Imunologi Pangan dan Pertanian

ISSN: 0954-0105 (Cetak) 1465-3443 (Online) Halaman muka jurnal: https://www.tandfonline.com/loi/cfai20

Deteksi susu sapi yang dicampur dengan whey keju oleh

western blot immunoassay

Norma A. Chávez, Eva Salinas, Juan Jauregui, Laura A. Palomares & Karla Macías

Untuk mengutip artikel ini: Norma A. Chávez, Eva Salinas, Juan Jauregui, Laura A. Palomares & Karla Macías
(2008) Deteksi susu sapi yang dicampur dengan whey keju oleh western blot immunoassay, Food and Agricultural
Immunology, 19: 4, 265-272, DOI:
10.1080 / 09540100802381042

Untuk menautkan ke artikel ini: https://doi.org/10.1080/09540100802381042

Diterbitkan online: 08 Des 2008.

Kirimkan artikel Anda ke jurnal ini

Tampilan artikel: 820

Lihat artikel terkait

Mengutip artikel: 3 Lihat mengutip artikel

Syarat & Ketentuan lengkap akses dan penggunaan dapat ditemukan di

https://www.tandfonline.com/action/journalInformation?journalCode=cfai20
Imunologi Pangan dan Pertanian
Vol. 19, No. 4, Desember 2008, 265272

Deteksi susu sapi yang dicampur dengan whey keju oleh Western blot immunoassay

Norma A. Chavez Sebuah*, Eva Salinas b, Juan Jauregui Sebuah, Laura A. Palomares c dan Karla Mac´ı́as Sebuah

Sebuah Departmento de Ingenier´ı́a Bioqu´ı́mica, Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes, México; b Departamento
de Microbiolog´ı́a, Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes, México; c Departmento de Medicina
Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnolog´ı́a, Universidad Nacional Autónoma de México, México

(Diterima 11 Maret 2008; versi terakhir diterima 31 Juli 2008)

Industri dan distributor pengolah susu mengalami masalah pemalsuan susu dengan whey keju. Metode yang paling
sering digunakan untuk mendeteksi whey keju adalah identifikasi glycomacropeptide (GMP) yang hanya ada dalam
whey keju tetapi tidak dalam susu. Saat ini, metode untuk mendeteksi GMP membutuhkan kerja dan waktu yang besar,
menghadirkan masalah kepekaan dan akurasi pada konsentrasi rendah. Kami mengembangkan analisis Western blot
baru untuk deteksi GMP, menggunakan antibodi poliklonal anti-GMP. Pengujian ini mudah, cepat, sensitif dan spesifik
dan dapat mendeteksi 0,001% (w / v) GMP, 0,5% (v / v) whey keju cair dan 0,001% b / v whey keju dehidrasi. Selain
itu, dapat digunakan dengan sukses untuk mendeteksi GMP dalam berbagai matriks makanan yang mengandung
whey keju.

Kata kunci: glycomacropeptide; Western blot; antibodi poliklonal; whey keju; pemalsuan susu

pengantar

Susu memiliki nilai gizi dan biologis yang tinggi. Industri dan distributor pengolah susu mengalami masalah dengan
pemalsuan susu cair atau dehidrasi dengan menambahkan whey keju. Pemalsuan ini menarik secara ekonomi karena
biaya whey keju empat hingga lima kali lebih rendah daripada susu dan tidak mempengaruhi persepsi sensorik produk
oleh konsumen. Namun, ini memiliki implikasi nutrisi, ekonomi dan hukum (Alcázar, Rosas, Jaramillo, & Peña, 2000) dan
merupakan alasan rendahnya produksi susu dalam pengolahannya.

Ada beberapa metode berbeda untuk mendeteksi keberadaan dan dalam beberapa kasus jumlah whey keju
sebagai adulterant dalam susu. Mereka termasuk penentuan rasio kasein yang ada dalam whey dengan penghitungan
nitrogen non-kaseik; penghitungan gugus sulfidril per gram protein; pengukuran kenaikan kadar amonium dalam susu
menggunakan potensiometer; dan penghitungan cystein-cistin kompleks melalui polarografi (Alcázar et al., 2000).
Metode ini memiliki sensitivitas rendah dan margin kesalahan yang signifikan. Selain itu, mereka mahal dan
membutuhkan pekerjaan besar (Greenberg & Dower, 1986; Meisel & Carstens, 1989).

