Coba

TESIS
AKTIVITAS IMUNOMODULATOR EKSTRAK HERBA

POGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) TERHADAP
SEL RAW 264.7 SECARA IN VITRO
OLEH:
NOVYCHA AULIAFENDRI
NIM 167014031
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2019
Universitas Sumatera Utara

TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar

Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi
OLEH:
NOVYCHA AULIAFENDRI
NIM 167014031
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2019

PENGESAHAN TESIS

POGUNTANO {Picria fel-terrae Lour.) TERHADAP
SEL RAW 264.7 SECARA IN RATIO
OLES:
NOVYCBA AULIAPENDRf
NIM 167014031
Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si., M.Si., Apt
NIP 195103261978022001 NIP 197506102005012003
Yuandani, S.Farm., M.Si., Ph.D., Apt . Amin Dalimunthe, S. Si., M.Si., Apt
NIP 198303202009122004 NIP 19780 32005012004
Prof. Dr. Rosidah, M.Sr., Apt

NIP 195103261978022001
Yuandani, S.Farm., M.Si., Ph.D., Apt

l98303202009t22004
yril 2019
Mengetahui:
Ketua Program Studi,
Prof. . Urip Harahap, pt Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.

NIP 195301011983031004 NIP 195707231986012001

PERSETUJUAN TESIS
Nama Mahasiswa : Novycha Auliafendri
Nomor Induk Mahasiswa 167014031
Program Studi : Magister Ilmu Farmasi
Judul Tesis : Aktivitas Imunomodulator Ekstrak Herba
Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) Terhadap Sel
RAW 264.7 Secara In Vitro
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Komisi Penguji Tesis pada hari Rabu
tanggal dua puluh tiga bulan Januari tahun dua ribu sembilan belas.
Menyetujui:
Komisi Penguji Tesis
Ketua : Prof. Dr. Rosidah, M. Si., Apt.
Sekretaris : Yuandani, S.Farm., M.Si., Ph.D., Apt
Anggota : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si., M.Si., Apt
Dr. Aminah Dalimunthe, S.Si., M.Si., Apt

KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT, atas limpahan karunia dan rahmat-
Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Penelitian ini bertujuan
untuk melakukan skrining fitokimia, uji aktivitas sitotoksik, uji produksi Nitric
Oxide dan uji analisis ekspresi gen pada ekstrak n-heksana, etilasetat, etanol herba
poguntano (Picria fel-terrae Lour.) terhadap sel RAW 264.7 secara In vitro. Tesis
ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar magister farmasi
pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak
mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun
materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang
tiada terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum., selaku Rektor Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas
kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi
penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt selaku Ketua Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang
telah memberikan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan
Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
vi
4. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan Ibu Yuandani, M.Si., P.hD., Apt.,
sebagai Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan,
arahan, masukan, saran, dan dorongan dengan penuh kesabaran tulus dan
ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian
tesis ini.
5. Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si, M.Si., Apt dan Ibu Dr. Aminah
Dalimunthe, S.Si., M.Si., Apt., sebagai Komisi Penguji yang telah banyak
memberikan saran dan masukan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini,
sehingga tesis ini semakin baik.
6. Ibu Dr. Marline Nainggolan, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi
beserta staf.
7. Bapak Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., S.U., Ph.D., Sp.Park., Kepala
Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
beserta staf.
8. Bapak dan Ibu Staff Pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
yang telah mendidik penulis selama perkuliahan.
Penulis juga tidak lupa mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang
tulus kepada orang tua, Ayahanda, Ibunda Endriniati atas doa dan dukungan baik
moril maupun materil; kakak, adik tersayang, atas doa, dorongan dan semangat
dalam penyelesaian tesis ini; dan kepada abang Denny Satria, M.Si., Apt., dan
kakak Dina Maya Syari, S.Farm., Apt terima kasih atas bimbingan dan
motivasinya serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu selalu
memberi semangat, saran dan nasehat.
vii
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga
penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua
pihak guna perbaikan tesis ini. Akhir kata penulis berharap semoga tesis ini dapat
bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.
Medan, 23 Januari 2019

Penulis,
Novycha Auliafendri
NIM 167014031
viii
ABSTRAK
Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) merupakan salah satu tumbuhan obat di

Sumatera Utara yang telah digunakan dalam pengobatan tradisional untuk mengatasi
penyakit degeneratif dan metabolisme. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek
viabilitas sel, produksi NO (Nitric Oxide) dan ekspresi gen Tumor Necrosis Factor
(TNF)-α, interleukin (IL)-6, interleukin (IL)-1β, inducible Nitric Oxide Synthase
(iNOS) dari ekstrak n-heksana herba poguntano (ENHP), ekstrak etilasetat herba
poguntano (EEAHP) dan ekstrak etanol herba poguntano (EEHP) pada sel RAW
264.7 yang diinduksi dengan lipopolisakarida (LPS).
Simplisia dimaserasi dengan pelarut n-heksana, etilasetat dan etanol secara
bertingkat. Skrining fitokimia ditentukan dengan metode kromatografi lapis tipis.
Pengujian viabilitas sel dengan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazolium bromida], pemeriksaan produksi NO pada sel RAW 264.7 yang diinduksi
dengan LPS menggunakan pereaksi Griess dan pengujian ekspresi gen TNF-α, IL-6,
IL-1β, iNOS pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan LPS dengan metode
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Hasil skrining fitokimia dari ENHP mengandung golongan senyawa
steroid/triterpenoid sedangkan EEAHP dan EEHP mengandung flavonoid, glikosida,
saponin dan tanin. Pengujian viabilitas sel dari ENHP; EEAHP; EEHP tidak
menunjukkan efek toksik pada konsentrasi 12,5 dan 25 μg/mL dengan persentase sel
hidup (>90%) secara berurutan sebesar (92,48±0,23; 93,83±0,26; 98,76±0,35) dan
(90,14±0,31; 92,22±0,26; 94,78±0,13). Hasil analisis statistik pemeriksaan produksi
NO menunjukkan bahwa pemberian ENHP; EEAHP; EEHP (12,5 dan 25 μg/mL)
pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan LPS menghasilkan penurunan kadar NO
terbesar pada ENHP (25 μg/mL) sebesar 10,42±1,82 μg/mL yang menunjukkan efek
tidak berbeda secara signifikan terhadap kontrol positif dan kontrol normal (p>0,05).
Hasil analisis statistik pengujian ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β dari ENHP;
EEAHP; EEHP pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan LPS menurunkan nilai
densitas ENHP; EEAHP; EEHP. Pada ekspresi iNOS menghasilkan nilai densitas
paling kecil adalah ENHP (0,67±0,012) menunjukkan efek tidak berbeda secara
signifikan dengan kontrol positif dan nilai densitas ekspresi TNF-α paling kecil pada
EEAHP (1,03±0,012) menunjukkan efek tidak berbeda secara signifikan dengan
kontrol normal, selanjutnya nilai densitas ekspresi IL-1β paling kecil pada EEHP
(1,80±0,006) menunjukkan efek berbeda secara signifikan dengan kontrol normal,
kontrol positif dan kontrol negatif (p<0,05), kemudian nilai densitas ekspresi IL-6
paling kecil pada ENHP (1,27±0,008) menunjukkan efek berbeda secara signifikan
dengan kontrol normal, kontrol positif dan kontrol negatif.
Berdasarkan hasil penelitian ini, ENHP; EEAHP; EEHP tidak menunjukkan
efek toksik pada sel RAW 264.7 dan dapat menghambat produksi NO serta
menghambat ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS sehingga ENHP; EEAHP;
EEHP efektif memiliki aktivitas imunomodulator.
Kata kunci: Herba poguntano, Sel RAW 264.7, Nitric Oxide, ekspresi gen.
ix
THE IMMUNOMODULATORY ACTIVITIES OF THE EXTRACT OF
POGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) HERB
TOWARD RAW 264.7 CELL IN VITRO
ABSTRACT
Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) is one of the medicinal plants in North

Sumatera that has been used in the folk medicine to treat degenerative and metabolic
diseases. This study aimed to determine the cells viability effects, Nitric Oxide (NO)
production and the gene expression of Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, interleukin
(IL)-6, interleukin (IL)-1β and inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) on n-hexane
extracts of Picria fel-terrae Lour Herb (NEPFH), ethylacetate extracts of Picria fel-
terrae Lour Herb (EEAPFH) and ethanol extracts of Picria fel-terrae Lour Herb
(EEPFH) toward RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS).
The dried materials macerated with n-hexane, ethylacetate and ethanol
solvents, sequentially. The phytochemical screening was determined by thin layer
chromatography method. Cell viability assay was performed by MTT [3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromide] method. Measurement NO
production on RAW 264.7 cells induced by LPS was evaluated by Griess reagent and
measurement gene expression of TNF-α, IL-6, IL-1β and iNOS on RAW 264.7 cells
induced by LPS was determined by Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) method.
Phytochemical screening results of NEPFH contained steroids/triterpenoid
compounds while EEAPFH and EEPFH contained flavonoids, glycosides, saponins
and tannins. Measurement cell viability of NEPFH; EEAPFH; EEPFH don’t showed
a toxicity effect at concentration 12.5 and 25 μg/mL with the percentage of live cells
(>90%), sequentially (92.48±0.23;93.83±0.26;98.76±0.35) and (90.14±0.31;
92.22±0.26; 94.78±0.13). Statistical analysis results of the examination of NO
production indicated that the administration of NEPFH; EEAPFH; EEPFH (12.5 and
25 μg/mL) in RAW 264.7 cells induced by LPS resulted in the greatest decrease in
NO value is NEPFH (25 μg/mL) of 10.42±1.82 μg/mL which showed that the effect
was not significantly different towards positive controls and normal controls
(p>0.05). Statistical analysis result of TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS gene expression
measurement from NEPFH; EEAPFH; EEPFH in RAW 264.7 cells induced with LPS
decreased the density value of NEPFH; EEAPFH; EEPFH. The iNOS expression
resulted the smallest density value is NEPFH (0.67±0.012) showed that the effect was
not significantly different from positive control and the smallest TNF-α expression
density value is EEPFH (1.03±0.012) showed that the effect was not significantly
different from normal control, while the smallest density value of IL-1β expression is
EEPFH (1.80±0,006) showed significantly different effects with normal controls,
positive controls and negative controls (p<0.05), and the smallest IL-6 expression
density value is NEPFH (1.27±0.008) showed significantly different effects with
normal control, positive control and negative control.
Based on the results of this study, NEPFH, EEAPFH, EEPFH don’t showed a
toxicity effect in RAW 264.7 cells and has reduced NO production and gene
expression suppression of TNF-α, IL-6, IL-1β and iNOS so that it effectivelly has
immunomodulatory activity.
Keywords: Picria fel-terrae Lour, RAW 264.7 Cell, Nitric Oxide, gene expression.
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .................................................................................................i

HALAMAN PENGESAHAN TESIS .................................................................... iii
HALAMAN PERSETUJUAN TESIS ................................................................... iv
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .....................................................v
KATA PENGANTAR ........................................................................................... vi
ABSTRAK ............................................................................................................. ix
ABSTRACT ...............................................................................................................x
DAFTAR ISI .......................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiv
DAFTAR GAMBAR .............................................................................................xv
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xvi
DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xvii
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................1
1.1 Latar belakang ..............................................................................................1
1.2 Perumusan masalah ......................................................................................8
1.3 Hipotesis .......................................................................................................8
1.4 Tujuan penelitian ..........................................................................................9
1.5 Manfaat penelitian ........................................................................................9
1.6 Kerangka pikir penelitian .............................................................................9
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................12

2.1 Sistem imun ................................................................................................ 12
2.2 Komponen sistem imun ..............................................................................13
2.2.1 Selular.........................................................................................................13
2.2.1.1 Fagosit ........................................................................................................13
2.2.1.2 Limfosit ......................................................................................................14
2.2.2 Humoral ......................................................................................................16
2.2.2.1 Sitokin ........................................................................................................16
2.2.2.2 Antibodi .....................................................................................................19
2.2.2.3 Komplemen ................................................................................................ 19
2.3 Respon imun ...............................................................................................20
2.3.1 Resopon imun alami ...................................................................................20
2.3.1.1 Mekanisme makrofag sebagai fagosit dalam membunuh kuman ..............22
2.3.1.2 Makrofag teraktivasi ..................................................................................24
2.3.1.3 Pembentukan Nitric Oxide .........................................................................25
2.3.2 Respon imun adaptif...................................................................................27
2.4 Imunomodulator .........................................................................................28
2.4.1 Imunostimulasi ...........................................................................................29
2.4.2 Imunosupresi ..............................................................................................29
2.4.3 Imunoadjuvant ............................................................................................30
2.5 Metode uji aktivitas imunomodulator ........................................................30
2.6 Kultur sel ....................................................................................................34
2.7 Sel RAW 264.7...........................................................................................35
2.8 Uraian tumbuhan ........................................................................................36
2.8.1 Sistematika tumbuhan ................................................................................36
2.8.2 Nama daerah ...............................................................................................37
xi
2.8.3 Nama asing .................................................................................................37
2.8.4 Morfologi tumbuhan ..................................................................................37
2.8.5 Khasiat tumbuhan .......................................................................................37
2.9 Simplisia .....................................................................................................38
2.10 Ekstraksi .....................................................................................................39
2.10.1 Cara dingin .................................................................................................39
2.10.2 Cara panas ..................................................................................................41
2.11 Kerangka teori penelitian ...........................................................................42
BAB III METODE PENELITIAN.........................................................................44

3.1 Alat dan Bahan ...........................................................................................44
3.1.1 Alat-alat ......................................................................................................44
3.1.2 Bahan-bahan ...............................................................................................45
3.2 Penyiapan bahan tumbuhan ........................................................................45
3.2.1 Pengumpulan bahan tumbuhan ..................................................................45
3.2.2 Identifikasi tumbuhan .................................................................................46
3.2.3 Pembuatan simplisia herba poguntano .......................................................46
3.2.4 Pembuatan ekstrak herba poguntano ..........................................................46
3.2.5 Pemeriksaan skrining fitokimia ..................................................................47
3.3 Sterilisasi Alat dan Bahan ..........................................................................48
3.4 Pembuatan media .......................................................................................49
3.4.1 Pembuatan media pertumbuhan .................................................................49
3.4.2 Pembuatan media kultur lengkap ...............................................................49
3.5 Penumbuhan sel..........................................................................................50
3.5.1 Subkultur sel ...............................................................................................50
3.5.2 Panen sel .....................................................................................................51
3.5.3 Perhitungan sel ...........................................................................................51
3.6 Pembuatan larutan uji .................................................................................52
3.7 Uji viabilitas sel ..........................................................................................53
3.8 Uji produksi Nitric Oxide (NO) .................................................................53
3.9 Pemeriksaan ekspresi gen ...........................................................................54
3.9.1 Ekstraksi RNA............................................................................................55
3.9.2 Pembuatan cDNA .......................................................................................56
3.9.3 Analisis Ekspresi Sitokin TNF-α, IL-1β, IL-6 serta iNOS.........................56
3.9.4 Elektroforesis .............................................................................................57
3.10 Analisis data ...............................................................................................58
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................59

4.1 Identifikasi tumbuhan .................................................................................59
4.2 Ekstraksi herba poguntano .........................................................................59
4.3 Skrining fitokimia.......................................................................................60
4.4 Viabilitas sel pada sel RAW 264.7 .............................................................65
4.5 Produksi nitric oxide (NO) .........................................................................68
4.6 Pengujian ekspresi gen ...............................................................................70
BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN ...............................................................77

5.1 Kesimpulan.................................................................................................77
5.2 Saran ...........................................................................................................78
xii
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................79
LAMPIRAN ...........................................................................................................89
xiii
DAFTAR TABEL
2.1 Sitokin dan fungsinya ...................................................................................18

2.2 Uji aktivitas imunomodulator dari berbagai bahan alam ..............................30
4.1 Skrining fitokimia ekstrak herba poguntano .................................................60
4.2 Nilai Rf dan warna noda................................................................................62
4.3 Nilai rata-rata % sel hidup ekstrak herba poguntano ....................................67
4.4 Hasil nilai densitas ekspresi gen dari ekstrak herba poguntano ....................72
xiv
DAFTAR GAMBAR
1.1 Kerangka pikir penelitian ............................................................................... 11

2.1 Mekanisme imunitas alami dan imunitas adaptif........................................... 12
2.2 Tahapan fagositosis mikroba oleh sel fagosit ................................................ 22
2.3 Kerangka teori penelitian ............................................................................... 43
3.1 Hemositometer ............................................................................................... 51
4.1 Gambar hasil KLT skrining fitokimia ekstrak herba poguntano ................... 61
4.2 Kristal formazan pada sel RAW 264.7 .......................................................... 66
4.3 Viabilitas sel RAW 264.7 pada ekstrak herba poguntano dan
deksametason ................................................................................................. 67
4.4 Hasil produksi nitric oxide (NO) pada sel RAW 264.7 ................................. 69
4.5 Hasil ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS terhadap ekstrak
herba poguntano ............................................................................................. 71
4.6 Hasil nilai densitas ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS
terhadap ekstrak herba poguntano.................................................................. 74
xv
DAFTAR LAMPIRAN
1. Identifikasi tumbuhan .....................................................................................89

