (Bitri et al. 1993 ; Bremer dkk. 2008 ; Picard dkk. 1994 ). Tes
imunoblot dan imunokromatografi memiliki sensitivitas yang rendah. Biosensor immunoassay
sangat sensitif, tetapi membutuhkan peralatan mahal atau peralatan yang belum tersedia
secara komersial. ELISA adalah immunoassay yang paling sering digunakan dalam
penghitungan uji rutin karena merupakan sistem pengujian yang sederhana, sensitif, dan andal
yang memungkinkan penggunaan volume sampel kecil dan analisis cepat untuk jumlah sampel
yang banyak. Metode berbasis ELISA telah dikembangkan untuk mendeteksi GMP sebagai
penanda proteolisis dalam susu mentah (Picard et al.
1994 ) atau susu sapi pada domba dan produk kambing (Bitri et al. 1993 ). Saat ini, ELISA
inhibisi dikembangkan untuk mendeteksi bovine rennet whey solid dalam susu skim
bubuk dan bubuk buttermilk (Bremer et al. 2008 ). Namun matriks produk susu ini tidak
sekompleks susu mentah.
Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan dan memvalidasi sistem
ELISA sandwich menggunakan antibodi poliklonal terhadap GMP sapi murni yang akan menghasilkan
analisis susu mentah yang lebih sensitif untuk deteksi rutin GMP sebagai indikator pemalsuan dengan
whey keju.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1 Sampel, bahan kimia, dan instrumen

Susu mentah diperoleh dari sapi yang dibesarkan di sebuah peternakan di Pusat Ilmu
Pertanian Universitas Otonomi Aguascalientes (Aguascalientes, Meksiko). Whey keju
diperoleh dari susu mentah yang diolah dengan 0,0001% chymosin (Cuamix BAPAK,
CHR Hansen, Meksiko DF, Meksiko). Produk komersial seperti yogurt, suplemen
makanan, probiotik mirip susu, minuman kedelai, dan margarin dibeli di pasar
makanan Aguascalientes (Aguascalientes, Meksiko). GMP disumbangkan oleh Arla
Foods Amba (LACPRODAN ® CGMP‑10, Viby, Denmark). Albumin serum sapi (BSA) 
diperoleh dari Equitech‑Bio, INC (Kerrville, Texas, USA). IgG anti‑GMP biotinilasi 
disiapkan di laboratorium kami menggunakan ImmunoProbe TM Kit Biotinilasi dipasok
oleh Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Antibodi sekunder terkonjugasi
alkalin-fosfatase diperoleh dari Zymed (South San Francisco, CA, USA). Peroksidase
lobak (HRP) -ExtrAvidina ® terkonjugasi, orto‑fenilen diamina (OPD), dan 
5‑bromo‑4‑kloro‑3‑indolil fosfat / nitro biru tetrazolium dibeli dari Sigma (St. Louis, 
MO, USA). Pelat mikro 96‑sumur polistiren alas datar diperoleh dari COSTAR® 
(Cambridge, MA, USA). Absorbansi dibaca di pembaca pelat ELISA Model 550 dari 
Bio‑Rad (Hercules, CA, USA). Bio‑Rad Miniprotean III
124 NA Chavez dkk.

Sistem (Hercules, CA, USA) digunakan untuk pemisahan elektroforesis dari sampel
protein.

2.2 Pelabelan antibodi anti-GMP

Sebuah antiserum poliklonal terhadap GMP dibesarkan pada kelinci putih Selandia Baru dan dimurnikan
seperti yang dijelaskan di tempat lain (Chavez et al. 2008 ). Secara singkat, antiserum dirawat dengan larutan
amonium sulfat jenuh dan asam kaprilat untuk membuang sebagian besar protein serum kecuali molekul IgG.
Selanjutnya, antibodi anti-GMP dimurnikan afinitas dengan menggunakan kolom gabungan GMP, HP yang
diaktifkan HiTrap NHS (GE Healthcare Bio-Science Corporation, Piscataway, NJ, USA). Untuk konjugasi kovalen
antibodi dengan biotin, antibodi yang dimurnikan afinitas dilarutkan.

dalam fosfat buffered saline (PBS) (7,5 mmol.L - 1 NaCl, 0,5 mmol.L - 1 Na 2 HPO 4,
0,5 mmol.L - 1 NaH 2 PO 4; pH 7,4), pada konsentrasi 400 mg.L - 1 dan dicampur dengan 1
mL asam biotinamidoheksanoat 3-sulfo- N- natrium ester hidroksisuksinimida
garam, mengandung 30 μ L dari dimetil sulfoksida. Campuran diinkubasi sambil diaduk
perlahan selama 30 menit pada suhu kamar. Antibodi terkonjugasi diisolasi
menggunakan kolom filtrasi gel yang disediakan oleh kit biotinylasi. Konsentrasi protein
total diukur, dan antibodi anti-GMP yang dibiotinilasi (0,5 mg.L - 1) disimpan di - 20 ° C 
sampai digunakan.