Metode lain mendeteksi peptida spesifik yang disebut glycomacropeptide (GMP) (Alcázar et al., 2000). Ketika susu
diolah dengan kimosin selama pembuatan keju, protein susu

* Penulis yang sesuai. Email: nachavez@correo.uaa.mx

ISSN 0954-0105 cetak / ISSN 1465-3443 online

# 2008 Taylor & Francis
DOI: 10.1080 / 09540100802381042
http://www.informaworld.com
266 NA Chavez dkk.

(k-kasein) dihidrolisis menjadi dua peptida. Peptida yang lebih besar, disebut para-k-casein, (residu 1 105) tetap
bersama dadih, tetapi yang lebih kecil, GMP (residu 106169) terletak di whey (Brody, 2000). GMP adalah peptida larut
glikosilasi dengan berat molekul 6,8 kDa tanpa bagian glikosida (Furlanetti & Prata, 2003). Dalam larutan, agregat GMP
untuk membentuk polimer melalui interaksi monomer GMP yang berbeda. Ukuran agregat dipengaruhi oleh pH larutan
(Brody, 2000; Mikkelsen, Rasmussen, Olsen, Barkholt, & Fr T kiær, 2006).

Deteksi GMP dapat diandalkan karena peptida ini adalah komponen spesifik whey keju dan harus tidak ada dalam
susu yang tidak dipalsukan (Benitez, Ponce, & Noa, 2001; Mikkelsen et al.,
2006). Saat ini, penentuan GMP dilakukan dengan metode gravimetri (Galindo, Valbuena, & Rojas, 2006), resolusi
kromatografi cair kinerja tinggi (Leonil & Molle, 1991) atau elektroforesis gel akrilamida dengan natrium dodesil sulfat
poliakrilamida gel elektroforesis (SDS) (SDS) -HALAMAN) (Alcázar et al., 2000; Galindo et al., 2006). Pengujian ini
membutuhkan kerja keras dan waktu serta memiliki masalah sensitivitas dan akurasi pada konsentrasi rendah.

Oleh karena itu, perlu dikembangkan metode yang mudah, cepat, sensitif dan spesifik untuk mendeteksi GMP
sebagai indeks pemalsuan susu dengan whey keju. Teknik imunologi memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi,
terutama berdasarkan pada spesifisitas yang tinggi dari antibodi terhadap antigen. Antigen dapat dideteksi dan diukur
dalam sampel tanpa pemurnian, konsentrasi, ekstraksi atau perlakuan khusus sebelumnya.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan sistem Western blot untuk mendeteksi GMP pada susu adulterated dengan
whey keju. Metode ini juga dapat mengidentifikasi GMP dalam matriks makanan yang berbeda.

Bahan dan metode

Imunisasi

Tujuh ekor kelinci Selandia Baru betina (umur 6 minggu) digunakan untuk imunisasi. Hewan disuntik secara subkutan
dengan 1 mg GMP (Arla Foods Amba, Viby, Denmark) yang diemulsi dengan volume yang sama dari bahan pembantu
Freund lengkap (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, USA). Empat suntikan penguat subkutan diikuti dengan interval
4 minggu dengan dosis yang sama pada adjuvan Freund yang tidak lengkap. Dua minggu setelah setiap injeksi, kelinci
dikeluarkan dari vena marjinal telinga dan antiserum ditandai dengan Western blot.

Pemurnian antibodi anti-GMP

Antiserum poliklonal diolah dengan larutan amonium sulfat jenuh dengan volume yang sama, dicampur perlahan pada
22 8 C dan disentrifugasi pada 3000 g selama 30 menit Endapan diresuspensi dalam larutan garam buffer fosfat (PBS)
(137 mM NaCl, 2,7 mM
KCl, 100 mM Na 2 HPO 4, dan 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) dan dihilangkan garamnya dengan ultrafiltrasi (Amicon 8050, Millipore
Corporation, Bedford, USA) versus PBS pada 4 8 C menggunakan 10 kDa
membran pemisah berat molekul (Millipore Corporation, Bedford, USA). Larutan antibodi dicampur dengan dua volume
buffer natrium asetat 60 mM. Selanjutnya, 7,5% (v / v) asam kaprilat ditambahkan perlahan (tetes demi tetes) dengan
pengadukan konstan. Solusinya disentrifugasi pada 5000 g selama 10 menit dan supernatan dihilangkan garamnya dan
dipekatkan dengan ultrafiltrasi versus PBS sampai pH 7,4, dengan membran potong berat molekul 10 kDa.
 Imunologi Pangan dan Pertanian 267