2. Surat persetujuan etik (ethical clearance).......................................................90
3. Gambar Herba Poguntano ...............................................................................91
4. Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi ..........................................92
5. Bagan pembuatan media DMEM ....................................................................93
6. Bagan pembuatan media komplit (MK) DMEM ............................................94
7. Bagan penumbuhan sel ...................................................................................95
8. Bagan panen sel ..............................................................................................96
9. Bagan perhitungan sel .....................................................................................97
10. Bagan pembuatan larutan uji ...........................................................................98
11. Bagan pengujian viabilitas sel .........................................................................99
12. Bagan pengujian produksi NO ......................................................................100
13. Bagan ekstraksi RNA ....................................................................................101
14. Bagan pembuatan cDNA...............................................................................103
15. Bagan analisis ekspresi gen ...........................................................................104
16. Bagan pengujian elektroforesis .....................................................................105
17. Sel RAW 264.7 dibawah mikroskop .............................................................106
18. Microplate 96 sumuran pengujian viabilitas sel ............................................107
19. Microplate 96 sumuran pengujian produksi NO ...........................................108
20. Microplate 6 sumuran pengujian ekspresi gen ..............................................109
21. Perhitungan pembuatan larutan uji................................................................ 110
22. Perhitungan penaman sel ..............................................................................113
23. Perhitungan viabilitas sel ..............................................................................115
24. Perhitungan viabilitas sel dengan SPSS ........................................................116
25. Perhitungan produksi NO..............................................................................117
26. Perhitungan produksi NO dengan SPSS .......................................................119
27. Perhitungan pengujian ekspresi gen .............................................................. 120
28. Perhitungan pengujian ekspresi gen dengan SPSS .......................................123
29. Gambar pita dari ekspresi gen ekstrak herba poguntano............................... 125
30. Gambar alat ...................................................................................................126
xvi
DAFTAR SINGKATAN
ADCC : Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity

AIDS : Acquired Immune Deficiency Syndrome
APC : Antigen Presenting Cells
Bp : Base pair
β-actin : Beta actin
COX-2: Siklooksigenase-2
Dexa : Deksametason
DTH : Delayed-Type Hypersensitivity Response
DNA : Deoxyribonucleic Acid
cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid
ENHP : Ekstrak n-heksana Herba Poguntano
EEAHP: Ekstrak Etilasetat Herba Poguntano
EEHP : Ekstrak Etanol Herba Poguntano
HMPS : Hexose Monophosphate Shunt
ICE : Interleukin-1β Converting Enzyme
Ig : Imunoglobulin
IL-1 : Interleukin-1
IL-1β : Interleukin-1 Beta
IL-6 : Interleukin-6
LPS : Lipopolisakarida
MHC : Major Histocompatibility Complex
NK : Natural Killer
NO : Nitric Oxide
NOS : nitric Oxide Synthase
iNOS : Inducible Nitric Oxide Synthase
nNOS : neural Nitric Oxide Synthase
eNOS : endothelial Nitric Oxid Synthase
NSAIDS : Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs
PMN : Polimorfonuklear
PCR : Polymerase Chain Reaction
RNA : Ribonucleic Acid
mRNA : Messenger Ribonucleic Acid
Rf : Retention Factor
RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
RNI : Reactive Nitrogen Intermediates
RNS : Reactive Nitrogen Species
ROI : Reactive Oxygen Intermediates
ROS : Reactive Oxygen Species
TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α
TNF-β : Tumor Necrosis Factor-β
TLRs : Toll-like Reseptor
WHO : World Health Organization
xvii
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Imunitas didefinisikan sebagai pertahanan terhadap penyakit, terutama
penyakit infeksi. Kumpulan sel-sel, jaringan dan molekul-molekul yang berperan
dalam pertahanan infeksi disebut sistem imun, sedangkan reaksi koordinasi sel-sel
dan molekul tersebut dalam pertahanan terhadap infeksi disebut respon imun
(Abbas, et al., 2016). Pada era modern ini populasi manusia sangat rentan
terserang berbagai penyakit terutama penyakit kronik seperti kardiovaskular,
kanker, penyakit akibat infeksi dan lain-lain (WHO, 2015). Hal ini disebabkan
diantaranya karena gangguan sistem imun tubuh manusia dan juga faktor gaya
hidup. Pada keadaan normal, paparan mikroorganisme patogen terhadap tubuh
dapat dilawan dengan adanya sistem imun. Pada saat fungsi dan jumlah sistem
imun rendah, paparan mikroorganisme patogen dapat menimbulkan berbagai
penyakit terutama terkait dengan penyakit infeksi dan pada saat fungsi dan jumlah
sistem imun berlebih maka akan menyerang dirinya sendiri atau disebut penyakit
autoimun. Oleh karena itu, sangat penting mempertahankan sistem imun bekerja
dengan baik sehingga mampu menghadapi serangan zat asing seperti
mikroorganisme patogen. Salah satu cara mempertahankan sistem imun adalah
dengan pemberian imunomodulator (Kusmardi, et al., 2007; Abbas, et al., 2016).
Imunomodulator adalah substansi atau obat yang dapat memodulasi fungsi
dan aktivitas sistem imun. Berdasarkan cara kerjanya imunomodulator dibagi
menjadi 2 kelompok yaitu imunostimulator dan imunosupresor. Imunostimulator
berfungsi untuk meningkatkan fungsi dan aktivitas sistem imun sedangkan
1
imunosupresor berfungsi menekan aktivitas sistem imun (Alamgir and Uddin,
2010). Modulasi sistem imun diperlukan untuk mengatasi berbagai penyakit.
Imunostimulator biasanya digunakan untuk mengatasi berbagai penyakit infeksi
seperti AIDS dan kanker (Sudiono, 2014; Ilyas, et al., 2016; Abbas, et al., 2016).
WHO melaporkan kanker penyebab kematian kedua di dunia dan bertanggung
jawab atas 8,8 juta kematian pada tahun 2015. Kanker yang disebabkan oleh
infeksi seperti hepatitis dan human papilloma virus (HPV), bertanggung jawab
hingga 25% kasus kanker di negara berpenghasilan rendah dan menengah
(Plummer, et al., 2016). Imunosupresor dapat digunakan untuk mengatasi
penyakit autoimun, terapi transplantansi organ dan berbagai penyakit inflamasi
(Abbas, et al., 2016).
Ada beberapa obat imunomodulator kimia yang digunakan dalam terapi
tetapi banyak dari mereka memiliki efek samping yang serius. Aspirin dan
ibuprofen adalah salah satu obat antiinflamasi nonsteroid (NSAID) yang dapat
menyebabkan masalah mukosa lambung dan usus (Sostres, et al., 2010; Yuandani,
et al., 2017). Kortikosteroid, yang telah lama digunakan sebagai imunosupresan
telah menunjukkan berbagai efek samping seperti retensi cairan, kenaikan berat
badan, diabetes, peningkatan kerapuhan kulit dan berkurangnya sumsum tulang.
Siklosporin A, imunosupresor yang paling banyak digunakan dalam pengobatan
penolakan transplantasi, dapat menyebabkan nefrotoksisitas, tremor, hipertensi
dan hipertrofi gingiva. Interleukin-2 menyebabkan banyak efek samping, seperti
hipotensi, takikardia, dan edema. Pada pengobatan multiple myeloma
immunomodulatory drug menyebabkan hepatotoksik (Veluswamy, et al., 2014).
Hasil penelitian pada hepatoherbal dan immunomedicinal memberikan manfaat
2
pengobatan herbal untuk penyakit-penyakit infeksi virus, hepatotoksik, kanker
dan lain-lain tanpa menggunakan obat sintetis dapat mengurangi bahkan tidak
menimbulkan efek samping dari obat sintetis tersebut (Ilyas, et al., 2016).
Upaya untuk mencari imunomodulator yang lebih aman, banyak metabolit
sekunder seperti terpenoid, fenolik dan alkaloid telah diteliti kemampuannya
untuk memodulasi sistem kekebalan tubuh. Ekstrak dari beberapa tanaman herbal
seperti Panax ginseng, Tinospora cordifolia, Centella asiatica, Phyllanthus
debilis, Trigonella foenum graecum, Pouteria cambodiana, Picrorhiza
scrophulariiflora, Garcinia mangostana, Annona muricata, Morus alba, Gynura
segetum dan Dryopteris crassirhizoma mampu menaikkan atau menurunkan
regulasi baik respon bawaan dan adaptif dari respon imun (Gautam, et al., 2004;
Jayathirtha and Mishra, 2004; Yu L, et al., 2009; Kim, et al., 2016; Chi, et al.,
2016; Kwon, et al., 2016; Zheng, et al., 2017; Yuandani, et al., 2017;). Unsur
kimia dari tanaman ini adalah sumber baru agen imunomodulasi yang potensial.
Penilaian aktivitas imunologi fitokimia dapat didasarkan pada efeknya secara
khusus pada berbagai komponen dan fungsi sistem kekebalan tubuh. Ada
peningkatan minat untuk prospek imunomodulator alami dari tanaman yang telah
digunakan secara tradisional untuk mengobati banyak gangguan imunologi.
(Yuandani, et al, 2017). Dengan demikian perlu pencarian imunomodulator dari
bahan alam untuk mengurangi efek samping tersebut. Pemilihan agen
imunomodulator dari bahan alam yang dapat mempengaruhi sistem imun
merupakan peluang yang prospektif. Salah satu tanaman yang potensial adalah
Poguntano.
3
Tumbuhan Poguntano (Picria fel-terrae Lour) telah dilakukan berbagai
penyelidikan farmakologis modern menunjukkan bahwa ekstrak Picria fel-terrae
Lour berperan sebagai diuretik (Dalimunthe, et al., 2015); antipiretik, analgesik,
hepatoprotektif, antiinflamasi (Huang, et al., 1994; Zou, et al., 2005); antioksidan
(Thuan, et al., 2007); antivirus (Zheng, et al., 2010); antidiabetes (Harfina, et al.,
2012; Sitorus, et al., 2014); anthelmintik (Patilaya dan Husori 2015); antikanker
yang bisa dikembangkan sebagai kokemoterapi (Satria, et al., 2015; Lestari, et al.,
2013); kardioprotektif (Sihotang, et al., 2016); memiliki aktivitas antioksidan
yang tinggi dan aktivitas antiproliferatif terhadap sel kanker payudara (Satria, et
al., 2017).
Hasil skrining fitokimia awal dari ekstrak Picria fel-terrae Lour
menunjukkan adanya senyawa flavonoid, alkaloid, glikosida, saponin, tanin dan
steroid/triterpenoid (Lestari, 2016; Satria, et al., 2017). Pada Penelitian Huang, et
al., (1999) menunjukkan adanya senyawa flavonoid glukuronida yang terdapat
pada ekstrak butanol poguntano, yaitu senyawa apigenin 7-O-β-glucuronide,
luteolin 7-O-β-glucuronida dan apigenin 7-O-β-(2″-O-α-rhamnosyl) glucuronide.
Apigenin memiliki efek anti inflamasi, antiradikal bebas, antikanker (Long, et al.,
2008). Beberapa penelitian juga menunjukkan bahwa beberapa senyawa flavonoid
mampu bertindak sebagai senyawa imunomodulator dari gen proinflamasi yang
mampu menurunkan reaksi inflamasi dan mempengaruhi kadar mRNA. Penelitian
lain mengungkapkan bahwa flavonoid golongan Apigenin, genistein, quercetin,
wogonin, luteolin dan luteolin 7 glukosida mencegah produksi TNF-α, IL-1β dan
IL-6 pada sel makrofag RAW 264.7 yang diinduksi Lipopolisakarida (Durga, et
al., 2014). Pada penelitian Sitorus, et al., (2014) juga menunjukkan adanya
4
senyawa steroid/triterpenoid pada ekstrak n-heksana pogunatano yaitu senyawa β-
sitosterol yang berkhasiat sebagai antidiabetes. Senyawa β-sitosterol dalam
Trachekspermum jasminoides yang diinduksi dengan Lipopolisakarida pada sel
makrofag RAW 264.7 memilliki efek antiinflamasi (Choi, et al., 2012) dan
senyawa β-sitosterol juga memiliki efek antioksidan analgesik, anthelmintik,
antimutagenik, neuroprotektif, kemoprotektif dan imunomodulator (Saeidnia, et
al., 2014). Lipopolisakarida merupakan molekul kompleks yang berasal dari
bakteri gram-negatif berfungsi sebagai inducer utama yang dapat memicu aktivasi
sel makrofag pada sistem kekebalan (Olson dan nardin, 2014, Joo, et al., 2014).
Pada penelitian sebelumnya, uji aktivitas imunomodulator dari tanaman
Picria fel-terrae Lour telah dilakukan dengan menggunakan metode Delayed-
Type Hypersensitivity Response (DTH). Hasil dari penelitian tersebut menunjukan
dosis ekstrak etanol daun poguntano yang diuji pada penelitian 0,5% dosis 10
mg/Kg BB secara oral selama 7 hari menghasilkan derajat pembengkakan yang
lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol yang hanya diberi suspensi
carboxymethyl cellulosa 0,5 % dosis 1% secara oral. Dengan demikian ekstrak
etanol daun poguntano mampu memberikan efek antiinflamasi dan aktivitas
imunomodulator (Dalimunthe, et al., 2011).
Inflamasi merupakan sebuah reaksi yang kompleks dari sistem imun tubuh
pada jaringan vaskuler yang menyebabkan akumulasi dan aktivasi leukosit serta
protein plasma yang terjadi pada saat infeksi, keracunan maupun kerusakan sel.
Inflamasi pada dasarnya merupakan sebuah mekanisme pertahanan terhadap
infeksi dan perbaikan jaringan tetapi terjadinya inflamasi secara terus-menerus
(kronis) juga dapat menyebabkan kerusakan jaringan dan bertanggung jawab pada
5
mekanisme beberapa penyakit (Abbas, et al., 2010). Proses terjadinya inflamasi
melibatkan sel leukosit (fagosit) polimorfonuklear dan sel leukosit mononuklear
yaitu makrofag (Subowo, 2014).
Makrofag merupakan salah satu sel yang berperan penting dalam respon
imun, baik secara fungsional dalam proses fagositosis maupun sebagai antigen
presenting cells (APC) mengambil dan menelan bahan asing dan menyajikan
antigen ini ke sel lain dari sistem kekebalan tubuh seperti sel T dan sel B.
Makrofag yang diaktivasi melepaskan berbagai mediator yang ikut berperan
dalam reaksi inflamasi. Beberapa jam setelah perubahan vaskuler, neutrofil
menempel pada sel endotel dan bermigrasi keluar pembuluh darah ke rongga
jaringan, memakan patogen dan melepaskan mediator yang berperan dalam
respon inflamasi. Makrofag yang berada pada jaringan yang diaktifkan akan
melepaskan sitokin diantaranya IL-1 (interleukin-1), IL-6 (interleukin-6) dan
TNF-α (tumor necrosis factor-α) yang menginduksi perubahan lokal dan sistemik.
Mediator inflamasi seperti IL-1, IL-6 dan TNF-α juga berperan dalam memacu
mengaktifkan makrofag (Abbas, et al., 2010). Makrofag yang teraktivasi juga
merupakan sel efektor utama pada pertahanan inang melawan bakteri, melalui
produksi nitric oxide (NO) yang bersifat sitotoksik untuk parasit. NO merupakan
produk utama dan produksi yang dikendalikan oleh nitric oxide synthase (NOS)
seperti iNOS (inducible nitric oxide synthase). iNOS diinduksi pada makrofag
sehingga aktivasi mengarah pada kehancuran organ pada beberapa inflamasi dan
penyakit autoimun (Yoon, et al., 2009).
Pelepasan sitokin yang berlebihan dapat menimbulkan gangguan sistem
imun sehingga perlu diketahui ekspresi gen dari sitokin tersebut. Metode yang
6
dilakukan dalam mengetahui pengaruh ekspresi gen menggunakan metode
berbasis reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Prinsip kerja
metode RT-PCR mengamplifikasi RNA. RNA diubah menjadi DNA dengan
menggunakan reverse transcriptase yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan
RNA dan menghasilkan DNA yang disebut dengan cDNA. Setelah terbentuk
DNA maka dapat diamplifikasi dengan menggunakan PCR (Sudjadi, 2008).
Metode RT-PCR juga telah digunakan untuk melihat tingkat ekspresi dari TNF-α,
IL-6, IL-1β, COX-2, iNOS dan β-actin (Yoon, et al., 2009; Yanti, et al., 2011).
Adapun RNA/DNA yang digunakan dalam metode RT-PCR ini diperoleh dari Sel
RAW 264.7. Sel RAW 264.7 merupakan suatu monocyte-machrophage cell line
yang banyak digunakan dalam penelitian tentang sistem imun karena merupakan
sel makrofag yang diproduksi dari sumsum tulang belakang. Sel RAW 264.7
dapat diperoleh dari organisme Mus musculus yang mengalami tumor diinduksi
oleh virus leukemia murine Abelson dan juga dapat diperoleh dari kultur sel
menggunakan media pertumbuhan (ATCC, 2017).
Berdasarkan uraian diatas maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aktivitas imunomodulator ekstrak herba poguntano pada kultur sel RAW 264.7
secara in vitro. Pengujian viabilitas sel untuk mengetahui konsentrasi aman pada
ekstrak herba poguntano menggunakan metode MTT assay, produksi nitric oxide
(NO) menggunakan pereaksi Griess dan analisis ekspresi iNOS, TNF-α, IL-1β,
IL-6 menggunakan metode reverse trancription-polymerase chain reaction (RT-
PCR).
7
1.2 Perumusan masalah
Berdasarkan uraian diatas maka perumusan masalah dalam penelitian ini
adalah:
a. Apakah pemberian ekstrak herba poguntano bersifat toksik terhadap sel
RAW 264.7?
b. Apakah pemberian ekstrak herba poguntano dapat menghambat produksi
nitric oxide (NO) pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan
Lipopolisakarida?
c. Apakah pemberian ekstrak herba poguntano dapat menghambat ekspresi
iNOS, TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan
Lipopolisakarida?
1.3 Hipotesis
Berdasarkan perumusan masalah diatas maka hipotesis dalam penelitian
ini adalah :
a. Pemberian ekstrak herba poguntano tidak bersifat toksik terhadap sel
RAW 264.7.
b. Pemberian ekstrak herba poguntano dapat menghambat produksi nitric
oxide (NO) pada sel RAW 264. 7 yang diinduksi dengan Lipopolisakarida.
c. Pemberian ekstrak herba poguntano dapat menghambat ekspresi iNOS,
TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan
Lipopolisakarida.
8
1.4 Tujuan penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah untuk:
a. Mengetahui apakah pemberian ekstrak herba poguntano bersifat toksik
terhadap sel RAW 264.7.
b. Mengetahui apakah pemberian ekstrak herba poguntano dapat
menghambat produksi nitric oxide (NO) pada sel RAW 264.7 yang
diinduksi dengan Lipopolisakarida.
c. Mengetahui apakah pemberian ekstrak herba poguntano dapat
menghambat ekspresi iNOS, TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada sel RAW 264.7
yang diinduksi dengan Lipopolisakarida.
1.5 Manfaat penelitian
Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan kontribusi:
a. Sebagai pengembangan ekstrak herba poguntano menjadi sediaan obat
herbal terstandar yang efektif dan selektif sebagai imunomodulator.
b. Dapat menambah data informasi dalam pemanfaatan dan inventaris
tumbuhan herba poguntano sebagai tanaman obat yang berkhasiat sebagai
imunomodulator.
1.6 Kerangka pikir penelitian
Kerangka pikir penelitian terdiri dari 2 variabel, yaitu variabel bebas,
variabel terikat dan 1 parameter. Variabel bebas pada penelitian ini yaitu ekstrak
n-heksana, etilasetat, etanol herba poguntano dan deksametason sebagai kontrol
positif dengan berbagai konsentrasi. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah
9
viabilitas sel (untuk mengetahui konsentrasi aman dari sampel), produksi NO dan
ekspresi gen (iNOS, TNF-α, IL-1β dan IL-6). Adapun parameter pada kerangka
pikir penelitian ini yaitu persentase sel hidup, kadar NO dan densitas gambaran
pita ekspresi gen. Secara skematis kerangka pikir penelitian ditampilkan pada
Gambar 1.1
10
Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter
Kelompok yang diuji:

-Ekstrak n-heksana
-Ekstrak Etilasetat
-Ekstrak Etanol
Konsentrasi: Sel
(12,5; 25; 50; 100; RAW Viabilitas sel % sel hidup
200 μg/mL) 264.7
Kontrol Positif:
Deksametason
Konsentrasi:
(1,25; 2,5; 5; 10; 20
μg/mL)
Konsentrasi
yang aman

-Ekstrak n-heksana
-Ekstrak Etilasetat
-Ekstrak Etanol
Konsentrasi: Sel
(12,5; 25 μg/mL) RAW Produksi NO Kadar NO
Kontrol Positif: 264.7
Deksametason
Konsentrasi:
(1,25; 2,5μg/mL)
Konsentrasi
paling efektif

-Ekstrak n-heksana
-Ekstrak Etilasetat Densitas
-Ekstrak Etanol Sel Ekspresi gen gambaran
Konsentrasi: RAW (iNOS, TNF-α, pita
(25 μg/mL) 264.7 IL-1β, IL-6) ekspresi
Kontrol Positif: gen
Deksametason
Konsentrasi:
(2,5 μg/mL)
Gambar 1.1 Kerangka pikir penelitian
11
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sistem imun
Sistem imun merupakan molekul, sel, jaringan dan organ yang secara
kolektif berfungsi untuk memberikan kekebalan atau perlindungan terhadap
organisme asing. Sistem imun dibagi atas dua jenis, yaitu sistem imun alami
(nonspesifik atau innate immune) dan sistem imun dapatan (spesifik atau adaptive
immune) (Abbas, et al, 2016). Mekanisme pertahanan tubuh oleh sistem imun
alami bersifat spontan, tidak spesifik, dan tidak berubah baik secara kualitas
maupun kuantitas bahkan setelah paparan berulang dengan patogen yang sama
sedangkan sistem imun dapatan muncul setelah proses mengenal oleh limfosit
(clonal selection), yang tergantung pada paparan terhadap patogen sebelumnya.
Adanya sistem imun kongenital memungkinkan respon imun dini untuk
melindungi tubuh selama 4-5 hari merupakan waktu yang diperlukan untuk
mengaktivasi limfosit (imunitas dapatan) (Handayani, 2010).
Gambar 2.1 Mekanisme imunitas alami dan imunitas adaptif (Abbas et al., 2016).
Mekanisme imunitas alami merupakan pertahanan awal melawan infeksi.
Sedangkan respon imun adaptif timbul setelahnya dan dimediasi oleh
limfosit dan produknya. Antibodi mengblok infeksi dan mengeliminasi
mikroba, eradikasi mikroba ekstrasel dilakukan oleh sel T. Kinetika respon
imun bawaan dan adaptif berbeda tergantung dari jenis infeksinya.
12
2.2 Komponen sistem imun
Sistem imun terdiri dari 2 komponen yaitu komponen selular dan humoral.
2.2.1 Selular
Komponen selular dalam sistem imun yaitu sel fagosit dan sel limfosit.
2.2.1.1 Fagosit
Sel fagosit terbagi atas polimorfonuklear (sel neutrofil, basofil, eosinofil)
dan mononuklear (sel monosit/makrofag).
a. Polimorfonuklear
Leukosit yang paling banyak dalam darah, berjumlah 4000-10.000/µL.
Pada respon terhadap infeksi, produksi neutrofil dari sumsum tulang meningkat
cepat dan jumlahnya meningkat hingga 20.000/µL darah. Neutrofil adalah tipe sel
utama yang memberikan respon terhadap kebanyakaan infeksi, khususnya infeksi
bakteri dan fungi, dan merupakan sel yang dominan saat inflamasi akut (Abbas, et
al., 2016). Eosinofil terlibat dalam respons antiparasit dan reaksi alergi, infeksi
parasit dan inflamasi kulit. Di dalam darah 1 sampai 3 % sel darah putih adalah
eosinofil. Basofil merupakan granulosit yang paling jarang hanya 0,4 sampai 1%
sel darah putih di dalam darah. Jumlah basofil dapat meningkat pada kasus
leukemia, pada beberapa respons alergi, pada pasien penderita inflamasi kronis
dan pada pasien setelah terapi. Basofil berperan dalam inflamasi dan alergi (Olson
dan Nardin, 2014).
b. Mononuklear
Fagosit mononuklear dihasilkan oleh sel induk (steam cell) di dalam
sumsum tulang kemudian berdiferensiasi menjadi premonosit-monosit-makrofag.
Monosit berdiameter 10-15 μm. Kemudian bermigrasi dan menetap di jaringan,
13
sel monosit matang dan menjadi makrofag. Sel makrofag berdiferensiasi,
membesar jumlahnya dan organel-organel bertambah kompleks (Abbas and
Lichtman, 2010). Ukuran makrofag bisa 5-10 kali lebih besar dibanding monosit
(Baratawidjaja dan Rengganis, 2010).
2.2.1.2 Limfosit
Limfosit adalah sel yang memproduksi reseptor spesifik untuk antigen
yang sangat beragam yang terdistribusi secara klonal, merupakan mediator kunci
imunitas adaptif. Sel limfosit naif berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel
limfosit memori dan berbagai sel efektor yang mensekresi berbagai limfokin yang
dapat berperan sebagai mediator dalam sistem imunitas. Limfokin ini berpengaruh
pada aktivasi sel B, sel T, sel NK dan sel lain yang terlibat dalam respon imun
(Abbas, et al., 2016).
a. Limfosit B
Limfosit B merupakan satu-satunya sel yang mampu memproduksi
antibodi, mereka adalah sel-sel yang memerantarai imunitas humoral sel B
mengekspresikan antibodi membentuk membran yang berlaku sebagai reseptor
yang mengenali antigen dan mengawali proses aktivasi sel. Antigen terlarut dan
antigen permukaan mikroba serta sel-sel lainnya dapat berikatan dengan reseptor
antigen limfosit B, mengawali proses aktivasi sel B. Hal ini kemudian
menyebabkan sekresi antibodi terlarut yang mempunyai spesifisitas antigen yang
sama dengan reseptor membran sel B (Abbas, et al., 2016).
b. Limfosit T
Limfosit T bertanggung jawab untuk imunitas seluler. Respon antigen dari
sebagian besar limfosit T hanya mengenali fragmen-fragmen peptide khusus yang
14
menyajikan molekul, yang disebut molekul Major Histocompatibility Complex
(MHC), pada permukaan sel khusus yang disebut sel penyaji antigen (antigen-
presenting cells APC). Limfosit T, sel T CD4+ disebut sel T helper karena
membantu sel limfosit B memproduksi antibodi dan membantu sel fagosit
menghancurkan mikroba yang telah dimakan. Limfosit CD8+ disebut limfosit
sitotoksik karena membunuh sel-sel yang mengandung mikroba intraseluler.
Beberapa sel T CD4+ termasuk kedalam kelompok khusus yang berfungsi
mencegah atau membatasi respons imun disebut limfosit T regulator (Abbas, et
al., 2016).
c. Sel NK (Natural killer)
Sel NK mengenali sel yang terinfeksi dan mengalami stress dan
memberikan respons terhadap interleukin-12 yang diproduksi oleh makrofag
untuk membunuh sel mikroba dengan mensekresikan sitokin IFN-γ yang
mengaktifkan makrofag untuk membunuh mikroba yang difagositosis (Abbas, et
al., 2016). Sel NK adalah sumber penting IFN-γ, terutama ketika dirangsang
dengan IL-12 dan IL-18. Selain itu, IFN-γ merupakan penambah aktivitas sel NK
sitotoksik. Dengan demikian, sel-sel NK yang toksik pada tikus defisiensi IFN-γ.
Sebagai catatan, IFN-γ adalah penginduksi paling kuat dari protein pengikat IL-
18, inhibitor signifikan IL-18. Dengan fungsi pengaturan ini, IFN-γ menginduksi
jalur umpan balik negatif dalam proses inflamasi, juga mempengaruhi produksi
sel NK itu sendiri. Dalam sel B, IFN-γ bertindak langsung pada sekresi antibodi
dengan mengatur perpindahan kelas Ig dari IgM ke isotipe hilir (Avau and
Matthys, 2015).
15
2.2.2 Humoral
Komponen humoral dalam sistem imun yaitu sitokin, antibodi dan
komplemen.
2.2.2.1 Sitokin
Sitokin adalah protein terlarut yang memperantarai reaksi imun dan
inflamasi dan bertanggung jawab dalam komunikasi antara leukosit dan antara
leukosit dengan sel-sel lain. Kebanyakan molekul-molekul yang didefenisikan
sebagai sitokin disebut Interleukin. Sitokin diproduksi makrofag dan sel NK yang
berperan pada inflamasi dini, merangsang proliferasi, diferensiasi, dan aktivasi sel
efektor khusus seperti makrofag. Sitokin yang diproduksi sel T mengaktifkan sel-
sel imun spesifik (Abbas, et al., 2016).
a. Interleukin
Interleukin terdiri dari 1 sampai 30 bahkan lebih (Playfair dan Chain,
2012). Salah satu diantaranya interleukin 1 (IL-1) merupakan faktor pengaktivasi
limfosit atau pirogen endogen, yang merupakan pengatur kunci dari inflamasi
adhesi endotel dan aktivasi makrofag. Selain itu IL-1 juga berperan dalam
menimbulkan demam yaitu suatu gejala menginfeksi melalui kerja hipotalamus.
IL-1 terdiri dari α dan β (Playfair dan Chain, 2012). IL-1β memainkan peran
penting dalam regulasi sistem kekebalan dan respon inflamasi. IL-1β merupakan
mediator terjadinya inflamasi. IL-1β dan sitokin proinflamasi yang lain berperan
penting dalam stimulasi inflamasi. Sitokin proinflamasi mengaktivasi leukosit
seperti monosit dan polimorfonuklear (PMN) sehingga menimbulkan reaksi
inflamasi. IL-1β dapat merangsang respon kekebalan tubuh dengan mengaktifkan
limfosit atau dengan menginduksi pelepasan sitokin lainnya yang mampu
16
meningkatkan aktivitas sel makrofag, sel NK, dan limfosit (Chi, et al., 2016). IL-
1β merupakan sitokin yang dirilis oleh ICE, dan juga berperan di dalam aktivitas
selular seperti proliferasi, diferensiasi dan apoptosis. Induksi COX-2 pada sitokin
ini di dalam sistem saraf pusat ditemukan sebagai penyebab hipersensitivitas yang
memberikan rasa sakit.
Disamping IL-1 yang berperan sebagai mediator inflamasi IL-6 juga
berperan sebagai mediator inflamasi. IL-6 dihasilkan oleh makrofag dan juga
dihasilkan oleh jenis sel lainnya, seperti limfosit T, fibroblast dan sel-sel tumor
seperti glioblastoma, miksoma dan sel karsinoma kandung kemih. IL-6 yang
dihasilkan oleh sel limfosit T digolongkan pula dalam limfokin. IL-6 memiliki
keterkaitan dengan IL-1 dan TNF (Tumor Necrosis Factor), karena ketiga sitokin
ini dihasilkan oleh monosit/sel makrofag secara terkordinasi. Keterkaitan ketiga
sitokin tersebut juga karena adanya fungsi masing-masing dapat saling
menginduksi pelepasan monokin lain. Misalnya IL-1 dan TNF dapat menginduksi
pelepasan IL-6, dan IL-6 menginduksi pelepasan IL-1 dan TNF. Hal yang menarik
mengenai keterkaitannya, bahwa ketiga sitokin tersebut dapat diangkut oleh
peredaran darah untuk membangkitkan reaksi peradangan yang dinamakan
“respon fase akut”. Respon fase akut ini bermanifestasi sebagai demam dan
pergeseran kandungan beberapa jenis protein dalam serum yang diproduksi oleh
hepatosit tersebut tergantung pada masing-masing rangsangan ketiga sitokin
tersebut (Subowo, 2014).
b. Faktor nekrosis tumor (Tumor Necrosis Factor)
Faktor nekrosis tumor terdiri TNF-α dan TNF-β. TNF menimbulkan efek
menyeluruh pada inflamasi, penyembuhan dan jika dihasilkan berlebihan dapat
17
menimbulkan syok vaskular. Dahulu diberi nama tersebut karena mampu
memperkecil ukuran tumor. TNF-α dapat memacu pertumbuhan dan metastatis
sejumlah besar tumor, sebagian dengan meningkatkan inflamasi yang berarti
menyediakan pasokan darah tumor. TNF-α juga berperan penting dalam degradasi
sendi pada artritis reumatoid dan perkembangan cara menghambat aktivitas
sitokin tersebut untuk tujuan terapi adalah salah satu cara keberhasilan bidang
imunologi selama beberapa dekade terakhir (Playfair dan Chain, 2012). Tumor
necrosis factor-α (TNF-α), memainkan peran penting dalam pengenalan, inisiasi,
dan regulasi proses inflamasi dan berfungsi sebagai komponen penting dari
kekebalan bawaan. Sitokin merupakan regulator penting dari sistem kekebalan
tubuh, menyelidiki fungsi mereka mungkin memberikan informasi penting untuk
pengembangan vaksin dan imunostimulan. TNF-α diproduksi terutama oleh
monosit dan makrofag dan mereka mengatur beberapa aspek dari sistem
kekebalan tubuh (Chi, et al., 2016). Faktor nekrosis tumor lain yaitu TNF-β
seringkali disebut limfotoksin, memiliki perbedaan berupa suatu produk limfosit.
TNF-α dan TNF-β memiliki sepasang reseptor yang sama, sebagian struktur dan
lokasi kromosom dalam MHC. Faktor ini berperan penting dalam perkembangan
jaringan limfoid sekunder (Playfair dan Chain, 2012).
Tabel 2.1. Sitokin dan fungsinya (Katzung, 2002; Hariadi, T.S., 2015; Abbas, et
al., 2016).
Reseptor
Sitokin Sumber
sitokin
dan sel Sel target dan efek biologis
dan
submit utama
subunit
Inter Makro- CD121a Sel endotel: aktivasi (inflamasi, koagulasi)
leukin- fag, sel (IL-1R1) Hipotalamus : demam
1β den- IL-1RAP Hepar : sintesis protein fase akut
(IL-1β) dritik, atau Fungsi :
fibro- CD121b Mengaktifkan sel T, menginduksi demam,
18
blas, sel (IL-1R2) meningkatkan pertumbuhan, merangsang produksi
endotel, limfokin diantaranya IL-2, B cell growth factor, IFN-γ,
kera- dan faktor kemotaktik.
tinosit
Inter- Makro- CD126 Hepar : Sintesis protein fase akut,
leukin- fag, sel (IL-6R), Sel B : Proliferasi sel yang memproduksi antibodi
6 endotel, CD130 Sel T : diferensiasi Th17
(IL-6) sel T (gp130) Fungsi :
Proliferasi sel HCF, TH2, CTL dan B,
Merangsang produksi IgM dalam sel B.
Tumor Makro- CD120a Sel endotel: aktivasi (inflamasi, koagulasi)
Necrosi fag, sel (TNFRS Neutrofil: aktivasi
s NK, F1) atau Hipotalamus: demam
Factor sel T CD120b Otot, lemak: katabolisme (kakesia)
(TNF, (TNFRS Fungsi TNF-α:
TNFSF F2) Aktivasi makrofag, proinflamasi, onkostatik,
1) kemotaksis.
Meningkatkan ekspresi reseptor dari IL-2, IFN-γ dari
sel T, menjadi sitotoksin langsung pada sel tumor
tertentu, merangsang tidur, demam.
2.2.2.2 Antibodi
Antibodi disebut juga Imunoglobulin (Ig). Antibodi terbuat dari
sekumpulan protein yang sangat mirip, setiap protein ini mampu berikatan secara
spesifik dengan sejumlah antigen yang sedikit berbeda, dengan spesifisitas yang
berlainan untuk setiap antigen. Antibodi dapat berikatan dengan dan menetralisir
toksin bakteri dan beberapa virus secara langsung, tetapi antibodi juga bekerja
dengan cara opsonisasi dan mengaktivasi komplemen pada permukaan patogen
yang menyerang (Playfair dan Chain, 2012).
2.2.2.3 Komplemen
Sekumpulan protein yang ada dalam serum, yang jika teraktivasi akan
menimbulkan efek inflamasi yang meluas, disertai juga dengan lisis bakteri dsb.
Beberapa bakteri mengaktivasi komplemen secara langsung sedangkan bakteri
lain dapat melakukan hal ini dengan bantuan antibodi (Playfair dan Chain, 2012).
19
2.3 Respon imun
Respon imun diperantarai oleh berbagai sel dan molekul larut yang
disekresi oleh sel-sel tersebut. Sel-sel utama yang terlibat dalam reaksi imun
adalah limfosit (sel B, sel T, dan sel NK), fagosit (neutrofil, eosinofil, monosit,
dan makrofag), sel asesori (basofil, sel mast, dan trombosit), sel-sel jaringan, dan
lain-lain. Bahan larut yang disekresi dapat berupa antibodi, komplemen, mediator
inflamasi, dan sitokin. Walaupun bukan merupakan bagian utama dari respon
imun, sel-sel lain dalam jaringan juga dapat berperan serta dengan memberi
isyarat pada limfosit atau berespons terhadap sitokin yang dilepaskan oleh limfosit
dan makrofag (Wahab dan Madarina, 2002). Respon imun terbagi atas 2 yaitu
respon imun alami dan respon imun adaptif.
2.3.1 Respon imun alami atau nonspesifik
Respon imun nonspesifik merupakan imunitas bawaan (innate imunity)
dimana respon imun terhadap zat asing dapat terjadi walaupun tubuh sebelumnya
tidak pernah terpapar oleh zat tersebut (Kresno, 1996). Imunitas nonspesifik
berperan paling awal dalam pertahanan tubuh melawan mikroba patogen yaitu
dengan menghalangi masuknya mikroba dan dengan segera mengeliminasi
mikroba yang masuk ke jaringan tubuh (Abbas, et al., 2016). Respon imun jenis
ini akan selalu memberikan respon yang sama terhadap semua jenis agen infektif
dan tidak memiliki kemampuan untuk mengenali agen infektif meskipun sudah
pernah terpapar sebelumnya. Adapun yang termasuk dalam respon imun
nonspesifik adalah pertahanan fisik, biokimia, humoral dan seluler (Baratawidjaja
dan Rengganis, 2012).
20
Reaksi utama terhadap sistem imun alami adalah inflamasi dan pertahanan
antivirus. Pertahanan imun alami terhadap virus intraselular diperantarai oleh sel
natural killer (NK) yang membunuh sel yang terinfeksi virus dan oleh sitokin
yang disebut interferon yang menghambat replikasi virus di dalam sel inang.
Inflamasi terdiri dari akumulasi dan aktivasi leukosit dan protein plasma pada
lokasi infeksi atau kerusakan jaringan. Sel-sel dan protein tersebut bertindak
bersama untuk membunuh terutama mikroba ekstraselular dan eliminasi jaringan
yang rusak. Inflamasi merupakan suatu reaksi jaringan yang mengirimkan
mediator-mediator pertahanan sel-inang dan protein dalam darah-menuju lokasi
infeksi dan kerusakan jaringan. Respon imun alami diatur oleh berbagai
mekanisme yang dirancang untuk mencegah kerusakan jaringan yang berlebihan.
Mekanisme regulasi tersebut termasuk produksi sitokin antiinflamasi oleh
makrofag dan sel dendritik, termasuk interleukin-10 yang menghambat fungsi
mikrobisida dan proinflamasi makrofag dan antagonis reseptor IL-1 yang
menghambat kerja IL-1. Terdapat juga banyak mekanisme umpan balik dimana
sinyal yang merangsang produksi sitokin proinflamasi juga merangsang ekspresi
penghambat sinyal sitokin (Abbas, et al., 2016).
Makrofag juga mengalami fagositosis untuk membunuh mikroba. Proses
fagositosis terjadi melalui beberapa tingkat yaitu kemotaktis, menangkap,
memakan, fagositosis, memusnahkan, dan mencerna. Kemotaktis adalah
pergerakan fagosit ke tempat infeksi sebagai respons terhadap berbagai faktor
seperti produk bakteri dan faktor kimiawi yang dilepas pada aktivasi komplemen.
Antibodi seperti halnya dengan komplemen (C3b) dapat meningkatkan
opsonisasi. Opsonin adalah molekul besar yang diikat dan dapat dikenal oleh
21
reseptor permukaan sel fagosit makrofag, sehingga meningkatkan efisiensi
fagositosis. Makrofag mengekspresikan banyak reseptor permukaan yang dapat
menelan mikroba. Bila sudah ditelan, membran menutup, partikel digerakkan ke
sitoplasma sel dan terbentuk vesikel intraseluler yang mengandung bakteri atau
bahan lain asal ekstraseluler yang disebut fagosom. Didalam sel terdapat enzim
lisosom yang diperlukan untuk memecah bahan yang ditelan, bersatu dengan
fagosom membentuk fagolisosom memungkinkan terjadinya degradasi oleh ROS
dan NO sehingga terjadi degradasi oleh makrofag (Baratawidjaja dan Rengganis,
2012).
Gambar 2.2 Tahapan fagositosis mikroba oleh sel fagosit (Abbas et al., 2010). Mikroba
yang masuk ke dalam tubuh akan berikatan dengan reseptor sel fagosit
kemudian membran sel fagosit akan mengelilingi mikroba yang terikat tadi
dan pada akhirnya mikroba akan dicerna di dalam fagosom. Di dalam sel
fagosit terjadi fusi antara fagosom dan lisosom membentuk fagolisosom.
Sel fagosit menghasilkan ROS, NO dan enzim lisosomal dalam
fagolisosom sehingga menyebabkan mikroba mati.
2.3.1.1 Mekanisme makrofag sebagai fagosit dalam membunuh kuman
Mekanisme makrofag sebagai fagosit dalam membunuh kuman sebagai
berikut:
a. Proses oksidatif (Oxygen dependent mechanism)
Proses oksidatif merupakan proses dimana terjadi peningkatan penggunaan
oksigen yang menghasilkan ROI (reactive oxygen intermediates) yaitu suatu
22
metabolit oksigen mikrobisidal yang dilepas selama fagositosis. Ikatan mikroba
dengan sel fagositosis terjadi fusi dengan lisosom membentuk fagolisosom
(Abbas, et al., 2010). Dengan terbentuknya fagolisosom, reseptor fagosit yang
mengikat mikroba mengirimkan sinyal yang mengaktifkan beberapa enzim dalam
fagolisosom, salah satunya oksidase fagosit terbentuk atas pengaruh mediator
inflamasi LTB4, PAF dan TNF atau produk bakteri seperti peptida N-
formilmetionil (Baratawidjaja dan Rengganis, 2012). Enzim tersebut mengubah
oksigen menjadi superoxide anion, hydroxyl radicals, single oxygen,
myeloperoxidase, hydrogen peroxide (H2O2) yang dapat berinteraksi sehingga
menghasilkan metabolit oksigen yang toksik yang dapat digunakan untuk
membunuh kuman (Abbas, et al., 2010).
b. Proses non oksidatif (Oxygen independent mechanis)
Proses non oksidatif berlangsung dengan bantuan berbagai protein seperti
hydrolytic enzyme, defensins (cationic protein), lysozyme, lactoferrin dan nitric
oxide synthase (NOS). Pada aktivitas nitric oxide synthase (NOS) diperlukan
bantuan IFN-γ dan TNF tipe I yang dapat meningkatkan produksi NO dari
makrofag di organ limfe. Dengan peningkatan reactive oxygen intermediate
(ROIs), makrofag menghasilkan reactive nitrogen intermediates dengan bantuan
enzyme seperti hydrolitic enzyme, defensins (cationic protein), lysozyme,
lactoferrin dan nitric oxide synthase (iNOS). Nitric oxide synthase merupakan
katalase dalam konversi arginin menjadi NO yang bersifat bakterisidal. Dalam
fagolisosom terjadi reaksi fagosit oksidase antara nitric oxide dengan hidrogen
peroksida atau superoksida yang menghasilkan radikal peroxy nitrit sangat reaktif
dan bisa membunuh mikroba (Abbas, et al., 2010).
23
2.3.1.2 Makrofag teraktivasi
Proses pengaktifan makrofag bukan merupakan proses tunggal.
Pengukuran untuk makrofag teraktivasi dapat dilakukan antara lain kemampuan
membunuh terhadap mikroba yang sudah difagositosis. Aktivasi makrofag
diakibatkan adanya peningkatan transkripsi gen-gen karena adanya peningkatan
ekspresi gen-gen tersebut maka makrofag dapat melakukan fungsi yang tidak
dapat dilakukan oleh sel yang sama dalam keadaan istirahat. Sitokin aktivator
makrofag yang poten adalah IFN-γ (Surati, 2012).
Makrofag teraktivasi mempunyai beberapa ciri antara lain :
a. Kemampuan membunuhnya meningkat terhadap mikroorganisme
Proses pembunuhan terhadap bakteri menyangkut proses fagositosis dan
pembentukan ROS. Sitokin seperti IFN-γ akan meningkatkan baik endositosis
maupun fagositosis oleh monosit. Fagositosis terhadap partikel tertentu dapat
ditingkatkan dengan opsonisasi bakteri yaitu dengan melapisi bakteri dengan
molekul IgG atau komplemen. IFN-γ menyebabkan peningkatan ekspresi reseptor
dengan ikatan kuat terhadap bagian Fc dari IgG. Bakteri setelah masuk ke dalam
makrofag maka akan dilakukan pembunuhan dengan ROS melalui jalur ROI.
Radikal superoksida, hidrogen peroksida, radikal hidroksil dan singlet oxygen
termasuk golongan ROS. ROS sangat reaktif maka dapat membunuh bakteri dan
menghancurkan sel-selnya. Dalam proses tersebut dibutuhkan lebih banyak
oksigen (kebutuhan oksigen meningkat sampai 100 kali) maka prosesnya disebut
sebagai respiratory burst (letupan respiratori). Nitric oxide synthase berikatan
dengan molekul kofaktor tetrahidrobiopterin, ikatan NOS dan kofaktor ini akan
mengubah L-arginin dengan bantuan oksigen untuk membentuk sitrulin dan NO.
24
NO ini bersifat toksik untuk bakteri. Jalur ini diaktivasi oleh IFN-γ dan dipicu
oleh adanya TNF (Surati, 2012).
b. Makrofag teraktivasi akan memacu inflamasi dengan mengeluarkan