2.3 Pengolahan sampel

Sampel cairan (susu mentah, susu mentah dengan jumlah yang berbeda dari whey, yogurt,
suplemen makanan, probiotik seperti susu, dan minuman kedelai) dicampur dengan larutan
asam trikloroasetat (TCA) hingga konsentrasi akhir 0,49 mol.L - 1, untuk mengendapkan κ-
kasein (Ben ítez et al. 2001 ) yang bereaksi silang dengan GMP. Untuk memulihkan dan
memusatkan GMP, perlakuan TCA kedua sampai konsentrasi akhir 0,86 mol.L - 1 dikembangkan
menjadi supernatan (Galindo-Amaya et al. 2006 ; Olieman dan van den Bedem 1983 ). Endapan
dilarutkan dalam 300 μ L PBS mengandung 0,05% Tween 20 (PBST) dan 1% BSA (PBST-BSA).
Sebelum dimasukkan ke dalam ELISA, larutan dinetralkan dengan 10 sampai 20 μ L dari 2 mol.L - 1 NaOH
dan disesuaikan dengan volume akhir 500 μ L dengan air suling. Untuk sampel yang dianalisis
dengan Western blot, endapan dilarutkan dalam 200 μ L sebesar 0,075 mol.L - 1 Tris - HCl pH 8 dan,
setelah itu, dinetralkan dan diatur hingga 500 μ Volume terakhir L seperti yang baru saja
ditunjukkan. Margarin (2 g) sebelumnya dilarutkan dalam kloroform - metanol (2: 1) untuk
menghilangkan lipid. Kemudian, GMP dilarutkan dengan menambahkan air, diperoleh kembali
dengan perlakuan TCA hingga konsentrasi akhir 0,86 mol.L - 1, dan endapan dilarutkan dan
dinetralkan seperti yang ditunjukkan di atas, untuk dianalisis dengan ELISA. Susu mentah baru
saja diperah dan dinilai bebas GMP oleh Western blot menggunakan antibodi GMP poliklonal.
Suplemen makanan, yogurt, dan margarin mengandung whey sebagai komponen seperti yang
ditentukan dalam produk.

2.4 Blotting Barat

Sampel protein dipisahkan oleh gel poliakrilamida natrium dodesil sulfat 13,5%
(Laemmli 1970 ). Setelah elektroforesis, protein dipindahkan ke polivinilidena
Sandwich ELISA untuk mendeteksi GMP dalam susu mentah 125

membran difluorida (Millipore; Billerica, MA, USA) dengan electroblotting (Towbin et

al. 1979 ). Bercak dirawat dengan Tris buffered saline (TBS) (0,5 mol.L - 1 NaCl,
0,02 mol.L - 1 Tris - HCl; pH 7,4) mengandung 3% BSA (TBS-BSA) selama 1 jam pada suhu kamar dan
diinkubasi pada suhu 4 ° C semalaman dengan antibodi anti‑GMP yang diencerkan 1: 1.000 dalam 
TBS‑BSA. Setelah beberapa kali pencucian dengan TBS yang mengandung 0,2% Tween‑20, membran 
diinkubasi selama 2 jam dengan antibodi sekunder terkonjugasi alkali‑fosfatase yang diencerkan 1: 
20.000 dalam TBS‑BSA. Setelah pencucian, protein dideteksi menggunakan 5‑bromo‑4‑chloro‑3indolyl 
phosphate / nitro blue tetrazolium.

2.5 Prosedur ELISA Sandwich

Pelat mikro 96-sumur polistiren alas datar dilapisi semalaman pada suhu 4 ° C dengan
50 μ L per sumur penyangga karbonat (0,1 mol.L - 1 Na 2 BERSAMA 3, 35 mmol.L - 1 NaHCO 3;
pH 9,6) mengandung 1 mg / L antibodi anti-GMP kelinci yang dimurnikan. Semua langkah pencucian
dilakukan tiga kali dengan PBST, dan pelat ditutup dengan film penutup pelat selama inkubasi
untuk meminimalkan penguapan. Sumur diblokir dengan 150 μ L per sumur PBST-BSA dan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah dicuci, 50 μ L per sumur dari setiap sampel
ditambahkan dalam rangkap tiga. Standar dan ekstrak sampel yang diencerkan 1: 100 dalam
PBST-BSA diinkubasi selama 1 jam pada 37 ° C di bawah pengocokan lembut pada setiap pelat. 
Setelah pencucian, GMP yang terikat terdeteksi dengan menambahkan 50 μ L per sumur antibodi
anti-GMP kelinci yang dibiotinilasi (1,3 mg / L) dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 ° C dengan 
pengocokan lembut. Piring dicuci lagi dan kemudian diinkubasi dengan 50 piring μ L per sumur
HRP-ExtrAvidina ® terkonjugasi, diencerkan 1: 2.000 dalam PBST‑BSA selama 1 jam pada suhu 37 ° 
C. Setelah pencucian terakhir, setiap sumur diinkubasi dengan 50 μ L larutan substrat, campuran
(1: 4) buffer sitrat (0,05 mol.L - 1