GMP (5 mg / ml) digabungkan secara kovalen ke kolom HP yang diaktifkan NHS (Sepharose) (GE Healthcare
Bio-Sciences Corporation, Piscataway, USA) sesuai dengan petunjuk pabrik, dan kemudian larutan antibodi diteruskan
melalui kolom gabungan GMP ke mengikat antibodi spesifik GMP. Antibodi terikat dielusi dalam 100 mM glisin, 0,5 M
NaCl, pH 2,7 dan dinetralkan dengan 1 M Tris HCl pH 9.0. Fraksi diuji untuk aktivitas pengikatan menggunakan analisis
Western blot dan protein total ditentukan dengan uji Bradford. Kemurnian IgG diuji dengan 10% SDS-PAGE dalam
kondisi reduksi dan pewarnaan gel perak (Crester, Tulman, & Figuera, 2001). Fraksi antibodi dikumpulkan, dihilangkan
garam dan dipekatkan dengan ultrafiltrasi versus buffer natrium fosfat 0,1 M, pH 7,2 hingga konsentrasi akhir 0,5 mg /
ml.

80 8 C sampai digunakan.

Western blot

Sistem Bio-Rad Miniprotean III (Bio-Rad, Hercules, USA) digunakan untuk pemisahan elektroforesis sampel protein
sebesar 13,5% SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Pemisahan dilakukan dalam kondisi reduksi selama 1,5 jam pada 80 V
dalam buffer berjalan (0,025 M Trizma † basa, glisin 0,25 M, 3,7 mM, pH 8,3).

Western blot dikembangkan menggunakan One-Step TM Western Kit (GenScript Corporation, Piscataway, USA),
menurut petunjuk pabrikan. Singkatnya, protein dipindahkan secara elektroforesis dari gel ke membran nitroselulosa
WestClear TM

selama 2 jam pada 100 mAmp dengan transfer buffer (0,024 M Trizma † dasar, glisin 0,186 M, metanol 5,2 M). Membran
diinkubasi selama 5 menit dalam larutan pretreat. Setelah dicuci, membran diinkubasi dengan larutan Western blot yang
mengandung antibodi anti GMP (pengenceran 1: 1000) selama 40 menit pada suhu kamar dengan pengocokan
konstan. Membran dicuci dan noda dikembangkan dengan ChromoSensor TM Satu-Solusi 3, 3 ?, 5, 5?
-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat.

Pengolahan sampel susu dan makanan

25 ml susu non-adulterated, susu dengan jumlah GMP atau whey yang berbeda, yogurt, suplemen makanan dan
margarin dianalisis. Sampel cairan dicampur dengan larutan TCA hingga konsentrasi akhir 8%, untuk mengendap k- kasein
(Benitez et al.,
2001) yang bereaksi silang dengan GMP. Perawatan asam trikloroasetat (TCA) kedua hingga konsentrasi akhir 14%
dikembangkan dengan supernatan untuk mengendapkan GMP (Benitez et al., 2001; Galindo et al., 2006). Endapan
dilarutkan dalam 20 m l dari 75 mM Tris HCl, pH 8.0 dan sampel dianalisis dengan immuno-blot. Margarin (2 g)
sebelumnya dilarutkan dalam metanol kloroform (2: 1) untuk menghilangkan lemak. Kemudian GMP dilarutkan dengan
menambahkan air (Nakano, Ikawa, & Ozimek, 2007), diperoleh kembali dengan perlakuan TCA sampai konsentrasi
akhir 14%, dilarutkan dalam 20 m l dari 75 mM Tris HCl, pH 8.0 dan dianalisis dengan immuno-blot. Suplemen makanan,
yogurt dan margarin mengandung whey sebagai komponen seperti yang ditentukan dalam produk.

Hasil

Konfirmasi spesifisitas antibodi

Gambar 1 menunjukkan bahwa antibodi anti-GMP poliklonal mendeteksi tiga pita 45, 20.1 dan 14 kDa dalam sampel
whey keju cair. Pita frekuensi 20.1 dan 14 kDa sesuai dengan itu
268 NA Chavez dkk.

Gambar 1. Spesies antibodi kelinci terhadap GMP. M: 10 m l susu olahan tanpa whey. GMP: 10 m g GMP murni. LCW: 10 whey keju cair.
Antibodi anti-GMP poliklonal kelinci digunakan 1: 1000.

diamati pada sampel GMP murni, imunogen asli. Band sesuai dengan GMP dalam status agregasi berbeda. Tidak ada
garis yang muncul dalam sampel susu yang tidak dipalsukan, yang menunjukkan tidak ada reaksi silang dengan
komponen susu lainnya.