mediator-mediator inflamasi
Platelet activating factor (PAF), prostaglandin dan leukotrien adalah lipid,
beberapa disintesis oleh makrofag sendiri dan yang lainnya dihasilkan dari
molekul-molekul plasma sebagai tanggapan atas enzim dan molekul-molekul
terkait yang dihasilkan oleh makrofag. Sebagai contoh makrofag dapat
menghasilkan tissue factor yang dapat menginisiasi kaskade pembentukan
instrinsik. Trombin sebagai protease darah yang teraktivasi selama clotting
cascade akan menyebabkan neutrofil dan sel endotel mensintesis PAF. Pemberian
IFN-γ akan meningkatkan kapasitas biosintesis makrofag untuk membentuk
mediator semacam tissue factor, akibat mediator-mediator yang dilepaskan maka
terjadilah inflamasi lokal (Surati, 2012).
2.3.1.3 Pembentukan nitric oxide
Nitric oxide (NO) adalah produk yang dihasilkan oleh makrofag teraktivasi
untuk pembunuhan patogen intrasel melalui jalur RNI. NO merupakan suatu
radikal bebas yang disintesis oleh enzim NOS melalui reaksi yang kompleks.
Proses produksi nitric oxide diawali dari terpajan makrofag oleh lipopolisakarida
(LPS) dari bakteri sehingga jalur produksi reactive nitrogen intermediate (RNI)
terinduksi. Jalur produksi RNI dimulai dari proses perubahan L-arginin menjadi
L-citrulin yang membutuhkan flavin adenine dinucleotidase (FAD), flavin
mononucleotidase (FMN), NADP yang terinduksi (NADPH) dan bentuk tereduksi
dari biopretin (BH4) dengan bantuan enzym nitric oxide synthase (NOS). Proses
ini menghasilkan molekul NO yang dapat teroksidasi menjadi senyawa RNI
25
seperti dinitrogentrioxide (N2O3) dan dinitrogentetraoxide (N2O4). RNI akan
berperan pada fase awal dan berikutnya pada aktifitas antibakteri makrofag. Nitric
oxide, nitrit dan nitrat termasuk dalam kelompok RNI. Makrofag mencit yang
teraktivasi oleh sitokin IFN, TNF, IL-1, IL-2 dan lipid A dari lipopolisakarida
(LPS) bakteri dengan bantuan iNOS akan terinduksi untuk membentuk NO dari
prekursor L-arginin (Surati, 2012).
NADPH oksidase dan iNOS dapat bersinergi membentuk molekul
antimikroba yang potensial. NO dan O2- dapat bereaksi membentuk ONOO-
(peroksinitrit), suatu oksidan yang dapat meningkatkan daya bunuh terhadap
salmonella. NADPH oksidase mengkatalisis molekul O2 menjadi O2-
(superoksida) yang dapat dimetabolisir menjadi ROI seperti H2O2 yang sangat
toksik, iNOS mengkatalisis L-arginin menjadi sitrulin dan NO yang selanjutnya
dapat dimetabolisir menjadi reactive nitrogen intermediates (RNI) (Torres, et al.,
2000). NOS terdiri dari tiga bentuk isoform yang dibedakan atas pola ekspresi dan
kebutuhan kalsium yaitu : neural nitric oxide synthase (nNOS), endothelial nitric
oxid synthase (eNOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS). nNOS dan
eNOS diatur oleh suatu kompleks kalsium/calmodulin, sedangkan iNOS
merupakan suatu enzym Ca2+ independents. Bentuk isoform utama yang
diekspresikan dalam makrofag adalah NOS2, dikenal sebagai iNOS yang
menginduksi ekspresi NO, isoform tersebut mengaktifkan kalsium pada resting
cell dan mengontrol produksi NO, sedangkan ekspresi iNOS diatur oleh kalium
dan sintesis NO makrofag (Kil, et al., 2011; Yannick, et al., 2011; Haanwinckel,
et al., 2011).
26
NOS akan berikatan dengan molekul kofaktor tetrahidrobiopterin dan
dengan bantuan O2, ikatan NOS dan kofaktor ini akan mengubah L-arginin
menjadi sitrulin dan NO. NO mempunyai antimikroba yang penting terhadap
bakteri seperti salmonella. Respon imun Th1 yang didominasi oleh IFN, TNF dan
IL-12 bersama NO merupakan efektor terhadap Salmonella typhimurium. Hasil
autooksidasi NO seperti NO2, N2O3 dan s-nitrosotiol juga akan meningkatkan
potensi sitotoksisitas. Selain reaksi tersebut diatas, sinergi ROI dengan RNI dapat
membentuk spesies antimikroba yang lebih toksik, misalnya NO bereaksi dengan
singlet oxygen membentuk peroksinitri (ONOO-) suatu oksidan yang dapat
merusak lipid, protein dan DNA bakteri. Peroksinitrit ini dapat meningkatkan
daya bunuh makrofag terhadap salmonella (Surati, 2012).
2.3.2 Respon imun adaptif
Respon imun spesifik terdiri dari respon imun seluler (cell-mediated
immunity) dan respon imun humoral. Perbedaan kedua respon imun tersebut
terletak pada molekul yang berperan dalam melawan agen infektif, namun tujuan
utamanya sama yaitu untuk menghilangkan antigen (Benjamini, et al., 2000).
Respon imun seluler diperlukan untuk melawan mikroba yang berada di dalam sel
(intraseluler) seperti virus dan bakteri. Respon ini dimediasi oleh limfosit T (sel
T) dan berperan mendukung penghancuran mikroba yang berada di dalam fagosit
dan membunuh sel yang terinfeksi. Beberapa sel T juga berkontribusi dalam
eradikasi mikroba ekstraseluler dengan merekrut leukosit yang menghancurkan
patogen dan membantu sel B membuat antibodi yang efektif (Abbas et al., 2016).
Agen infektif yang berada di luar sel dapat dilawan dengan respon imun
humoral. Respon ini dimediasi oleh serum antibodi, suatu protein yang
27
disekresikan oleh sel B (Benjamini, et al., 2000). Sel B berdiferensiasi menjadi
satu klon sel plasma yang memproduksi dan melepaskan antibodi spesifik ke
dalam darah serta membentuk klon sel B memori. Sel B menghasilkan antibodi
yang spesifik untuk antigen tertentu. Antibodi ini berikatan dengan antigen
membentuk suatu kompleks antigen-antibodi yang dapat mengaktivasi
komplemen dan mengakibatkan hancurnya antigen tersebut (Kresno, 1996).
Respon imun humoral ada dalam darah dan cairan sekresi seperti mukosa,
saliva, air mata dan ASI. Elemen lain yang berperan penting dalam respon imun
humoral adalah sistem komplemen. Sistem komplemen diaktivasi oleh reaksi
antara antigen dan antibodi. Ketika aktif sistem komplemen akan melisiskan sel
target atau meningkatkan kemampuan fagositosis sel fagosit (Benjamini, et al.,
2000). Interaksi respon imun seluler dengan humoral disebut antibody dependent
cell mediated cytotoxicity (ADCC) karena sitolisis baru terjadi bila dibantu
antibodi. Dalam hal ini antibodi berfungsi melapisi antigen sasaran sehingga sel
NK dapat melekat pada sel atau antigen sasaran dan menghancurkannya (Kresno,
1996).
2.4 Imunomodulator
Modulasi respon sistem imun diperlukan dalam pengelolaan dan
perawatan penyakit tertentu. immunommodulasi adalah proses modifikasi respon
imun dengan pemberian obat atau senyawa. Imunomodulator adalah zat yang
digunakan untuk memodulasi komponen sistem kekebalan tubuh, termasuk respon
imun bawaan dan adaptif dan menjaga mereka dalam kondisi yang sangat siap
dalam ancaman yang datang. Mereka merangsang atau menekan sistem imun
28
tubuh menjadi kondisi yang seimbang, sehingga respons imun meningkat. Dalam
keadaan sangat siap, patogen dan antigen lainnya yang masuk ke tubuh tidak
memiliki waktu untuk membangun kekuatan sebelum sistem imun menyerang
antigen. Banyak zat biologis atau sintetis telah diidentifikasi sebagai agen yang
dapat merangsang, menekan atau memodulasi sistem kekebalan tubuh termasuk
respon imun adaptif dan bawaan seperti interferon-γ, steroid, sitokinin, dan
interleukin. Secara klinis imunomodulator dapat dikelompokkan menjadi tiga
kategori berikut (Saroj, et al., 2012).
2.4.1 Imunostimulasi
Imunostimulasi disebut juga imunopotensiasi adalah cara memperbaiki
fungsi sistem imun dengan menggunakan bahan yang merangsang sistem tersebut.
Pada individu sehat, imunostimulan diharapkan dapat berfungsi sebagai agen
profilaksis dan promotor seperti imunopotensioterapi dengan meningkatkan
tingkat respons imun dasar, dan pada individu dengan penurunan respon imun
sebagai agen imunoterapi (Saroj, et al., 2012). Imunostimulan agen yang
meningkatkan atau merangsang sistem kekebalan tubuh digunakan dalam
penyakit imunodefisiensi (Ilyas, et al., 2016).
2.4.2 Imunosupresi
Merupakan suatu tindakan untuk menekan respons imun. Kegunaannya di
klinik terutama pada transplantasi untuk mencegah reaksi penolakan dan pada
berbagai penyakit inflamasi yang menimbulkan kerusakan atau gejala sistemik,
seperti autoimun atau autoinflamasi (Wiedosari, 2007; Ilyas, et al., 2016).
29
2.4.3 Imunoadjuvant
Agen ini digunakan untuk meningkatkan khasiat vaksin dan oleh karena
itu dapat dianggap sebagai stimulan kekebalan spesifik, misalnya, Freund's
penggunaan ajuvan dalam vaksinasi bacillus calemette guérin (BCG) (Ilyas, et al.,
2016).
2.5 Metode uji aktivitas imunomodulator
Berbagai metode telah dilakukan untuk pengujian aktivitas
imunomodulator baik secara in vitro maupun secara in vivo yang dilakukan
terhadap berbagai bahan alam terlampir dalam Tabel. 2.2
Tabel. 2.2 Uji aktivitas imunomodulator dari berbagai bahan alam
Sampel
Refe
NO dan Hasil Pengujian
rensi
Metode
1 -Panax Dalam penelitian ini, 4 fraksi polisakarida yang ditetapkan Zhe
ginseng sebagai RGP1, RGP2, RGP3, dan RGP4 diisolasi dari ng,
C.A. ginseng merah dengan kromatografi selulosa DEAE-52, dan et
Meyer menyelidiki aktivitas imunomodulator pada sel makrofag. al.,
Hasil ini memberikan bukti bahwa fraksi polisakarida netral 2017
- In vitro RGP1 dan RGP2 memiliki aktivitas imunomodulator yang
signifikan dan dapat dieksplorasi sebagai agen
imunomodulasi alami yang menjanjikan yang digunakan
dalam makanan fungsional atau obat-obatan.
2 -Gynura Semua sampel menghambat respon imun alami yang diuji Yua
segetum kecuali ekspresi CD 18 pada permukaan leukosit. Sampel, n
8,8 '- (ethene-1,2-diyl)–dinaphtalene-1,4,5-triol menujukkan dani,
-In vitro penghambatan yang kuat pada kemotaksis, fagositosis, ROS et
dan pelepasan NO. Senyawa ini menujukkan penghambatan al.,
yang sangat kuat terhadap aktivitas ROS dan kemotaksis 2017
dengan nilai IC50 lebih rendah daripada kontrol positif,
aspirin dan ibuprofen. 4,5,4'-Trihydroxy chalcone menun-
jukkan aktivitas immunosupresif terkuat pada percambahan
limfosit (nilai IC50 1.52 μM) dan pada pelepasan IL-1β (nilai
IC50 6.69 μM). Sementara itu rutin adalah sampel paling ku-
at terhadap pelepasan TNF-α dari monosit (IC50, 16.96 μM).
3 -Annona Bahan aktif dalam ekstrak daun Graviola (GE) telah dikenal Kim,
muricata sebagai kaempferol-3-O-rutinoside dan quercetin-3-O- et
30
(Graviol rutinoside oleh LC-MS / MS. Apabila diuji dengan steam al.,
a) atau 50% etanol GE, morfologi sel telah diubah pada 2016
permulaan diferensiasi sel. Walaupun daya tahan sel tidak
-In vitro diubah oleh GE steam, ia direduksi oleh GE etanol. Kedua-
dua steam dan GE etanol mendorong ekspresi transkripasi
sitokin, termasuk TNF-α dan interleukin-1β tetapi hanya
ekstrak steam yang dapat di upregulasi oleh nitric oxide
synthase (iNOS). Dalam konsisten dengan ekspresi mRNA,
pengeluaran TNF-α dan nitrite dinaikkan oleh kedua ekstrak
steam dan ekstrak etanol daun Graviola. Ini disebabkan oleh
pengaktifan saluran signal kinase protein (MAP) diaktifkan
mitogen. Hasil ini menunjukkan bahwa daun Graviola
meningkatkan imunitas dengan mengaktifkan jalur kinase
MAP. Sifat bioaktif Graviola ini menunjukkan potensinya
sebagai ramuan kesehatan untuk meningkatkan sistem imun.
4 -Dryop Efek senyawa kaempferol 3-a-L- (4-O-acetyl) rhamno Chi,
teris pyranoside-7-a-rhamnopyranoside (SA) yang diisolasi dari et
crassirhi Dryopteris crassirhizoma terhadap ekspresi gen terkait keke- al.,
zoma balan pada Ctenophary ngodon idella head kidney macro- 2016
phages (CIHKM) ). Ekspresi gen terkait kekebalan (IL-1�,
-In vitro, TNF-�, MyD88, dan Mx1) diselidiki menggunakan PCR
In vivo realtime. Gen IL-1� menunjukkan ekspresi yang signifikan
pada 2 dan 8 jam setelah paparan 1-10 �gmL-1 SA. SA juga
menginduksi ekspresi gen dari sitokin seperti MyD88, Mx1,
dan TNF-�. Selanjutnya, parameter kekebalan diting-katkan
dalam ikan mas rumput mengkonfirmasi aktivitas imuno-
modulator SA. Senyawa ini tidak memiliki efek toksik pada
sel CIHKM yang diuji dengan tes MTT. Selain itu, ikan
yang diimunisasi dengan 10 �gmL-1 dari SA menunjukkan
resistensi maksimum terhadap infeksi Aeromonas hydro-
phila. Hasil ini menunjukkan bahwa SA memiliki potensi
untuk merangsang respon imun pada ikan mas rumput.
5 -Penggu Analisis respon imun selular dengan mengukur pengeluaran Mart
naan IFN-γ oleh ELISPOT, respon imun humoral dgn mengukur inez,
kodon jumlah IgG dan IgG2a / IgG1 nisbah oleh ELISA, dan profil et
vaksin sitokin TH1 dan TH2 oleh ELISA, dalam tikus yang diimu- al.,
virus nisasi formulasi vaksin. Formulasi vaksin yang diusulkan 2015
A27L meningkat kan produksi vaksin-mediated IFN-γ pada limpa
tikus, dan meningkatkan kekebalan humoral dengan respon
-In vivo bias TH1. Juga, vaksin kami menginduksi lingkungan
sitokin TH1, yang penting melawan infeksi virus. Hasil ini
mendukung upaya untuk menemukan mekanisme baru untuk
meningkatkan respon imun terhadap cacar, melalui
penerapan platform vaksinasi DNA bebas virus yang aman.
6 -Picria Ekstrak etanol daun poguntano memiliki aktivitas Dali
fel-terrae imunomodulator yang telah dilakukan pengujian mun
menggunakan metode Delayed Type Hypersensitivity the,
-In vivo Response (DTH) dengan membandingkan derajat et
31
pembengkakan (inflamasi) kelompok hewan perlakuan al.,
2011
7 -Morus Potensi immunoenhancing dari ekstrak air dari Mori folium Kwo
alba (WEMF) pada makrofag murine RAW 264.7. WEMF secara n, et
signifikan merangsang produksi NO dan PGE 2 sebagai al.,
-In vitro parameter respon imun pada konsentrasi non sitotoksik, yang 2016
dikaitkan dengan peningkatan ekspresi NO synthase dan
COX-2 yang dapat diinduksi. Pelepasan dan ekspresi sitokin,
seperti TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-10, juga meningkat
secara signifikan sebagai tanggapan terhadap pengobatan
dengan WEMF. Selain itu, WEMF mempromosikan
diferensiasi makrofag sel RAW264.7 dan aktivitas
fagositosis yang dihasilkan. WEMF memiliki potensi untuk
memodulasi fungsi kekebalan tubuh dengan mengatur
parameter imunologi.
Metode yang dilakukan secara in vitro antara lain:
a. MTT assay
Metode MTT adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif.
Uji sitotoksisitas dengan metode MTT didasarkan pada aktivitas enzim yang dapat
diukur secara kolorimetri. Metode ini cepat, sensitif, akurat dan sejumlah besar
sampel dapat diuji secara otomatis menggunakan spektrofotometer. Metode ini
mengukur sel yang hidup (baik yang masih membelah ataupun tidak membelah)
(Freshney, 2000). Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri)
yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi
produk berwarna. Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat
pada kerja enzim dehydrogenase. MTT akan direduksi menjadi formazan oleh
sistem reduktase suksinat tetrazolium yang termasuk dalam mitokondria dari sel
hidup (Cree, 2011).
b. Pereaksi Griess
Reaksi Griess pertama kali dideskripsikan pada tahun 1879 karena