asam sitrat, 0,1 mol.L - 1 Na 2 HPO 4; pH 5,2), dan larutan OPD (7 mmol.L - 1 H 2 HAI 2,
333 mg / L OPD). Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan 50 μ L per sumur
dari 2 mol.L - 1 H 2 BEGITU 4. Absorbansi dibaca pada 490 nm di pembaca plat ELISA.
Waktu inkubasi (antigen, antibodi terkonjugasi, larutan substrat) dan rasio
immunoreagents (antibodi penangkap, antibodi terkonjugasi, enzim ExtraAvidina ®), yang 
memberikan reaksi densitas optik proksimal hingga 1,0 ditentukan dan kemudian 
digunakan dalam ELISA sandwich.

2.6 Pembuatan kurva standar

Kurva standar dibuat dengan menganalisis susu mentah cair yang mengandung
konsentrasi whey keju yang diketahui - 0,0%, 0,02%, 0,08%, 0,25%, 0,5%, 1,0%, 2,5%,
5,0%, 10,0%, dan 20,0% v / v. Sandwich ELISA dilakukan seperti dijelaskan di atas.
Setiap konsentrasi diuji dalam rangkap tiga selama tiga hari berturut-turut.
Absorbansi yang diperoleh diplot versus persentase logaritmik whey.

2.7 Validasi pengujian: spesifisitas, akurasi, batas deteksi, batas kuantifikasi, dan
presisi

Spesifisitas dan akurasi metode diperkirakan menggunakan sampel yang diperoleh dari susu
mentah, dua probiotik mirip susu, dan minuman kedelai. Semuanya adalah minuman makanan
yang bebas dari GMP dan whey. Kekhususan metode ditetapkan oleh reaktivitas silang
126 NA Chavez dkk.

mempelajari, memproses, dan menganalisis rangkap tiga dari empat sampel dari setiap
makanan minuman. Akurasi dievaluasi menggunakan eksperimen pemulihan. Rangkap tiga dari
empat sampel dari setiap produk minuman dibubuhi dengan 5%, 10%, dan 20% ( v / v) whey keju
diolah dan dianalisis dengan ELISA sandwich. Persentase pemulihan dan koefisien variasi (CV)
ditentukan.
Batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) dihitung melalui 25 pengukuran
susu mentah kosong (tanpa GMP dan tanpa whey). Kami menerapkan rumus berikut -
LOD 0 3.3 SD / S, LQ 0 10 SD / S, di mana SD adalah deviasi standar dari respons dan S adalah
kemiringan kurva kalibrasi (ICH 2005 ).
Untuk mengevaluasi ketepatan di dalam dan di antara pengujian, tiga produk susu
berbeda yang mengandung whey (yogurt, margarin, dan suplemen makanan) diproses,
dan sampel yang diekstraksi disimpan di - 20 ° C, dan setiap analisis dikembangkan dengan 
ekstrak yang baru dicairkan. Presisi intra‑assay ditentukan sebagai mean CV berdasarkan 
sepuluh ulangan dan presisi interassay sebagai CV mean berdasarkan analisis 
quadruplicate pada sembilan hari yang berbeda. CV <10% diambil sebagai kriteria 
penerimaan presisi atau reproduktifitas (Crowther 2000 ).

3. Hasil dan Pembahasan

3.1 Penghapusan κ- kasein dan pemulihan GMP dari sampel

Semua sampel diproses dengan dua prosedur presipitasi TCA berturut-turut untuk
menghindari gangguan κ- kasein dan pulihkan GMP. Keefektifan prosedur ini ditunjukkan
oleh analisis bercak Barat dari sampel susu yang diproses dan yang tidak diproses, yang
ditunjukkan dengan antibodi anti-GMP poliklonal (Gbr. 1 ). Antibodi mendeteksi pita 19,2
kDa dalam susu mentah yang belum diproses, yang sesuai dengan berat molekul κ- kasein
(Rachagani dan Gupta 2008 ). Tidak ada pita yang muncul saat susu mentah diproses
dengan presipitasi TCA, yang menunjukkan penghilangan total κ- kasein dari sampel dan
tidak adanya GMP. Selain itu, antibodi tidak bereaksi silang dengan komponen susu
lainnya. Bila susu mentah mengandung 1% ( v / v) whey keju diolah dan dianalisis dengan
Western blot, dua pita berukuran 17,2 dan 14 kDa

Gambar 1 Efektivitas prosedur

pengendapan sampel dengan TCA. Jalur
1, 5 μ L susu mentah yang belum
diolah; jalur 2, 20 μ L susu mentah
olahan TCA; jalur 3, 20 μ L susu
mentah olahan TCA mengandung
1% ( v / v) dari whey keju; jalur 4, 20 μ g
GMP murni. Penanda berat molekul
dan ukuran protein (kDa) adalah

ditunjukkan dalam kiri sisi

gel
Sandwich ELISA untuk mendeteksi GMP dalam susu mentah 127

terdeteksi. Kedua pita ini sesuai dengan yang diamati dalam sampel GMP murni, yang
menunjukkan keefektifan prosedur presipitasi TCA dalam pemulihan GMP.