Batasan deteksi dan durasi pengujian

Western blot dengan antibodi anti-GMP terdeteksi 0,1 m g GMP murni (Gambar 2A) dan konsentrasi hingga 0,001%
GMP murni (w / v) ditambahkan ke susu (Gambar 2B). Ketika GMP ditambahkan ke susu dan sampel kemudian
diproses untuk dihilangkan k- kasein, tidak ada modifikasi pada pita yang divisualisasikan menjadi GMP (Gambar 2B).
Pita 20,1 kDa selalu lebih kuat daripada pita 14 kDa dan ketika konsentrasi GMP berkurang, pita terakhir menghilang.

Untuk mengidentifikasi secara langsung whey keju dalam susu, sampel susu yang dicampur dengan whey keju cair
atau dehidrasi dianalisis (Gambar 3). Inkubasi membran dengan antibodi anti-GMP poliklonal menunjukkan pita 45, 20.1
dan 14 kDa, sesuai dengan identifikasi GMP dalam whey. Agregat GMP 20,1 kDa lebih melimpah dibandingkan agregat
45 dan 14 kDa. Ketika konsentrasi whey rendah, kami hanya memvisualisasikan polimer pembentuk GMP dengan berat
molekul 20,1 kDa. Susu non-adulterated dan GMP murni masing-masing digunakan sebagai kontrol negatif dan positif.
Batas terendah whey keju yang terdeteksi dalam susu adalah hingga 0,5% cairan (Gambar 3A) dan hingga 0,001%
whey keju dehidrasi (Gambar 3B).

Prosedurnya selama 4,5 jam, termasuk pengobatan TCA pada susu.

Deteksi GMP dalam makanan komersial

Antibodi anti-GMP poliklonal digunakan untuk mengidentifikasi dengan analisis imuno-blot GMP dalam makanan komersial
dengan whey (Gambar 4). Dalam margarin, tiga pita dengan berat molekul
45, 20.1 dan 14 kDa diidentifikasi. Pita-pita ini sama dengan yang diperoleh ketika whey dianalisis. Dalam suplemen
makanan dan yogurt, hanya agregat GMP 20,1 kDa yang terdeteksi karena jumlah whey yang lebih rendah.
 Imunologi Pangan dan Pertanian 269

Gambar 2. Analisis imun-blot GMP menggunakan antibodi anti-GMP poliklonal yang dimurnikan. (A) Meningkatkan jumlah GMP murni;
(B) susu dengan peningkatan konsentrasi GMP; antibodi digunakan 1: 1000; M: 10 m l susu olahan tanpa whey (kontrol negatif).

Diskusi

Dalam penelitian ini, kami mengembangkan metode yang mudah, cepat, sensitif dan spesifik untuk mendeteksi GMP
sebagai indeks pemalsuan susu dengan whey keju. Itu adalah uji immuno-blot yang berhasil mendeteksi GMP dalam
susu yang dipalsukan dengan whey keju cair atau dehidrasi. Metode ini dikembangkan menggunakan antibodi anti-GMP
poliklonal spesifik yang mengenali dua pita 20,1 dan 14 kDa untuk GMP murni. Ketika whey keju dianalisis, satu pita lagi
dengan berat molekul 45 kDa divisualisasikan. GMP sebagai monomer memiliki berat molekul 6,8 kDa, tanpa
mempertimbangkan porsi glikosida (Brody, 2000; Galindo et al., 2006). Namun, juga dibuktikan bahwa peptida ini
membentuk agregat, dimer asal, trimer, tetramer, dll (Galindo et al., 2006). Fakta ini menjelaskan identifikasi GMP
dengan pita dengan berat molekul berbeda. Mekanisme agregasi tidak diketahui, juga tidak jelas mengapa GMP tidak
terdisosiasi di hadapan SDS. Telah diusulkan bahwa SDS bergabung dengan bagian peptida dari molekul GMP, tetapi
rantai glikosilasi bebas dari molekul GMP yang berbeda berinteraksi dengan jembatan hidrogen, menghasilkan polimer
GMP dengan berat molekul yang lebih tinggi (Galindo et al., 2006). Dalam pekerjaan kami, agregat GMP 20,1 kDa lebih
melimpah daripada agregat 14 atau 45 kDa, baik dalam GMP murni maupun dalam whey.
270 NA Chavez dkk.