kemudahannya reaksi Griess telah digunakan secara luas pada analisa sampel
32
biologis seperti plasma, serum, urin, cairan serebrospinal dan saliva. Pada metode
ini, nitrit ditambahkan dengan reagen pendiazotasi seperti sulfanilamid dalam
media asam untuk membentuk garam diazonium sementara. Hasil antara ini
kemudian direaksikan dengan reagen pengkopel, N-naftil-etilendiamin (NED),
untuk membentuk senyawa azo yang stabil. Warna ungu yang dihasilkan
memungkinkan untuk analisa nitrit dengan tingkat sensitivitas yang tinggi (Sun, et
al., 2003).
c. Metode RT-PCR
Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah
suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen
nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Salah satu metode PCR yaitu Reverse
Transcriptase-PCR. Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap
molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di
dalam sel. Hal ini karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA
sebagai cetakan maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse
transcription) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA
(complementary DNA). Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai
cetakan dalam proses PCR. Teknik ini digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen,
untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan cloning dan analisis, maupun untuk
diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik (Yuwono, 2006).
d. Imunoelektroforesis
Metode ini sering digunakan sebagai pengganti Ouchterlony Double
Diffusion untuk mendapatkan presipitasi yang murni pada komplek campuran
antigen. Proses ini pertama antigen dielektroforesis melalui gel agrose dan
33
selanjutnya diberikan kesempatan difusi menuju kedepan pada antiserum untuk
membentuk band presipitasi karena sampel terpisahkan dengan elektroforesis
sebelum berikatan dengan antibodi. Beberapa antigen dapat mengidentifikasi
antiserum polispesifik yang digunakan. Oleh karena itu imunoelektroforesis
sering digunakan untuk pengidentifikasian secara tentatif dari antigen campuran
yang tidak diketahui pada saat purifikasi (Rantam, 2003).
2.6 Kultur Sel
Teknik kultur sel adalah salah satu teknik yang digunakan untuk
mengembangbiakkan sel diluar tubuh atau dikenal sebagai salah satu teknik in
vitro. Pada teknik kultur, spesifisitas sel harus diperhatikan karena pada awalnya
didalam tubuh, sel-sel bekerja secara integritas dalam suatu jaringan, sedangkan
dalam kultur, sel terpisah-pisah. Selain itu, teknik ini harus dilakukan dalam
kondisi steril karena sel tumbuh lebih lambat dari pada kontaminan (Freshney,
2000). Fungsi utama media pada teknik kultur sel adalah untuk mempertahankan
pH dan osmolalitas essensial untuk viabilitas sel serta penyedia nutrisi dan energi
yang dibutuhkan untuk multiplikasi dan pertumbuhan sel. Media untuk
pertumbuhan sel harus mengandung asam amino, vitamin, glukosa, garam,
berbagai suplemen organik seperti protein, peptida, nukleosida dan lipid serta
hormon dan faktor pertumbuhan. Kultur sel secara in vitro membutuhkan kondisi
lingkungan yang sama dengan keadaan di dalam tubuh. Kondisi tersebut akan
mempengaruhi proses biologis yang terjadi dalam kultur sel, sehingga dapat
berlangsung mendekati keadaan sebenarnya. Pendekatan terhadap kondisi
lingkungan tubuh tersebut diperoleh dengan aplikasi media pertumbuhan, pH serta
34
fase gas yang sesuai untuk pertumbuhan sel. Pengamatan terhadap proses
pertumbuhan sel secara in vitro memiliki beberapa kelebihan dibanding metode in
vivo antara lain; keadaan lingkungan pertumbuhan dapat stabil karena diamati
secara langsung, selain itu karakteristik dari sel yang ingin ditumbuhkan dapat
diatur (Harison and Freshney, 1997).
2.7 Sel RAW 264.7
Sel RAW 264.7 merupakan suatu monocyte-machrophage cell line yang
banyak digunakan dalam penelitian tentang sistem imun karena mirip dengan
makrofag yang diproduksi sumsum tulang belakang (Bergaus, et al., 2009).
Makrofag memiliki peranan penting dalam sistem imun, makrofag terutama
berasal dari sel prekursor sumsum tulang belakang, dari promonosit yang
membelah menghasilkan monosit yang beredar dalam darah. Makrofag juga
menelan (fagosit) antigen dan menyajikan kepada sel-sel berdekatan secara
imunokompeten (limfosit dan sel plasma) (Kresno 2000).
Sel RAW 264.7 berasal dari Mus musculus, mencit atau yang diinduksi
oleh virus leukemia murine Abelson. Strain sel RAW 264.7 adalah BALB/c.
Metode kultur sel RAW 264.7 menggunakan media pertumbuhan lengkap sebagai
media dasar untuk sel ini adalah ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's
Medium, Catalog No. 30-2002. Untuk membuat media pertumbuhan yang
lengkap, tambahkan komponen berikut ke medium dasar: bovin serum sampai
kosentrasi akhir 10%, kemudian subkultur disiapkan dengan cara dikorek. Untuk
labu 75 cm2, bersihkan semua kecuali media kultur 10 mL (perhatikan jumlah
yang sesuai untuk bejana kultur lainnya). Corning®T-75 flask (catalog#430.641)
35
direkomendasikan untuk subkultur produk ini. Lepaskan sel dari substrat flask
dengan penggerak sel; aspirasi dan tambahkan aliquot yang sesuai dari suspensi
sel ke dalam bejana kultur baru. Rasio subkultur yang direkomendasikan 1:3
hingga 1:6. Medium renewal: ganti atau tambah media setiap 2 sampai 3 hari
(ATCC, 2017).
2.8 Uraian Tumbuhan
Uraian tumbuhan meliputi sistematika tumbuhan, nama daerah, nama
asing, morfologi tumbuhan dan khasiat tumbuhan.
2.8.1 Sistematika tumbuhan
Sistematika tumbuhan poguntano menurut LIPI (2016), adalah sebagai
berikut:
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Ordo : Lamiales
Famili : Linderniaceae
Genus : Picria
Spesies : Picria fel-terrae
Sinonim : Curanga amara Vahl., Curanga amara Juss., Curania amara
R&S., Gratiola amara Roxb., Picria fel-terrae Lour., dan
Torenia cardiosepala Benth (Anonim, 2014).
36
2.8.2 Nama daerah
Nama daerah dari tumbuhan ini adalah poguntano, pugun tana, pogon
tanoh (Dairi), tamah daun kukurang, raheut (Sunda), daun kukurang (Maluku) dan
papaita (Ternate) (Anonim, 2015).
2.8.3 Nama asing
Nama asing dari tumbuhan ini Kong saden, Pu:n (Laos), Hempedu tanah,
Gelumak susu, Rumput kerak nasi (Malaysia), M[aaj]t d[aas]t, Thanh (Vietnam),
Sagai-uak (Filiphina) (Anonim, 2015).
2.8.4 Morfologi tumbuhan
Poguntano merupakan herba tahunan, tinggi sekitar ±40 cm, batang
dengan cabang yang jarang, tegak, segiempat, berakar, berbulu halus yang padat.
Daun tunggal berhadapan, bundar telur, pangkal daun membaji sampai
membundar, ujung daun agak melancip, tepi daun beringgitan, berbulu halus.
Pembungaan berupa tandan di ujung atau di batang, jumlah bunga 2-16, daun
gagang kecil, melanset, mahkota bunga bentuk tabung, berbibir rangkap, gundul
bagian luar, bagian dalam ada kelenjar bulu, bibir atas berwarna coklat kemerah-
merahan, bibir bagian bawah berwarna putih. Buah kapsul lonjong, padat,
berkatup dua, dengan beberapa biji. Biji membulat, diameter sekitar 0,6 mm
(Anonim, 2015).
2.8.5 Khasiat tumbuhan
Tumbuhan Poguntano (Picria fel-terrae Lour) telah dilakukan berbagai
penyelidikan farmakologis modern, diantaranya menunjukkan bahwa ekstrak
Picria fel-terrae Lour berperan sebagai diuretik, antipiretik, hepatoprotektif,
kardioprotektif, antidiabetes, antikanker, antidiabetes, antioksidan, antiinflamasi,
37
anthelmintik dan analgesik serta memiliki aktivitas imunomodulator (Dalimunthe,
et al., 2015; Huang, et al., 1994; Dalimunthe, et al., 2011; Thuan, et al., 2007;
Zou, et al., 2005; Harfina, et al., 2012; Sitorus, et al., 2014;. Sihotang, et al., 2016;
Patilaya dan Husori 2015). Selain itu, Picria fel-terrae menghambat hepatitis B
(HB) e-antigen diekskresikan oleh cell line HepG2 2215 menimbulkan aktivitas
antivirus HB (Zeng, et al., 2010). Picria fel-terrae Lour bisa dikembangkan
sebagai kokemoterapi regimen untuk kanker payudara dengan menginduksi
apoptosis dan menghambat siklus sel dan menekan ekspresi cyclin D1 dan BCl-2
(Satria, et al., 2015; Lestari, et al., 2013) dan studi terbaru ekstrak etilasetat herba
poguntano memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi dan aktivitas antiproliferatif
(Satria, et al., 2017).
2.9 Simplisia
Simplisia adalah bahan alamiah yang digunakan sebagai obat yang belum
mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan
alam yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan atas simplisia nabati, simplisia
hewani dan simplisia mineral (Depkes, 1979). Simplisia tumbuhan obat
merupakan bahan baku proses pembuatan ekstrak, baik sebagai bahan obat atau
sebagai produk. Ekstrak tumbuhan obat dapat berfungsi sebagai bahan baku obat
tradisional atau sebagai produk yang dibuat dari simplisia (Depkes, 2000).
Pembuatan serbuk simplisia merupakan proses awal pembuatan ekstrak.
Serbuk simplisia dibuat dari simplisia utuh atau potongan-potongan halus
simplisia yang sudah dikeringkan melalui proses pembuatan serbuk dengan suatu
alat tanpa menyebabkan kerusakan atau kehilangan kandungan kimia yang
38
dibutuhkan dan diayak hingga diperoleh serbuk dengan derajat kehalusan tertentu.
Derajat kehalusan serbuk simplisia terdiri dari serbuk sangat kasar, kasar, agak
kasar, halus dan sangat halus. Kecuali dinyatakan lain, derajat kehalusan serbuk
simplisia untuk pembuatan ekstrak merupakan serbuk simplisia harus seperti
tertera pada pengayak dan derajat halus serbuk (Depkes, 2013).
2.10 Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu cara menarik kandungan senyawa kimia dari
simplisia nabati atau hewani dengan pelarut yang sesuai sehingga terpisah dari
bahan yang tidak dapat larut, sebelum ekstraksi dilakukan biasanya bahan-bahan
dikeringkan terlebih dahulu kemudian dihaluskan pada derajat kehalusan tertentu
(Harborne, 1987). Ekstraksi adalah proses penarikan kandungan kimia yang dapat
larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dalam pelarut. Simplisia yang
diekstraksi mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak
dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain (Depkes, 2000).
Menurut Depkes RI (2000), Beberapa metode ekstraksi yang sering
digunakan dalam berbagai penelitian antara lain :
2.10.1 Cara dingin
Ekstraksi dengan menggunakan pelarut terdiri dari 2 cara yaitu:
a. Maserasi
Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan
pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur
ruangan (kamar) sedangkan remaserasi merupakan pengulangan penambahan
pelarut setelah dilakukan pengeringan maserat pertama (Depkes, 2000).
39
Maserasi dapat dilakukan dengan cara menurut Farmakope Herbal
Indonesia Suplemen III (2013) yaitu satu bagian serbuk kering simplisia
dimasukkan ke dalam maserator, tambahkan 10 bagian pelarut. Rendam selama 6
jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian diamkan selama 18 jam.
Pisahkan maserat dengan cara pengendapan, sentrifugasi, dekantasi atau filtrasi.
Ulangi proses penyarian sekurang-kurangnya dua kali dengan jenis dan jumlah
pelarut yang sama. Kumpulkan semua maserat, kemudian uapkan dengan penguap
vakum atau penguap tekanan rendah hingga diperoleh ekstrak kental. Hitung
rendemen yang diperoleh yaitu persentase bobot (b/b) antara rendemen dengan
bobot serbuk simplisia yang digunakan dengan penimbangan. Rendemen harus
mencapai angka sekurang-kurangnya sebagaimana ditetapkan pada masing-
masing monografi ekstrak (Depkes, 2013).
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu baru
sampai terjadi penyarian sempurna yang pada umumnya dilakukan pada suhu
kamar. Proses perkolasi terdiri dari tahapan penyiapan bahan, tahap perendaman
antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) terus
menerus sampai diperoleh perkolat. Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu
bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari
dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan
melarutkan zat aktif dari sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh.
Gerak ke bawah disebabkan oleh adanya kekuatan gaya beratnya sendiri dan
cairan di atasnya, dikurangi dengan gaya kapiler yang cenderung untuk menahan.
40
Untuk menentukan akhir perkolasi, dilakukan pemeriksaan zat aktif secara
kualitatif pada perkolat terakhir (Depkes, 2000).
2.10.2 Cara Panas
a. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,
selama waktu tertentu dengan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan
adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu
pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.
b. Digesti
Digesti adalah ekstraksi dengan pengadukkan pada temperatur yang lebih
tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-
500C.
c. Sokletasi
Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru,
dilakukan dengan menggunakan alat soklet sehingga terjadi ekstraksi dengan
jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
d. Infundasi
Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas
air, temperatur 900C selama 15 menit, hasilnya disebut infus.
e. Dekoktasi.
Dekoktasi adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut
air pada temperatur sampai titik didih air, yakni 30 menit pada suhu 90-1000C
(Depkes, 2000).
41
2.11 Kerangka Teori Penelitian
Berdasarkan teori yang telah dipaparkan pada tinjauan pustaka maka dapat
disusun kerangka teori penelitian yang menjelaskan bahwa dengan pemberian
LPS terhadap sel makrofag akan mengalami aktivasi sehingga menghasilkan
makrofag teraktivasi. Makrofag yang teraktivasi akan melepaskan beberapa
mediator inflamasi yaitu TNF-α, IL-1β, IL-6 yang dapat merangsang terjadinya
inflamasi. Makrofag yang teraktivasi juga mengalami proses fagositosis untuk
membunuh mikroba dengan menghasilkan ROS dan RNS. ROS akan merangsang
mediator inflamasi dalam terjadinya inflamasi. RNS yang dihasilkan yaitu NO
yang disintesis oleh iNOS. NO yang dihasilkan secara berlebihan akan mengalami
inflamasi. Hal ini secara keseluruhan merupakan respon imun alami tubuh
terhadap antigen tetapi jika aktivasi berlebihan maka akan terjadi gangguan sistem
imun. Dengan demikian pemberian ekstrak herba poguntano yang mengandung
zat aktif apigenin, luteolin dan β-sitosterol didalam ekstrak tersebut sehingga
dapat menghambat ekspresi TNF-α, IL-1β, IL-6 dan iNOS dan dapat menurunkan
produksi NO. Hal ini dapat digambarkan pada Gambar. 2.3.
42
Rebusan daun sungkai Pengembangan Produk
(Peronema canescens) Farmakoterapi COVID-19
Flavonoid, Steroid,
Terpenoid, Saponin,
Tanin, dan Fenolik
Leukosit dan
Immunomodulator Sel Fagosit
(Neutrofil, Makrofag)
Makrofag
teraktivasi
Mediator Proses
Inflamasi Fagositosis
IL-1β IL-6 TNF-α
Membunuh
SarsCoV-2
Inflamasi
IL-6 : Interleukin 6 : Menghambat aktivitas