3.2 Kurva standar ELISA sandwich

Susu mentah yang mengandung whey keju dari 0,02% hingga 20% ( v / v) digunakan sebagai
standar. Kurva standar sembilan titik yang menunjukkan rata-rata dan deviasi standar dari tiga
kurva rangkap tiga ditunjukkan pada Gambar. 2 . Jika tidak ada whey keju yang ditambahkan ke
susu mentah, diperoleh nilai absorbansi 0,3080 ± 0,0046. Teramati bahwa nilai absorbansi
meningkat secara proporsional dengan logaritma konsentrasi dalam rentang kurva standar
dengan koefisien korelasi kuadrat ( R 2)> 0,993.

3.3 Kekhususan

Kekhususan antibodi ditunjukkan dalam sistem ELISA menggunakan susu mentah dan
dua makanan minuman lain yang biasa digunakan, probiotik seperti susu dan minuman
kedelai. Empat sampel dari setiap makanan minuman dianalisis dalam rangkap tiga. Tidak
ada reaksi positif ketika susu mentah dianalisis (0,0027 ± 0,0004% whey v / v),
menunjukkan bahwa antibodi anti-GMP poliklonal tidak bereaksi silang dengan komponen susu
mentah lainnya. Oleh karena itu, tidak ada kemungkinan positif palsu sebagai akibat dari
reaktivitas silang. Fakta ini meningkatkan kebenaran pengujian untuk mendeteksi pemalsuan
susu mentah dengan whey keju. Ketika matriks terkait susu sebagai probiotik atau matriks kaya
protein bukan terkait susu seperti minuman kedelai dievaluasi, tidak ada reaksi silang yang
diperoleh (0,0017 ± 0,0002 dan 0,0073 ± 0,0006% whey v / v, masing-masing), mendukung
spesifisitas antibodi anti-GMP poliklonal.

Gambar 2 Sandwich kurva kalibrasi sembilan titik linier ELISA. Itu dibangun dengan menganalisis standar susu mentah
yang mengandung konsentrasi whey keju cair yang diketahui. Setiap titik mewakili rata-rata dari tiga kurva rangkap tiga,
dan bilah kesalahan mewakili deviasi standar
128 NA Chavez dkk.

3.4 Akurasi

Keakuratan metode dipelajari dengan eksperimen pemulihan. Empat jenis makanan

minuman difortifikasi dengan whey pada tiga taraf yang berbeda (5%, 10%, dan 20%), dan
konsentrasi whey ditentukan menggunakan sandwich ELISA. Setiap sampel diuji
setidaknya empat kali dalam rangkap tiga untuk memverifikasi pengulangan pengujian.
Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1 . Pemulihan whey dalam sampel berada di antara
95.62 ± 4.04% dan 113.88 ± 3.44%, mengkonfirmasikan keakuratan ELISA. Perbedaan
sampel matriks tidak mempengaruhi rasio pemulihan.
Untuk mendemonstrasikan bahwa pelat ELISA yang sudah dilapisi dapat disimpan untuk waktu
yang lama dalam bentuk kit yang siap pakai, kami menganalisis pada hari yang sama sampel susu
mentah dengan peningkatan 20% ( v / v) whey keju, mengembangkan pengujian dalam pelat ELISA
anti-GMP berlapis yang disimpan di - 20 ° C selama 30, 45, dan 60 hari. Data persentase pemulihan dan 
CV ditunjukkan pada Tabel 2 . Rasio perolehan memuaskan ketika sampel dianalisis dengan pelat yang
dilapisi sebelumnya yang disimpan selama 30, 45, atau 60 hari, dengan hasil yang sangat mirip dengan
yang diperoleh dengan pelat berlapis baru. Kami menentukan bahwa, setelah penyimpanan pelat
ELISA berlapis selama 3 bulan, pengujian tersebut menjaga keakuratan dan reproduktifitasnya. Ini
menunjukkan bahwa ELISA sandwich dapat digunakan dalam peralatan siap pakai untuk analisis susu
rutin.