Gambar 3. Analisis Immuno-blot dari sampel susu yang dipalsukan dengan peningkatan konsentrasi cairan (A) atau dehidrasi (B) keju
whey, menggunakan antibodi anti-GMP poliklonal murni yang diencerkan 1: 1000; M: 10 m l susu olahan tanpa whey (kontrol negatif);
GMP: 10 m g GMP murni (kontrol positif).

Pengembangan metode Western blot menggunakan antibodi poliklonal sebagai pengganti antibodi monoklonal,
dibenarkan karena teknik pemrosesan makanan yang berbeda dapat memengaruhi protein atau peptida mereka,
misalnya, dengan menghancurkan epitop tertentu. Dengan menggunakan antibodi poliklonal, kemungkinan mendeteksi
peptida atau protein yang diubah atau didenaturalisasi lebih tinggi, karena antibodi mengenali beberapa epitop berbeda.
Diakui bahwa penggunaan antibodi poliklonal menguntungkan untuk analisis makanan (Holden, Fæste, & Egaas, 2005).

Spesifitas antibodi anti-GMP diuji pada susu non-adulterated, yang diobati dengan TCA untuk menghilangkan
k-kasein. GMP berasal dari k-kasein, jadi perlu bekerja dengan susu tanpa k-kasein untuk menghindari reaktivitas
silang. Tidak ada reaksi positif antibodi poliklonal anti-GMP dengan sampel susu, yang menunjukkan bahwa GMP tidak
bereaksi silang dengan komponen susu lainnya, sehingga tidak ada kemungkinan hasil palsu yang positif. Fakta ini
meningkatkan kebenaran pengujian untuk menentukan pemalsuan susu dengan whey keju.
 Imunologi Pangan dan Pertanian 271

Gambar 4. Analisis imun-blot dari makanan komersial yang berbeda dengan whey keju menggunakan antibodi anti-GMP poliklonal
murni yang diencerkan 1: 1000. M: 10 m l susu olahan tanpa whey (kontrol negatif); DS: 10 m l suplemen makanan olahan; MA: 5 m l
margarin olahan; YO: 10 m l yogurt olahan; GMP: 10 m g GMP murni (kontrol positif).

Sensitivitas Western blot immunoassay untuk mendeteksi whey lebih tinggi daripada yang dilaporkan dengan
metode lain. Dengan fase balik HPLC 0,8% (w / v) whey dehidrasi (Olieman & Van Riel, 1989) terdeteksi sementara
kami memperoleh batas deteksi 0,001% (w / v) whey dehidrasi. Menggunakan HPLC, 1% (v / v) whey cair dalam susu
diidentifikasi (Galindo et al., 2006). Untuk melakukan analisis ini diperlukan pemurnian GMP sebelumnya dan ini
membutuhkan setidaknya 6 jam. Dengan uji Western blot kami mendeteksi hingga 0,5% (v / v) whey cair dalam susu
dalam 4,5 jam. Selain itu, penggunaan peralatan HPLC lebih kompleks dan mahal daripada metode yang kami
kembangkan. Oleh karena itu, immuno-blot untuk mendeteksi GMP dengan antibodi anti-GMP poliklonal terbukti
menjadi metode yang lebih mudah, lebih cepat, lebih sensitif dan lebih murah.

Keuntungan lain dari metode immuno-blot adalah spesifisitasnya untuk mendeteksi GMP, sedangkan dalam
metode lain seperti HPLC dan SDS-PAGE, identifikasi pasti dari GMP tidak dijamin, karena peptida dengan berat
molekul yang sama dengan GMP mungkin ada dalam susu. oleh aksi mikroorganisme psikrofil (Alcázar et al., 2000).
Pendekatan ini dapat menghasilkan hasil positif palsu dalam analisis susu yang dipalsukan dengan HPLC atau
SDS-PAGE.

Analisis Western blot berhasil mendeteksi GMP pada makanan komersial yang mengandung whey, sebagai
suplemen makanan, yogurt dan margarin. Sebenarnya GMP digunakan sebagai pangan nutraceutic berdasarkan nutrisi
dan sifat biologisnya seperti: faktor perangsang bakteri bifid, sumber asam sialat, aktivitas antivirus dan modulator sekresi
lambung (Brody, 2000). Pencernaan GMP menimbulkan peptida bioaktif lain yang memiliki aktivitas anti-trombotik
(Chabance et al., 1995). Saat ini, makanan pendatang baru mengandung GMP, jadi Western blot yang dikembangkan
dalam pekerjaan kami dapat digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan peptida ini dalam kontrol kualitas.