IL-1β : Interleukin 1 beta berlebihan
TNF-α : Tumor Necrosis Factor alpha : Mengaktivasi/ Merangsang
: tidak diteliti : Melepaskan/ Menghasilkan
: diteliti
Gambar. 2.3 Kerangka teori penelitian
43
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental untuk mengetahui aktivitas
imunomodulator ekstrak herba poguntano secara in vitro terhadap sel RAW 264.7.
Tahap penelitian meliputi pengumpulan dan pembuatan simplisia dan ekstrak,
pembuatan ekstrak n-heksana (ENHP), etilasetat (EEAHP) dan ekstrak etanol
herba poguntano (EEHP) dilakukan di laboratorium Farmakognosi, Fakultas
Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Analisis viabilitas sel, kadar NO
dan penentuan ekspresi iNOS, TNF-α, IL-1β dan IL-6 yang dilakukan di
Laboratorium Parasitologi dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat laboratorium,
autoclave (Hirayama), blender (Philips), chamber (Camag), conical tube (Thermo
Scientific), elektroforesis (BioRad), falcon tube, (Thermo Scientific), Gel Doc
(Syngene), inkubator CO2 (Heraceus), Laminar Air Flow (Labconco), microscope
inverted (Olympus), microplate reader (Bio Rad), mikropipet (Eppendorf),
microwave (Panasonic), nanovue plus (fisher scientific), neubauer hemocytometer
(Hausser Scientific), neraca listrik (Vibra AJ), oven (Memmert), penangas air
(Yenaco), PCR (ProFlex, Applied Biosystems), sentrifugator (Eppendorf), rotary
evaporator (Stuart), vortex (IKA), 6-well plate (Iwaki), 96-wells plate (Iwaki).
44
3.1.2 Bahan-bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah herba poguntano. Bahan
kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis,
yaitu klorofom, methanol, asam asetat, asam sulfat, n-butanol, FeCl3 sedangkan n-
heksana, etilasetat dan etanol 96% (teknis). Sel RAW 264.7 yang merupakan
koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, media penumbuh
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Biowest), Fetal Bovine Serum
(FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisilin-streptomisin 2% (v/v) (Gibco), Fungizone
(Amphotericin B) (Sigma), Hepes, NaHCO3 HCl, NaOH, NaNO3 (Sigma).
Aquabides steril, Pereaksi Griess (Sigma), Deksametason (Harsen), 0,25%
Tripsin-EDTA (Gibco), Lipopolisakarida (Sigma), MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-
il)-2,5difeniltetrazolium bromida] (Sigma), phosfat buffer saline (PBS) (Irvine
Scientific), natrium dodesil sulfat (SDS) dalam HCl 0,1 N, Total RNa kit
(Geneaid), Rever Tra-Ace (Toyobo), wash buffer, DNase, RNase bebas air, primer
iNOS, primer IL-6, primer TNF-α, primer IL-1β, GoTaq®Green Master Mix
(Promega), TBE (Vivantis), agarosa (Promega), FluoroVue (Smobio), DNA
ladder 100 bp (Smobio), plat lapis silica gel 60 F254 (Merck).
3.2 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan,
pembuatan simplisia dan ekstrak herba poguntano (Picria fel-terrae Lour.).
3.2.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang
45
digunakan adalah herba Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) yang diambil dari
daerah Desa Tiga Lingga, Kabupaten Dairi, Provinsi Sumatera Utara.
3.2.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan telah dilakukan pada Pusat Penelitian Biologi,
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor.
3.2.3 Pembuatan simplisia herba poguntano
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah herba poguntano yang
telah dikumpulkan dan dicuci bersih dengan air mengalir, kemudian ditiriskan lalu
disebarkan diatas kertas dibiarkan hingga airnya terserap, setelah itu bahan
ditimbang dan dipotong-potong. Kemudian bahan dikeringkan dengan cara
dimasukkan dalam lemari pengering. Berat dari bahan yang kering ditimbang.
Selanjutnya disimpan dalam kantung plastik kedap udara ditempat yang
terlindung dari sinar matahari (Depkes, 1985).
3.2.4 Pembuatan ekstrak herba poguntano
Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi bertingkat, yaitu serbuk
simplisia dengan perbandingan tertentu direndam dengan cairan penyari berturut-
turut n-heksana, etilasetat dan etanol 96%. Serbuk simplisia dimaserasi dengan
pelarut n-heksana sebanyak tiga kali, kemudian serbuk yang sama dimaserasi lagi
dengan pelarut etilasetat sebanyak tiga kali dan terakhir serbuk tersebut
dimaserasi kembali dengan pelarut etanol 96% sebanyak tiga kali.
Masukkan 500 g serbuk kering simplisia ke dalam wadah maserasi,
ditambahkan 5 L pelarut, lalu direndam selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali
diaduk, kemudian didiamkan selama 18 jam. Maserat dipisahkan dengan cara
dienaptuangkan dan disaring. Proses penyarian dilakukan sebanyak 3 kali dengan
46
jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan kemudian
diuapkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh diperoleh ekstrak kental
(Depkes, 2013).
3.2.5 Pemeriksaan skrining fitokimia
Pemeriksaan skrining fitokimia pada ekstrak n-heksana, etilasetat, etanol
herba poguntano dilakukan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Sebanyak 100 mg ekstrak dilarutkan dalam 1 ml masing-masing pelarut ekstrak
tersebut kemudian ditotolkan pada fase diam. Fase diam yang digunakan yaitu
plat yang dilapisi dengan silika gel 60 F254 (Merck, Germany) berukuran 10x5 cm.
Selanjutnya plat dimasukkan kedalam chamber yang telah jenuh dengan uap fase
gerak. Fase gerak yang digunakan sesuai dengan pemeriksaan yang dilakukan.
Setelah pengembangan selesai plat dikeluarkan dan dikeringkan, lalu plat
disemprotkan dengan penampak bercak dan dipanaskan dalam oven pada suhu
110oC selama 5 menit lalu diamati perubahan warna yang terjadi.
a. Identifikasi Senyawa Alkaloid
Fase gerak kloroform-metanol-amonia (85:15:1), dengan penampak noda
Pereaksi Dragendorff. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya noda
berwarna jingga (Wagner and Bladt, 1996).
b. Identifikasi Senyawa Flavonoid
Fase gerak etilasetat-metanol-air (100:13,5:10), dengan penampak noda
pereaksi AlCl3 10%. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya noda
berwarna orange kekuningan atau kuning kehijauan (Wagner and Bladt, 1996).
47
c. Identifikasi Senyawa Saponin
Fase gerak kloroform-asamasetat-metanol-air (11:6:2:1), dengan
penampak noda campuran pereaksi Metanol:asamsulfat:vanillin. Reaksi positif
ditunjukkan dengan terbentuknya noda berwarna kuning kecoklatan (Wagner and
Bladt, 1996).
d. Identifikasi Senyawa Tanin
Fase gerak kloroform-etilasetat-n-butanol-air (5:2:2:1), dengan penampak
noda Pereaksi FeCl3 10 %. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya noda
berwarna hijau kehitaman (Depkes, 2013).
e. Identifikasi Senyawa Glikosida
Fase gerak etilasetat-metanol-air (16:2:2), dengan penampak noda
Pereaksi asam sulfat 50%. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya noda
berwarna coklat/biru (Wagner and Bladt, 1996).
f. Identifikasi Senyawa Steroid/Triterpenoid
Fase gerak yang digunakan adalah n-heksan-etilasetat (8:2), dengan
penampak noda pereaksi Liberman-Buchard disertai dengan pemanasan pada suhu
105oC selama 5 menit. Reaksi positif steroid ditunjukkan dengan adanya noda
berwarna merah keunguan (Wagner and Bladt, 1996).
3.3 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas ini, disterilkan terlebih dahulu
sebelum dipakai sehingga terhindar dari berbagai kontaminasi pengujian. Alat-alat
gelas dan plastik yang akan digunakan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu
121oC selama 15 menit (Lay, 1994).
48
3.4 Pembuatan Media
Pembuatan media yang dilakukan dalam penelitian ini yaitu pembuatan
media pertumbuhan dan media kultur lengkap.
3.4.1 Pembuatan Media Pertumbuhan.
Komposisi : DMEM sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L-