3.5 Batasan deteksi dan batas kuantifikasi

Untuk mendapatkan LOD dan LOQ sandwich ELISA ini, susu mentah dianalisis sebagai blanko.
LOD sandwich ELISA adalah 0,047% ( v / v) whey cair dalam susu mentah yang berarti 0,047%
merupakan jumlah whey keju cair terendah yang dapat dideteksi dalam suatu sampel. LOQ dari
pengujian tersebut adalah 0,14% ( v / v), Hal ini menunjukkan bahwa dari konsentrasi ini ELISA
sandwich dapat membedakan dengan pasti apakah suatu sampel mengandung whey keju atau
tidak dan dapat mengukurnya. Menggunakan uji imunokimia sebagai imunoblot (Ch ávez et al. 2008
), tes imunokromatografi (Oancea 2009 ), dan biosensor immunoassay (Haasnoot et al. 2004 , 2006
), penulis melaporkan LOD sebesar 0,5%,

Tabel 1 Akurasi uji ELISA

Minum makanan Spiked Terdeteksi Sebuah (%) Pemulihan (%) CV (%)
sandwich
tingkat Sebuah (%)

Susu mentah 5 4.80 ± 0.30 96,12 ± 6,01 6.25

10 10,33 ± 0,64 103,30 ± 6,46 6.19
20 22.66 ± 0.88 113,30 ± 4,41 3.88
Probiotik 1 5 4.78 ± 0.20 95.62 ± 4.04 4.18
10 10,60 ± 0,56 106,05 ± 5,66 5.28
20 22,77 ± 0,68 113,88 ± 3,44 2.98
Probiotik 2 5 4.95 ± 0.25 99,12 ± 5,09 5.05
10 10.79 ± 0.63 107,98 ± 6,30 5.83
20 22.08 ± 0.81 110.41 ± 4.08 3.66
Persentase whey yang ditemukan dalam
makanan minuman GMP dan minuman
Minuman kedelai 5 4,87 ± 0,30 97.42 ± 6.08 6.16
bebas whey meningkat dengan 5%, 10%, 10 10,72 ± 0,97 107,20 ± 9,75 9.04
dan 20% whey cair Sebuah Nilai mean ± SD, n 0 20 22,67 ± 0,73 113.38 ± 3.68 3.22
4 dalam rangkap tiga
Sandwich ELISA untuk mendeteksi GMP dalam susu mentah 129

Meja 2 Pengaruh penyimpanan pada - 20 ° C pelat ELISA pra‑lapis anti‑GMP pada akurasi

Hari Terdeteksi Sebuah (%) Pemulihan Sebuah (%) CV (%)

0 hari 22,62 ± 0,66 113.13 ± 3.31 2.91

30 hari 22,78 ± 0,74 113,90 ± 3,71 3.24
45 hari 21,55 ± 0,78 107,75 ± 3,92 3.61
60 hari 21.26 ± 0.80 106,33 ± 4,04 3.76

Persentase whey yang diperoleh kembali dalam susu mentah GMP dan bebas whey yang ditambahkan 20% whey cair
Sebuah Nilai mean ± SD, n 0 8

1 - 2%, dan 0,17% whey cair dalam susu mentah, masing-masing. Dengan sistem ELISA
penghambatan, sensitivitas yang lebih besar dilaporkan menggunakan antibodi monoklonal
anti- κ- kasein, dengan batas deteksi 0,1% ( w / w) bubuk whey dalam susu bubuk skim (Bremer et
al. 2008 ). Penting untuk diperhatikan bahwa dalam susu cair, yang kami gunakan, padatan
(termasuk keju whey) memiliki konsentrasi yang lebih rendah (rata-rata 12%) karena merupakan
sampel berbahan dasar air. Sistem ELISA kami memiliki LOD setara 0,03% w / w whey dalam
susu bubuk skim.
Uni Eropa (UE) telah mengatur penggunaan metode HPLC untuk penentuan GMP guna
mendeteksi penambahan whey padat yang curang ke dalam susu skim power yang akan
ditimbun (EC 273 / 2008 ). Aktivitas proteolitik proteinase psikrotrofik pada susu, meskipun
kurang spesifik dibandingkan kimosin, juga dapat κ- kasein di posisi 105 - 106, yang mengarah
pada pembentukan GMP (Recio et al. 2000 ). Untuk meminimalkan risiko hasil tes positif palsu,
EU telah menetapkan level keputusan pada konsentrasi yang relatif tinggi, yaitu 1% ( w / w) dari
whey padat. Tidak ada peraturan terkait penipuan penambahan whey keju cair ke dalam susu
mentah. Mengingat susu cair memiliki konsentrasi padatan yang lebih rendah, kami juga dapat
menetapkan tingkat keputusan pengujian kami pada interval kepercayaan 95% dari standar
susu mentah yang mengandung 1% ( v / v) air dadih cair. Konsentrasi rata-rata dan SD dari
sembilan analisis dari 1% ( v / v) standar susu mentah masing-masing adalah 0,994% dan
0,057%. Tingkat keputusan dihitung sebagai rata-rata dikurangi 2SD ditetapkan pada 0,88% ( v /
v). Jadi, semua sampel mengandung
0,88% ( v / v) atau lebih banyak whey keju menurut pengujian kami berpotensi positif.