Ucapan Terima Kasih

Proyek ini didukung oleh hibah PIBT-06-1 dari UAA Norma A. Chavez memiliki beasiswa doktoral dari CONACYT. Penulis
mengucapkan terima kasih kepada Ma. Teresa Muñoz de Alba dan Dr Kalman Kovacs untuk revisi naskah.
272 NA Chavez dkk.

Referensi
Alcázar, MC, Rosas, J., Jaramillo, AC, & Peña, S. (2000). Detección de glucomacropéptido (GMP)
como indicador de adulteración con suero de queser´ı́a en leche deshidratada. Vet Mex, 37 ( 3),
217 222.
Benitez, E., Ponce, P., & Noa, M. (2001). Detección de suero de queser´ı́a en leche en polvo oleh HPLC
de fi ltración en Gel. Rev de-Salud-Animal, 23 ( 1), 27 31.
Brody, EP (2000). Aktivitas biologis glycomacropeptide sapi. Jurnal Gizi Inggris,
84 ( 1), S39 S46.
Chabance, B., Jolles, P., Izquierdo, C., Mazoyer, E., Francoual, C., & Drout, F. (1995).
Karakterisasi peptida antitrombotik dari k-kasein dalam susu pengganti plasma bayi baru lahir
proses menelan. British Journal of Nutrition, 73, 583 590.
Crester, S., Tulmann, N., & Figuera, A. (2001). Deteksi polimorfisme berulang urutan tunggal dalam
denaturasi gel sekuensing poliakrilamida dengan pewarnaan perak. Reporter Biologi Molekuler Tumbuhan,
19, 299 306.
Furlanetti, AM, & Prata, LF (2003). Isi susu GMP (Glycomacropeptide) gratis dan total
selama menyusui sapi. Ciênc Tecnol Aliment, Campinas, 23, 121 125.
Galindo, L., Valbuena, E., & Rojas, E. (2006). Estandarización de la detección del glicomacropéptido
oleh PAGE-SDS como ´ı́ndice de adulteración de leche. Revista Cient´ı́ fi ca FCV-LUZ, 16 ( 3),
308 314.
Greenber, R., & Dower, HJ (1986). Deteksi konsentrat protein whey tambahan dalam susu kering tanpa lemak
dengan analisis asam amino. Kimia Pertanian dan Biologi, 34, 30 32.
Holden, L., Fæste, C., & Egaas, E. (2005). ELISA sandwich kuantitatif untuk penentuan
Lupin ( Lupinus spp.) dalam makanan. Jurnal Kimia Pertanian dan Pangan, 53, 5866 5871.
Laemmli, Inggris (1970). Pembelahan protein struktural selama perakitan kepala
bakteriofag T4. Alam, 227, 680 685.
Leonil, J., & Molle, D. (1991). Sebuah metode untuk penentuan makropeptida dengan cepat pertukaran kation
kromatografi cair protein dan penggunaannya untuk mengikuti aksi kimosin dalam susu. Jurnal dari
Penelitian Susu, 58 ( 3), 321328.
Meisel, H., & Carstens, L. (1989). Studi banding tentang penentuan protein whey dan
kandungan kasein dalam produk susu melalui metode kasein fosfor, SDS-elektroforesis dan polarografi. Milchwissenschaft, 44, 271
277.
Mikkelsen, TL, Rasmussen, E., Olsen, A., Barkholt, V., & Fr T kiær, H. (2006). Immunogenecicy dari
k-kasein dan glycomacropeptide. Journal of Dairy Science, 89, 824 830.
Nakano, T., Ikawa, N., & Ozimek, L. (2007). Deteksi sialylated phosphorylated k- kasein
elektroforesis glycomacropeptide pada gel poliakrilamida dan strip selulosa asetat oleh asam thiobarbituric dan reaksi pewarna hijau
perunggu. Jurnal Kimia Pertanian dan Pangan, 55 ( 7), 2714 2726.

Olieman, CY, & Van Riel, JW (1989). Deteksi renner mengapa total padatan dalam bubuk skimmilk dan
buttermilk dengan HPLC fase terbalik. Jurnal Susu dan Susu Belanda, 43, 171 174.