glutamine tanpa NaHCO3, netto 10,4 gram.
Hepes 2g
NaHCO3 2g
HCl 1 N secukupnya
NaOH 1 N secukupnya
Aquabides steril ad 1 L
Cara pembuatan :
Sebanyak 1 sachet DMEM, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO 3
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabides steril,
homogenkan dengan menggunakan stirer magnet. Kemudian pH diukur dengan
pH meter (pH yang diinginkan adalah 7,2-7,4); untuk menyesuaikan pH dapat
digunakan HCl 1 N (bila larutan terlalu basa) atau NaOH 1 N (bila larutan terlalu
asam), tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan sterilisasi dengan filter
vaccum didalam LAF (Laminar Air Flow), dipasang filter aparatus steril pada
botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media
ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media (nama
media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat), dan disimpan pada
suhu 2-8ºC (Sambrook, et al., 1989).
3.4.2 Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK)
Komposisi : Fetal Bovine Serum (FBS) 10%

Penisilin-streptomisin 2%
Fungizone (Amphotericin B) 0,5%
DMEM ad 100 mL
49
Cara pembuatan :
Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF (Laminar Air
Flow), beri identitas pada botol MK (nama media, tanggal pembuatan, expire
date, dan nama pembuat), simpan pada suhu 2-8ºC (Sambrook, et al., 1989).
3.5 Penumbuhan Sel.
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 mL
media DMEM pada tabung konikel 15 mL, ambil ampul dari freezer -80ºC atau
tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul,
masukkan tetes demi tetes kedalam media DMEM yang telah disiapkan,
sentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatant dan tambahkan 4 mL
MK DMEM dan resuspensi hingga homogen. Transfer masing-masing 2 mL ke
dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 mL MK ke dalam masing-masing flask
kultur, dan homogenkan. Diamati kondisi sel dengan menggunakan inverted
microscope. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur (tidak
menggerombol pada bagian tertentu). Beri identitas pada flask kultur, kemudian
simpan dalam inkubator CO2 (Doyle, 2000).
3.5.1 Subkultur Sel
Persiapan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan
pengerjaan pada LAF. Proses panen sel dilakukan dengan cara mengambil 500 μL
panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 mL MK,
homogenkan. Diinkubasi sel pada inkubator CO2, diamati kondisi sel pada
keesokan harinya (Doyle, 2000).
50
3.5.2 Panen Sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi
sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80% konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau
pipet Pasteur, cuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS (Phosphate Buffer salin),
tambahkan 300-500 μL Tripsin-EDTA 0,025% secara merata, kemudian inkubasi
di dalam inkubator CO2 selama ± 5 menit, dan tambahkan 4 mL MK untuk
menginaktifkan tripsin. Diresuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-
satu (tidak menggerombol). Diamati keadaan sel pada microscope inverted.
Diresuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol lalu dipindahkan
sel ke dalam tabung konikel (Doyle, 2000).
3.5.3 Perhitungan Sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 μL
panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Hitung jumlah sel dibawah
mikroskop dengan menggunakan counter. Hemositometer terdiri dari 4 kamar
hitung (A, B, C, dan D), setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak (Gambar 3.1).
Gambar 3.1 Hemositometer.
Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap (mati) dan sel
yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas
kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel/mL dengan rumus:
51
∑∑∑∑4
∑=
Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misalnya untuk menanam sel
pada tiap susunan 96-well plate, maka jumlah total sel yang diperlukan adalah
5x103/sumuran X 100 sumuran (dibuat lebih) = 1x105 sel.
Hitung volume panenan sel yang diperlukan (dalam mL) dengan rumus:
Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan
MK sampai total volume yang diperlukan (Doyle, 2000).
3.6 Pembuatan larutan uji
Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 5 mg dalam polytube, kemudian
dilarutkan dalam dimetilsulfoksida (DMSO) sebanyak 100 μL, divortex agar
sampel terlarut sempurna kemudian dicukupkan dengan media kultur MK-DMEM
kemudian di buat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan
konsentrasi 200 μg/mL, 100 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/mL dan 12,5 μg/mL semua
pengenceran dilakukan dengan menggunakan MK-DMEM.
Deksametason 0,5 mg dilarutkan dengan 100 μL DMSO, divortex agar
sampel terlarut sempurna kemudian dicukupkan dengan media kultur MK-DMEM
kemudian di buat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan
konsentrasi 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5 μg/mL dan 1,25 μg/mL semua
pengenceran dilakukan dengan menggunakan MK-DMEM.
52
3.7 Uji viabilitas sel
Sel RAW 264.7 ditumbuhkan dalam media DMEM dengan penisilin,
streptomisin dan fetal bovin serum (FBS). Sel RAW 264.7 (3x103 sel/well)
ditanam dalam 96-well plate dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan
pertumbuhan yang baik. Setelah 24 jam medium diganti dengan yang baru
kemudian ditambahkan larutan uji (EEHP, EEAHP, ENHP) dengan konsentrasi
200; 100; 50; 25; 12,5 μg/mL dan deksametason (20; 10; 5; 2,5; 1,25 μg/mL) dan
diinkubasi pada suhu 37oC dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam. Pada akhir
inkubasi, media dan larutan uji dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS. Pada
masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μl media kultur dan 10 μl MTT 5
mg/ml. Untuk mengamati viabilitasnya sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam
dalam inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen
stopper (SDS 10% dalam HCl 0,1 N), lalu plate dibungkus dengan aluminium foil
agar tidak tembus cahaya pada suhu kamar dan dibiarkan selama satu malam. Sel
yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian
dibaca dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Viabilitas sel
dihitung dengan rumus:
Persentase viabilitas sel yang tidak diobati dihitung 100% (Nugroho, et al., 2013;
Zheng, et al., 2017).
3.8 Uji produksi Nitric Oxide (NO)
Sel RAW 264.7 (3x103 sel/well) ditanam pada 96-well plates dan
diinkubasi selama 24 jam kemudian ditambahkan larutan uji (EEHP, EEAHP,
53
ENHP) dengan konsentrasi 25 dan 12,5 μg/mL dan deksametason (2,5 μg/mL dan
1,25 μg/mL) sebagai kontrol positif, diikuti dengan stimulasi menggunakan LPS
sebagai konrol negatif (1 μg/mL) lalu diinkubasi kembali selama 24 jam dalam
inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC. Jumlah nitrit dalam media kultur diukur
sebagai indikator produksi NO. Jumlah nitrit, metabolit NO yang stabil, diukur
dengan menggunakan pereaksi Griess (0,1% naftil etilen diamin dihidroklorida
dalam asam fosfat 2,5% dan sulfanilamida 1%). Kemudian, 100 μL supernatan
kultur ditambahkan ke 100 μL pereaksi Griess, kemudian diinkubasi selama 10
menit di ruangan yang gelap. Absorbansi diukur pada 595 nm pada microplate
reader. Konsentrasi standar nitrit dihitung dengan menggunakan larutan standar
Natrium nitrit (1000 μM), dibuat pengenceran dengan konsentrasi 100; 50; 25;
12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,78125 μM, lalu direaksikan dengan pereaksi Griess
dan dibaca absorbansinya dengan microplate reader (Yuandani, et al., 2017).
3.9 Pemeriksaan ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6 dan IL-1β
Pemeriksaan ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6 dan IL-1β dilakukan dengan
menggunakan metode RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction). Sel RAW 264.7 (5x105 sel/well) ditanam pada microplate 6 sumuran
dengan jumlah pada tiap sumuran 2 ml kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam
inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC. Media lama dibuang dan diganti dengan
media baru lalu diinduksi dengan LPS (1 μg/mL) dan diinkubasi kembali selama 6
jam kemudian ditambahkan larutan uji (EEHP, EEAHP, ENHP) dengan
konsentrasi 25 μg/mL dan deksametason (2,5 μg/mL) kemudian diinkubasi
kembali selama 24 jam setelah itu media dipindahkan dalam tabung konikel dan
54
ditambahkan dengan PBS, kemudian sel-sel yang mengapung dan melekat
dikumpulkan dengan cara memberikan tripsin 0,025% dan kemudian dipindahkan
kedalam tabung konikel, sel dicuci sebanyak dua kali dengan 1 ml PBS dan
disentrifugasi 2500 rpm selama 5 menit, lapisan paling atas dibuang dan endapan
dikumpulkan dan diresuspensi dalam PBS dan di sentrifugasi 3000 rpm selama 3
menit, buang supernatant dan tambahkan dengan 1 mL PBS kemudian dilanjutkan
dengan ekstraksi RNA.
3.9.1 Ekstraksi RNA
RNA total diisolasi menggunakan kit isolasi RNA (Geneaid). Ekstraksi
RNA dilakukan dengan tahap lisis sel, pencucian dan elusi RNA (Anonim, 2008).
a. Tahap 1 (lisis sel)
Sel RAW 264,7 (5x105 sel/well) yang telah dipanen ditambahkan 400 μl
RB buffer dan 4 μl β-mercaptoethanol lalu sel diresuspensikan kembali. Setelah
itu campuran dihomogenkan, inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit.
Tambahkan 400 μl dengan etanol 70% yang telah disiapkan dalam ddH2O (DNase
RNAse free water). Dikocok kuat hingga campuran homogen. Siapkan kolom RB
tube 2mL, pindahkan 500 μl campuran pada kolom RB. Sentrifuge dengan
kekuatan 14-16.000 rpm selama 1 menit, lalu filtrat dibuang. Pindahkan campuran
yang tersisa pada kolom RB yang sama, sentrifuge dengan kekuatan 14-16.000
rpm selama 1 menit. Buang filtrat dan tempatkan kolom RB pada tube 2 mL yang
baru (Anonim, 2008).
b. Tahap 2 (Pencucian)
Ditambahkan 400 μl WI buffer kedalam kolom RB, sentrifuge dengan
kekuatan 14-16.000 rpm selama 30 detik. Filtrat dibuang, lalu tambahkan 600 μL
55
buffer pencuci (pastikan etanol telah ditambahkan) kedalam kolom RB. Sentrifuge
dengan kekuatan 14-16.000 rpm selama 30 detik, lalu filtrat dibuang. Tempatkan
kembali kolom RB dalam tube 2 mL dan sentrifuge dengan kekuatan 14-16.000
rpm selama 3 menit untuk mengeringkan matriks kolom (Anonim, 2008).
c. Tahap 3 (Elusi RNA)
Ditempatkan kolom RB yang telah kering kedalam tube mikrosentrifuge
1,5 mL yang baru. Tambahkan 50 μl RNase bebas air kedalam bagian tengah
kolom matriks. Diamkan selama 1 menit untuk memastikan RNase bebas air telah
diserap. Kemudian sentrifuge dengan kekuatan 14-16.000 rpm selama 1 menit
untuk mengelusi RNA yang dipurifikasi. Hitung konsentrasi RNA yang dihasilkan
(Anonim, 2008).
3.9.2 Pembuatan cDNA
Total RNA yang dipakai 2000 ng kemudian ditambahkan DNase RNase
free water hingga volume total 12 μL. Sebanyak 8 μL larutan campuran (5x RT-
buffer 4 μL; random primer 1 μL; dNTP 2 μL; Rever Tra-Ace 1 μL) ditambahkan
pada tiap microtube yang berisi RNA, kemudian diresuspensi dan dilakukan PCR
dengan kondisi 300C selama 10 menit, 420C selama 60 menit, dan 990C selama 5
menit. Produk PCR hasil pembuatan cDNA diukur konsentrasi dengan
menggunakan alat Nanodrop (Hadiarto, et al., 2015).
3.9.3 Analisis Ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β dan β-actin
Ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β dan β-actin diperiksa dengan cara
mengambil cDNA 100 ng/μL ditambahkan sampai 25 μL PCR Master Mix
(GoTaq®Green 12,5 μL; primer forward 1 μL; primer reverse 1 μL; DNase RNase
free water 9,5 μL). Primer sebagai berikut :
56
Annealing
Gen Primer Sequens Size (bp)
Temp (°C)
F 5’-CGAAACGCTTCACTTCCAA-3’
iNOS 311 60
R 5’-TGAGCCTATATTGCTGTGGCT-3’
F 5’-CCCTGCAGCTGGAGAGTGTGGA-3’
IL-1β 447 62,5
R 5’-TGTGCTCTGCTTGTGAGGTGCTG-3’
F 5’-TGTGCCGCCGCTGTCTGCTTCACGCT-3’
TNF-α 374 55
R 5’-GATGAGGAAAGACACCTGGCTGTAGA-3’
F 5’-GATGCTACCAAACTGGATATAATC-3’
IL-6 269 55
R 5’-GGTCCTTAGCCACTCCTTCTGTG-3’
F 5’- TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’
β-actin 349 55
R 5’- TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’
PCR terdiri dari 35 siklus amplifikasi dan setiap siklus dilakukan selama
30 detik pada 95°C (denaturasi), 1 menit pada suhu annealing (55°C untuk TNF-
α, IL-6 dan β-actin dan 60°C untuk iNOS) dan 45 detik pada 95°C (denaturasi), 1
menit pada suhu annealing 62,5°C untuk IL-1β.) dan 1 menit pada 72°C
(elongasi) dalam thermal cycler (ProFlexTM 3x32-well PCR System, Applied
Biosystems), β-actin merupakan house keeping gene yang digunakan sebagai
kontrol internal untuk menstandarisasi tingkat ekspresi relatif untuk semua
biomarker. Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis pada agarosa 2% dan
Tris-Borate-EDTA (Vivantis), serta flouroVue (Smobio) sebagai pewarna (Yanti,
et al., 2011; Kim, et al., 2016).
3.9.4 Elektroforesis
Gel agarosa 2% dibuat dengan cara menambahkan 2 gram serbuk agarosa
dengan 100 mL TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5x dalam erlenmeyer, kemudian
dipanaskan dalam microwave selama 3-4 menit dan tambahkan flouroVue 4 μL.
Agarosa dituangkan dalam piringan gel dan didinginkan pada suhu ruangan
selama 30-40 menit. DNA ladder 100 bp sebanyak 5 μL sampel dimasukkan ke
dalam sumuran gel. Elektroforesis dilakukan selama 30-45 menit dengan
kecepatan 70 volt. Pengambilan foto gel hasil elektroforesis dengan menggunakan
57
gel doc. Gambaran band kemudian diukur menggunakan analisis densitometry
dengan software Gel Doc (Amanda dan Cartealy, 2015).
3.10 Analisis data
Semua data dianalisis dengan menggunakan Statistical Package for Social
Sciences (SPSS) versi 22.0. Data disajikan sebagai mean ± standard error means
(SEM). Analisis varians satu arah (ANOVA) untuk beberapa perbandingan
digunakan untuk analisis data P<0,05 dianggap berbeda secara signifikan.
58
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identifikasi tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang
Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor menyebutkan bahwa tumbuhan yang
digunakan adalah tumbuhan poguntano (Picria fel-terrae Lour.) famili
Linderniaceae. Hasil identifikasi tumbuhan telah dilakukan oleh Denny Satria
(2016) dapat dilihat pada Lampiran 1.
4.2 Ekstraksi
Ekstraksi serbuk simplisia dilakukan secara maserasi dimulai dari pelarut
non polar hingga pelarut polar (n-heksana-etilasetat-etanol). Pemisahan ini
bertujuan untuk memisahkan senyawa kimia yang terdapat pada herba poguntano
berdasarkan tingkat kepolarannya. Senyawa polar akan larut di dalam pelarut
polar dan senyawa non polar akan larut dalam pelarut non polar.
Hasil ekstraksi 500 g simplisia dengan cara metode maserasi
menggunakan pelarut n-heksana, etilasetat dan etanol 96%. Ekstrak n-heksan,
etilasetat dan etanol herba poguntano diperoleh dengan berat masing masingnya
sebanyak 9,64 g, 10,65 g dan 26,84 g. Penggunaan pelarut n-heksana untuk
menarik senyawa kimia non polar, seperti steroid/ triterpenoid. Pelarut etilasetat
digunakan agar senyawa kimia yang bersifat semipolar dan agak polar tersari
didalamnya, seperti alkaloid dan tanin. Pelarut etanol untuk menarik senyawa
yang bersifat polar seperti flavonoid, glikosida, saponin. Flavonoid secara umum
larut pada pelarut polar. Adanya gula yang terikat pada flavonoid cenderung
59
menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air. Sebaliknya, aglikon yang
kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang
termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan
kloroform (Markham, 1988). Masing-masing ekstrak yang diperoleh dilakukan uji
skrining fitokimia, viabilitas sel, produksi NO dan ekspresi gen.
4.3 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia terhadap ekstrak herba poguntano dilakukan untuk
mendapatkan informasi golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat
didalamnya. Skrining fitokimia dilakukan dengan metode Kromatografi Lapis
Tipis (KLT). Hasil skrining fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak herba
poguntano mengandung golongan senyawa-senyawa kimia seperti yang terlihat
pada Tabel 4.1 dan penampakan bercak pada plat silica gel 60 F254 (berukuran
10x5 cm) serta nilai Rf terlihat pada Gambar 4.1 dan Tabel 4.2.
Tabel 4.1 Skrining fitokimia ekstrak herba poguntano

NO Pemeriksaan ENHP EEAHP EEHP
1 Alkaloid - - -
2 Flavonoid - + +
3 Saponin - + +
4 Tanin - + +
5 Glikosida - + +
6 Steroid /Triterpenoid + - -
Keterangan: (+) positif : mengandung golongan senyawa
(-) negatif : tidak mengandung golongan senyawa
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana herba
poguntano (ENHHP) hanya mengandung triterpenoid/steroida dan pada ekstrak
etilasetat herba poguntano (EEAHP) dan ekstrak etanol herba poguntano (EEHP)
mengandung flavonoid, tanin, saponin dan glikosida.
60
1 1
A B a b c
a b c
1 1 1 1
C a b c D a b c
2
3
1
2 2
1 1
E a b c F a b c
Gambar 4.1 Hasil penampakan bercak pada plat KLT dari ekstrak herba
poguntano. A. Alkaloid, B. Flavonoid, C. Saponin, D. Tanin, E.
Glikosida, F. steroid/Triterpenoid. a. Ekstrak n-heksana Herba
Poguntano; b. Ekstrak Etilasetat Herba Poguntano; c. Ekstrak
Etanol Herba Poguntano. :Bagian gambar yang positif.
61
Tabel 4.2 Nilai Rf dan warna noda dari skrining fitokimia ekstrak herba
poguntano
Warna noda setelah