3.6 Presisi

Untuk mengevaluasi varian intra-assay dan interassay, tiga produk yang mengandung whey
(sebagai bahan berlabel): yogurt, margarin, dan suplemen makanan dianalisis dengan sandwich
ELISA. Sampel dianalisis dalam rangkap empat, dan rata-rata pengukuran dari tiga hari yang
berbeda ditunjukkan pada Tabel 3 . Mereka ditemukan mengandung whey keju dalam jumlah
mulai dari 10% hingga 13% ( v / v). ELISA menunjukkan pengulangan yang tinggi untuk semua
sampel, dengan CV <6% dalam varian intra-assay dan <7% dalam varian interassay.

Sandwich ELISA berhasil mendeteksi GMP pada makanan komersial yang

mengandung whey, seperti yogurt, margarin, dan suplemen makanan. Seperti yang
telah ditunjukkan nutrisi dan sifat biologis untuk GMP (Brody 2000 ), peptida bioaktif
ini digabungkan dalam bentuk bahan menjadi makanan fungsional, makanan baru,
130 NA Chavez dkk.

Tabel 3 Varians intra dan interassay (% CV) ditentukan untuk ELISA sandwich dengan produk susu yang mengandung
whey

Produk susu Konsentrasi whey Sebuah (%, v / v) Uji intra Interassay

varians (% CV) varians (% CV)

yogurt 10,6 ± 0,13 5.34 2.01

Margarin 10,4 ± 0,26 4.15 3.31
Suplemen makanan 13.1 ± 0.39 4.49 6.94

Sebuah Nilai mean ± SD, n 0 3 dalam rangkap empat

nutraceuticals, dan suplemen makanan dengan tujuan memberikan manfaat kesehatan tertentu (Phelan et al. 2009
). Sistem ELISA ini dapat menjadi alternatif yang sangat baik untuk mendeteksi atau mengukur peptida ini
dalam makanan fungsional yang diperkaya GMP, serta dalam sediaan komersial GMP yang dimurnikan.
Pengembangan sistem ELISA dilakukan dengan menggunakan antibodi anti-GMP poliklonal untuk
penangkapan dan deteksi. Penggunaan antibodi poliklonal daripada monoklonal dibenarkan dan dapat
diterima untuk analisis makanan. Dalam kasus makanan, teknik pemrosesan berbeda yang diterapkan dapat
mengubah sifat atau mempengaruhi protein atau peptida, dan dengan demikian menyebabkan kerusakan
epitop tertentu. Menggunakan antibodi poliklonal, kemungkinan deteksi peptida atau protein yang diubah
atau dimodifikasi seperti dalam kasus makanan ketika dilakukan teknik pemrosesan yang berbeda
(pasteurisasi, pemanasan, pengasaman, dll. 2005 ). Oleh karena itu, sistem ELISA ini dapat digunakan untuk
mendeteksi atau mengukur peptida ini dalam pemeriksaan kualitas makanan.

3.7 Perbandingan sandwich ELISA dengan metode lain untuk mendeteksi whey dalam susu mentah

Dibandingkan dengan metode kolorimetri (Fukuda et al. 2004 ), SDS-PAGE (GalindoAmaya et al. 2006
), imunoblot (Ch ávez et al. 2008 ), dan tes imunokromatografi (Oancea 2009 ), uji ELISA sandwich
memiliki spesifisitas yang sesuai dan LOD yang lebih baik untuk menganalisis susu mentah
untuk mengetahui adanya tambahan whey keju. Elektroforesis kapiler memungkinkan
diskriminasi antara pemalsuan whey dan aktivitas proteinase psikrotrofik, yang akan
memberikan spesifisitas tertinggi (Recio et al. 2000 ). Namun, metode ELISA saat ini memiliki
persiapan sampel yang mudah dan waktu pengujian yang singkat. Menggunakan uji ELISA
sandwich, 24 sampel dan delapan standar untuk kurva kalibrasi dianalisis dalam rangkap tiga
dalam waktu 4 jam. Dua sistem ELISA penghambatan telah dikembangkan untuk mendeteksi
GMP dalam susu mentah tetapi melaporkan LOD yang lebih tinggi daripada yang kami peroleh;
satu ELISA kompetitif dirancang untuk mempelajari aktivitas proteolitik dari bakteri psikrotrofik
dalam susu mentah curah dan memiliki LOD 0,1 μ g / mL GMP dalam susu mentah (Picard et al. 1994
) dan yang lainnya untuk mendeteksi campuran ovine atau susu kaprin dalam susu sapi
mentah, melaporkan adanya 0,25% susu mentah sapi (Bitri et al. 1993 ).

4. Kesimpulan

Makalah ini menyajikan pengembangan dan validasi sistem ELISA sandwich, menggunakan antibodi anti-GMP
poliklonal, untuk mendeteksi GMP sebagai indikasi pemalsuan.
Sandwich ELISA untuk mendeteksi GMP dalam susu mentah 131

susu mentah dengan whey keju cair. Metode ini memiliki LOD dan LOQ terendah yang dijelaskan
dalam uji GMP ELISA dan tidak menunjukkan reaksi silang dengan susu mentah atau komponen
makanan minuman lainnya. Sistem ini dapat direproduksi dan memiliki akurasi yang sangat baik. Hasil
ini memungkinkan pengujian untuk digunakan dalam uji kuantitatif atau kualitatif produk susu untuk
mengukur atau mendeteksi GMP sebagai whey. Selain itu, dapat disimpan dalam waktu yang lama
dalam bentuk kit siap pakai, yang merupakan alat tes yang ideal untuk dikembangkan dalam uji rutin
susu yang diterima oleh industri pengolahan susu kecil atau besar, distributor, atau bahkan secara
resmi. program inspeksi.

Ucapan Terima Kasih Proyek penelitian ini didukung oleh hibah PIBT-06-1 dari Autonomous University of
Aguascalientes. Norma A. Chavez memiliki beasiswa doktoral dari CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnolog ía). Penulis mengucapkan terima kasih kepada Andrés Quintanar Stephano dan Jose Luis Quintanar 
Stephano atas dukungan yang diberikan untuk pengembangan proyek ini.

Akses terbuka Artikel ini didistribusikan di bawah persyaratan Lisensi Nonkomersial Atribusi Creative Commons yang
mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi nonkomersial apa pun dalam media apa pun, dengan
mencantumkan nama penulis dan sumber aslinya.

Referensi

Alc ázar CD, Rosas J, Jaramillo CJ, Peña SD (2000) Deteksi GMP glycomacropeptide sebagai indeks
pemalsuan susu dehidrasi dengan rennet whey. Vet Mex 37: 217 - 222
Ben ítez E, Ponce P, Noa M (2001) Deteksi rennet whey dalam susu bubuk dengan penyaringan gel tinggi
kinerja kromatografi cair GFC-HPLC. Rev de Salud Anim 23:27 - 31
Bitri L, Rolland MP, Besan çon P (1993) Deteksi imunologi kaseinomakropeptida sapi dalam sel telur
dan produk susu caprine. Milchwissenschaft 48: 367 - 370
Bremer M, Kemmers-Voncken A, Boers EAM, Frankhuizen R, Haasnoot W (2008) Terkait enzim
immunosorbent assay untuk mendeteksi bovine rennet whey powder dalam susu bubuk dan buttermilk
powder. Int Dairy J 18: 294 - 302
Brody E (2000) Aktivitas biologis glycomacropeptide sapi. Br J Nutr 84: S39 - S46
Bruck WM, Graverholt G, Gibson GR (2003) Sistem kultur kontinu dua tahap untuk mempelajari pengaruh
tambahan α - laktalbumin dan glycomacropeptide pada kultur campuran bakteri usus manusia yang ditantang
dengan enteropatogenik Escherichia coli serotipe Typhimorium. J Appl Microbiol 95:44 - 53
Ch ávez NA, Salinas E, Jauregui J, Palomares LA, Macías KE (2008) Deteksi susu sapi yang dipalsukan
dengan whey keju oleh Western blot immunoassay. Food Agric Immunol 19: 265 - 272
Cherkaoui S, Doumenc N, Tachon P, Neeser R, Veuthey J (1997) Perkembangan zona kapiler
metode elektroforesis untuk penentuan kaseinoglycomacropeptide. J Kromatogr A 790: 195 - 205 Crowther
JR (2000) Dalam: Walkers JM (ed) Validasi tes diagnostik untuk penyakit menular, edisi ke-1.
Humana Press, New Jersey
De Noni I, Resmini P (2005) Identifikasi padatan rennet-whey in “ mentega tradisional ” melalui HPLC /
ESI-MS dari non-glikosilasi caseinomacropeptide A. Food Chem 93:65 - 72
EC 273/2008 Peraturan Komisi 273/2008 / EC tanggal 5 Maret 2008 Menetapkan metode komunitas untuk
digunakan untuk analisis dan evaluasi kualitas susu dan produk susu. OJEU L88
29.3.2008, hlm
Eigel MN, Buttler JE, Ernstorm CA, Farrell HM, Harwalker VR, Jenness R, Whitney RM (1984)
Tata nama protein sapi ' Susu: revisi kelima. J Susu Sci 67: 1599 - 1631
Elgar DF, Norris CS, Ayers JS, Pritchard M, Otter DE, Palmano K (2000) Pemisahan dan
penghitungan protein whey sapi utama termasuk pepton proteosa dan kaseinomakropeptida dengan
kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pada polistiren - divinylbenzene. J Kromatogr A 878: 183 - 196

Ferreira IM, Oliveira MP (2003) Penentuan caseinomacropeptide dengan metode RP-HPLC dan pemantauan
merobek penambahan rennet whey ke susu bubuk. J Liq Chromatogr Relat Technol 26:99 - 107 Fukuda S,
Roig S, Prata LF (2004) Korelasi antara ninhidrin asam dan metode HPLC untuk mengevaluasi
palsu tambahan whey dalam susu. Lait 84: 501 - 512
132 NA Chavez dkk.

Galindo-Amaya LL, Valbuena-Colmenares E, Rojas-Villarroel E (2006) Standardisasi glycomacropeptide

deteksi dengan SDS-PAGE sebagai indeks pemalsuan susu. Rev Cient (Maracaibo) 16:30 - 314
Haasnoot W, Smits N, Kemmers-Voncken A, Bremer M (2004) biosensor immunoassay cepat untuk
deteksi sapi ' susu dalam susu domba dan kambing. J Dairy Res 71: 322 - 329
Haasnoot W, Marchesini GR, Koopal K Ñ (2006) biosensor immunoassay berbasis Spreeta untuk mendeteksi penipuan
pemalsuan dalam susu dan susu bubuk. J AOAC Int 89: 849 - 855
Holden L, F æste CK, Egaas E (2005) Quantitative sandwich ELISA untuk penentuan Lupin ( Lupinus
spp.) dalam makanan. J Agric Food Chem 53: 5866 - 5871
Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) tentang Persyaratan Teknis untuk Pendaftaran Farmasi-
ceuticals for Human Use (2005) Validasi Prosedur Analitik: Teks dan Metodologi Q2 (R1) Laemmli UK (1970)
Pembelahan protein struktural selama perakitan kepala bakteriofag T4.
Alam 227: 680 - 685
L éonil J, Mollé D (1991) Sebuah metode untuk penentuan makropeptida dengan protein cepat pertukaran kation
kromatografi cair dan penggunaannya untuk mengikuti aksi kimosin dalam susu. J Dairy Res 58: 321 -
328
Meisel H (1995) Penerapan spektroskopi turunan keempat untuk kuantifikasi protein whey dan kasein
dalam total protein susu. Milchwissenschaft 50: 247 - 251 Moll é D, Léonil J (2005) Penentuan kuantitatif sapi 
κ- kasein makropeptida dalam produk susu oleh
kromatografi cair / elektrospray digabungkan dengan spektrometri massa (LC-ESI / MS) dan kromatografi
cair / semprotan listrik digabungkan dengan spektrometri massa tandem (LC-ESI / MS / MS). Int Dairy J 15:
419 - 428 Nakano T, Ikawa N, Ozimek L (2007) Deteksi sialylated phosphorylated kappa-casein glycomacro-
peptida dielektroforesis pada gel poliakrilamida dan strip selulosa asetat oleh reaksi zat warna hijau
thiobarbituric dan malachite. J Agric Food Chem 55: 2714 - 2726
Oancea S (2009) Identifikasi glycomacropeptide sebagai indikator pemalsuan susu dan minuman susu dengan
whey dengan uji imunokromatografi. Rom Biotechnol Lett 14: 4146 - 4151
Olieman C, van den Bedem JW (1983) Metode HPLC sensitif untuk mendeteksi dan memperkirakan rennet whey
total padatan dalam tenaga susu skim. Neth Milk Dairy J 37:27 - 36 Phelan M, Aherne A, FitxGerald RJ, O ' Brien NM
(2009) peptida bioaktif yang diturunkan dari kasein: biologis
efek, penggunaan industri, aspek keselamatan dan status peraturan. Int Dairy J 19: 643 - 654
Picard C, Plard I, Rongdaux-Gaida D, Collin J (1994) Deteksi proteolisis dalam susu mentah yang disimpan pada
suhu dengan ELISA penghambatan. J Dairy Res 61: 395 - 404
Rachagani S, Gupta ID (2008) Polimorfisme gen kappa-kasein sapi dan hubungannya dengan susu
ciri-ciri produksi. Genet Mol berbagai 31: 893 - 897
Recio I, L ópez‑Fandiño R, Olano A, Olieman C, Ramos M (1996) Studi pembentukan kasein‑
omakropeptida dalam susu yang diolah dengan suhu sangat tinggi yang disimpan dengan elektroforesis kapiler. J Agric Food
Chem 44: 3845 - 3848
Recio I, Garc ía‑Risco MR, Ramos M, López‑Fandiño R (2000) Karakterisasi peptida yang dihasilkan oleh
tindakan proteinase psikrotrofik κ- kasein. J Dairy Res 67: 625 - 630
Thom ä‑Worringer C, Sørensen J, López‑Fandiño R (2006) Efek kesehatan dan fitur teknologi
caseinomacropeptide. Int Dairy J 16: 1324 - 1333
Towbin H, Staehelin J, Gordon J (1979) Transfer elektroforesis protein dari gel poliakrilamida ke
lembaran nitroselulosa. Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350 - 4354
Van Riel J, Olieman C (1995) Penentuan kaseinomakropeptida dengan elektroforesis zona kapiler
dan aplikasinya untuk deteksi dan estimasi padatan whey rennet dalam susu dan bubuk buttermilk.
Elektroforesis 16: 529 - 533