NO Pemeriksaan ENHP EEAHP EEHP disemprotkan
penampak bercak
1 Alkaloid - - - -
2 Flavonoid - Rf 1=0,92 Rf 1=0,91 Orange kekuningan
dan kuning kehijauan
3 Saponin - Rf 1=0,96 Rf 1=0,95 Kuning kecoklatan
4 Tanin - Rf 1=0,96 Rf 1=0,94 Hijau kehitaman
5 Glikosida - Rf 1=0,43 Rf 1=0,44 Biru
Rf 2=0,52 Rf 2=0,54
Rf 3=0,64
6 Steroid/ Rf 1=0,54 - - Merah keunguan
Triterpenoid Rf 2=0,74
Rf 3=0,91
Identifikasi senyawa alkaloid dengan KLT menggunakan fase gerak
Kloroform-Metanol-Air (85:15:1) dan penampakan noda berwarna jingga
(Wagner and Bladt, 1996). Dari hasil KLT pada Gambar 4.1.A terlihat adanya
noda berwarna hijau pada ekstrak n-heksana, etilasetat dan etanol setelah
penyemprotan dengan pereaksi Dragendorff yang berarti tidak mengandung
senyawa alkaloid.
Identifikasi senyawa flavonoid dengan KLT menggunakan fase gerak
Etilasetat-Metanol-Air (8:1:1) dan penampak noda berwarna orange kekuningan
atau kuning kehijauan setelah disemprotkan dengan AlCl3 10% (Wagner and
Bladt, 1996). Dari hasil KLT pada Gambar 4.1.B dan Tabel 4.2 terlihat adanya
noda berwarna orange kekuningan dan kuning kehijauan pada ekstrak etilasetat
dan etanol dengan nilai Rf sebesar 0,92 dan 0,91 menegaskan adanya kandungan
senyawa flavonoid sedangkan pada ekstrak n-heksana terlihat adanya noda
berwarna kehitaman yang berarti tidak mengandung senyawa flavonoid.
62
Identifikasi senyawa saponin dengan KLT menggunakan fase gerak
Kloroform-Asamasetat-Metanol-Air (11:6:2:1) dan penampak noda berwarna
kuning kecoklatan setelah disemprotkan dengan pereaksi methanol:asamsulfat:
vanillin (Wagner and Bladt, 1996). Dari hasil KLT pada Gambar 4.1.C dan Tabel
4.2 terlihat adanya noda berwarna kuning kecoklatan pada ekstrak etilasetat dan
etanol dengan nilai Rf sebesar 0,96 dan 0,95 menegaskan adanya kandungan
senyawa saponin sedangkan pada ekstrak n-heksana terlihat adanya noda
berwarna kehijauan yang berarti tidak mengandung senyawa saponin.
Identifikasi senyawa tanin dengan KLT menggunakan fase gerak
Kloroform-Etilasetat-n-butanol-Air (11:6:2:1) dan penampak noda berwarna hijau
kehitaman setelah disemprotkan dengan FeCl3 10% (Depkes, 2013). Dari hasil
KLT pada Gambar 4.1.D terlihat adanya noda berwarna hijau kehitaman pada
ekstrak etilasetat dan etanol dengan nilai Rf sebesar 0,96 dan 0,94 menegaskan
adanya kandungan senyawa tanin sedangkan pada ekstrak n-heksana terlihat
adanya noda berwarna hijau muda yang merupakan warna asli dari ekstrak
tersebut berarti tidak mengandung senyawa tanin.
Identifikasi senyawa glikosida dengan KLT menggunakan fase gerak
Etilasetat-Metanol-Air (8:1:1) dan penampakan noda berwarna coklat atau biru
setelah penyemprotan dengan asam sulfat 50% (Wagner and Bladt, 1996). Dari
hasil KLT pada Gambar 4.1.E terlihat adanya noda berwarna biru pada ekstrak
etilasetat dengan nilai Rf sebesar 0,43; 0,52; 0,64 dan pada ekstrak etanol dengan
nilai Rf sebesar 0,44 dan 0,54 menegaskan adanya kandungan senyawa glikosida
sedangkan pada ekstrak n-heksana terlihat berwana kehitaman yang berarti tidak
mengandung senyawa glikosida.
63
Identifikasi senyawa steroid/triterpenoid dengan KLT menggunakan fase
gerak n-heksana-Etilasetat (8:2) dan penampakan noda berwarna merah keunguan
setelah penyemprotan dengan Lieberman-Burchard (Wagner and Bladt, 1996).
Dari hasil KLT pada Gambar 4.1.F terlihat adanya noda berwarna merah
keunguan pada ekstrak n-heksana dengan nilai Rf sebesar 0,54; 0,74; 0,91
menegaskan adanya kandungan senyawa steroid/triterpenoid sedangkan pada
ekstrak etilasetat dan etanol tidak terlihat warna merah keunguan tetapi warna
hijau pada ekstrak etilasetat dan warna coklat pada ekstrak etanol yang berarti
tidak mengandung senyawa steroid/triterpenoid.
Flavonoid adalah senyawa senyawa fenil yang tersubstitusi derivat
benzopyran yang terdiri dari kerangka dasar C15 (C6-C3-C6). Beberapa tanaman
yang mengandung turunan flavonoid, telah digunakan sebagai pencegahan
penyakit dan agen terapeutik pada pengobatan tradisional di Asia selama ribuan
tahun, diantaranya sebagai antikanker (Kanadaswami, et al., 2005),
imunomodulator (Durga, et al., 2014). Keberadaan flavonoid, saponin, tanin,
glikosida pada ekstrak etanol dan etilasetat menunjukkan pada ekstrak tersebut
memiliki efek antiinflamasi dan imunomodulator (Tungmunnithum, et al., 2015;
Yu, et al., 2015; Ahn, et al., 2015). Pada penelitian Huang, et al., (1999)
ditemukan adanya senyawa apigenin pada daun poguntano. Apigenin adalah
senyawa flavonoid yang memiliki efek yang baik sebagai antikanker (Long, et al.,
2008) dan imunomodulator (Durga, et al., 2014). Pemeriksaan steroid/triterpenoid
pada ekstrak n-heksana menunjukkan hasil yang positif. Senyawa steroid/
triterpenoid adalah senyawa yang memiliki aktivitas antitumor yang tinggi
(Petronelli, 2009) dan juga memiliki aktivitas imunomodulator sebagai obat-obat
64
imunosupresan merupakan golongan steroid (Abbas, et al., 2016; Venkatesha, et
al., 2016; Price, et al., 2010).
4.4 Viabilitas sel pada sel RAW 264.7
Uji viabilitas sel dilakukan menggunakan MTT assay untuk menentukan
konsentrasi yang bersifat tidak toksik pada ekstrak herba poguntano terhadap sel
RAW 264.7 berdasarkan tingkat kepolaran pelarutnya (n-heksana, etilasetat,
etanol). Hanya sel aktif dan secara metabolik aktif yang dapat mereduksi MTT
untuk menghasilkan formazan, maka semakin banyak intensitas warna medium,
semakin banyak sel yang dapat hidup (Yuandani, et al., 2016). Metode MTT [3-
(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] merupakan salah satu uji
sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif dan dilakukan untuk mengetahui
konsentrasi aman yang akan digunakan dalam penelitian berikutnya. Uji ini
berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil
metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini
digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase.
MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium
termasuk mitokondria dari sel hidup (Kupcsick and Martin, 2011). Hasil
pengamatan pembentukan kristal formazan terlihat pada Gambar 4.2.
65
Kristal
Kristal formazan
formazan
(a) (b) (c)

Gambar 4.2 Kristal formazan pada sel RAW 264.7 setelah MTT. (a). ENHP;
(b). EEAHP; (c). EEHP
Pada Gambar 4.2 menunjukan terbentuknya kristal formazan yang dilihat
menggunakan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x40. Aktivitas
dehidrogenase mitokondria sel yang hidup akan mereduksi warna kuning MTT
membentuk warna ungu. Warna gelap dan berserabut yang nampak pada
pengamatan merupakan kristal formazan setelah pemberian MTT. Semakin
banyak sel hidup berarti semakin banyak sel yang aktif melakukan metabolisme
sehingga jumlah kristal formazan yang terbentuk juga semakin banyak. Semakin
banyak kristal formazan yang terakumulasi ini menyebabkan intensitas warna
ungu semakin meningkat dalam plate. Sel yang mati tidak dapat terwarnai oleh
garam MTT sehingga tidak membentuk warna ungu seperti pada sel hidup.
Akibatnya pada sel mati tidak terbentuk formazan yang berwarna ungu, tetapi
warnanya tetap kuning seperti medium (Freshney, 2000).
Perlakuan masing-masing ekstrak 200; 100; 50; 25; 12,5 μg/mL.
Menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi larutan uji dengan efek viabilitas
sel yang ditimbulkan pada perlakuan dengan Deksametason dengan seri
konsentrasi 20; 10; 5; 2,5; μg/mL. Grafik hasil pengujian viabilitas sel pada
masing-masing ekstrak dan deksametason terhadap sel RAW 264.7 dapat dilihat
pada Gambar 4.3 dan nilai rata-rata % sel hidup dari Ekstrak herba poguntano dan
Deksametason dilihat pada Tabel 4.3
66
100,00
90,00
12,5 μg/mL
80,00
25 μg/mL
70,00
50 μg/mL
% Sel hidup
60,00 100 μg/mL

50,00 200 μg/mL
40,00 1,25 μg/mL
30,00 2,5 μg/mL

5 μg/mL
20,00
10 μg/mL
10,00
20 μg/mL
0,00
ENHP EEAHP EEHP Deksametason
Sampel
Gambar 4.3 Viabilitas sel RAW 264.7 pada ekstrak herba poguntano dan
deksametason
Tabel 4.3 Nilai rata-rata % sel hidup dari Ekstrak herba poguntano dan
Deksametason
Rata-rata %
Konsen Konsen
Rata-rata % sel hidup ± SEM sel hidup ±
NO trasi trasi
SEM
(μg/mL) (μg/mL)
ENHP EEAHP EEHP Deksametason
1 12,5 92,48±0,23 93,83±0,26 98,76±0,35 1,25 91,32 ± 0,46
2 25 90,14±0,31 92,22±0,26 94,78±0,13 2,5 84,83 ± 1,05
3 50 86,09±0,19 86,42±0,20 89,63±0,11 5 75,73 ± 0,51
4 100 83,42±0,20 65,94±0,26 84,37±0,20 10 68,86 ± 0,41
5 200 68,09±0,10 6,61±0,19 84,23±0,13 20 54,28 ± 0,67
Hasil uji viabilitas sel pada Gambar 4.3 dan nilai viabilitas sel pada Tabel
4.3 menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi maka nilai viabilitas semakin
rendah atau semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka sel yang hidup semakin
sedikit yang berarti semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka semakin tinggi efek
sitotoksiknya terhadap sel kultur yang diuji. Hasil uji viabilitas sel dari Ekstrak n-
heksana, etilasetat dan etanol herba Poguntano (Picria fel-terrae Lour) dan
deksametason sebagai kontrol positif. Hasil terbaik ditunjukkan pada EEHP
67
dengan konsentrasi 12,5 dan 25 μg/mL dan memiliki % sel hidup paling tinggi.
Pengujian viabilitas sel menunjukkan bahwa ekstrak herba poguntano tidak
menyebabkan toksik pada sel RAW 264.7 (Susanto, et al., 2018; Yuandani, et al.,
2017). Dengan hasil ini, konsentrasi sampel yang menghasilkan % sel hidup
paling tinggi (>90%) dipilih untuk percobaan berikutnya (Yuandani, et al., 2016).
4.5 Produksi Nitric oxide (NO)
Uji produksi NO dilakukan dengan menggunakan pereaksi Griess. Pada
metode ini, nitrit ditambahkan dengan reagen pendiazotasi seperti sulfanilamid
dalam media asam untuk membentuk garam diazonium sementara. Hasil antara ini
kemudian direaksikan dengan reagen pengkopel, N-naftil-etilendiamin (NED),
untuk membentuk senyawa azo yang stabil. Warna ungu yang dihasilkan
memungkinkan untuk analisa nitrit dengan tingkat sensitivitas yang tinggi (Sun, et
al., 2003). Pada pengujian produksi NO pada sel RAW 264.7 diinduksi dengan
LPS (1 μg/mL) dan diberikan perlakuan dengan ekstrak n-heksana, etilasetat dan
etanol herba Picria fel-terrae Lour dengan konsentrasi ekstrak yang berbeda yaitu
12,5 dan 25 μg/mL. Produksi NO diukur sebagai konsentrasi nitrit dalam media
kultur, ketika dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan, sel-sel
yang diinduksi dengan LPS melepaskan kadar NO yang lebih tinggi dalam
medium dari pada yang tidak diberi perlakuan (Joo, et al., 2014). Hasil produksi
NO dari berbagai sampel ekstrak dapat terlihat pada Gambar 4.4.
68
12
0 *^
*#^
10
0
Kadar NO (μg/mL )
*#^ *#^
8
0
6 *#^
0
4 *#^
0
#
2 # #
0 #
0
Sampel
Gambar 4.4 Hasil produksi nitric oxide (NO) pada sel RAW 264.7 yang
diinduksi oleh LPS pada ekstrak herba poguntano.
*
P<0,05 berbeda signifikan dengan kelompok kontrol normal (KS)
#
P<0,05 berbeda signifikan dengan kelompok kontrol negatif (LPS)
^
P<0,05 berbeda signifikan dengan kelompok kontrol positif
(deksametason).
Hasil pengujian produksi NO pada Gambar 4.4 menunjukkan bahwa sel
yang distimulasi dengan LPS mengalami peningkatan kadar nitrit dan sebaliknya
pada pemberian ekstrak mengalami penurunan kadar nitrit, terlihat pada
konsentrasi 12,5 μg/mL kadar nitrit lebih besar dan pada konsentrasi 25 μg/mL
mengalami penurunan yang berarti ekstrak herba poguntano dapat menghambat
produksi NO. Dari ketiga ekstrak tersebut ENHP memiliki efek penghambatan
yang paling bagus dibandingkan dengan EEAHP dan EEHP. Ketiga ekstrak
tersebut secara signifikan menghambat/menurunkan akumulasi nitrit dalam sel
RAW 264.7 (P<0,05) yang distimulasi dengan LPS dan dibandingkan dengan
kontrol sel. Konsentrasi yang paling bagus terlihat pada konsentrasi 25 μg/mL
untuk ekstrak dan 2,5 μg/mL untuk deksametason. Deksametason digunakan
sebagai positif kontrol yang dapat menurunkan kadar NO terlihat pada grafik yang
menghasilkan kadar NO yang paling rendah. Deksametason merupakan obat non
69
steroid anti-inflamasi (NSAIDs) dan juga dapat bersifat sebagai imunosupresan
(Price, et al., 2010)
Berdasarkan hasil skrining fitokimia ekstrak etilasetat dan etanol herba
poguntano mengandung flavonoid, saponin, tannin, glikosida yang dapat
menghambat produksi NO pada sel RAW 264.7 yang telah distimulasi dengan
LPS sedangkan pada ekstrak n-heksana mengandung steroid/triterpenoid yang
berperan dalam penghambatan NO. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan
bahwa beberapa flavonoid dan steroid/triterpenoid dapat menghambat produksi
NO sebagai respons terhadap rangsangan inflamasi (Durga, et al., 2014;
Venkatesha, et al., 2016). Saponin, glikosida juga dapat menghambat produksi
NO (Yu, et al., 2015; Deng, et al., 2015; Jang, et al., 2016; Dewi, et al., 2017).
4.6 Pengujian ekspresi gen
Pengujian ekspresi gen dilakukan menggunakan metode RT-PCR Prinsip
kerja metode ini mengamplifikasi RNA. RNA diubah menjadi DNA dengan
menggunakan reverse transcriptase yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan
RNA dan menghasilkan DNA yang disebut dengan cDNA. Setelah terbentuk
DNA maka dapat diamplifikasi dengan menggunakan PCR (Sudjadi, 2008). Pada
pengujian ini, sel RAW 264.7 diberi perlakuan dengan ekstrak n-heksana,
etilasetat dan etanol herba Picria fel-terrae Lour dengan konsentrasi 25 μg/mL
yang telah diinduksi dengan LPS (1 μg/mL). Hasil pengujian ekspresi gen TNF-α,
IL-6, IL-1β, iNOS dan β-actin oleh ekstrak herba poguntano yang telah dilakukan
elektroforesis sehingga menghasilkan gambaran pita yang dapat terlihat pada
Gambar 4.5 kemudian dikuantifikasi densitas yang diperoleh menggunakan sistem
70
komputerisasi Gel doc sehingga dapat ditentukan nilai densitas ekspresi gen yang
terlihat pada Tabel 4.4 serta penurunannya terlihat pada Gambar 4.6.
TNF-α 374 Bp
IL-6 269 Bp
IL-1β 441 Bp
iNOS 311 Bp
β-actin 349 Bp
a b c d e f
Gambar. 4.5. Hasil ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS, terhadap ekstrak
herba poguntano, a. Deksametason 2,5 μg/mL; b. Ekstrak Etanol
Herba Poguntano 25 μg/mL; c. Ekstrak Etilasetat Herba Poguntano
25 μg/mL; d. Ekstrak n-Heksana Herba Poguntano 25 μg/mL; e.
Lipopolisakarida; f. Kontrol Sel.
Hasil pengujian ekspresi gen pada Gambar 4.5 menunjukkan bahwa
ekstrak n-heksana, etilasetat dan etanol herba poguntano dapat menurunkan
ekspresi TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS yang dibandingkan dengan LPS yang
mengalami peningkatan terbesar. Gambaran pita dengan perlakuan (ENHP,
EEAHP, EEHP, Deksametason) terlihat lebih tipis dibandingkan dengan
perlakuan dengan LPS yang menghasilkan pita paling tebal. LPS merupakan
inducer utama yang dapat mengaktivasi makrofag sehingga dapat meningkatkan
ekspresi gen (Yu, et al., 2015; Kim, et al., 2016). Pada perlakuan dengan
deksametason, pita terlihat lebih tipis dari perlakuan yang diberikan ekstrak
karena deksametason merupakan kontrol positif yang dapat menurunkan ekspresi
gen (Yuandani, et al., 2016). Deksametason merupakan obat NSAID yang juga
dapat digunakan sebagai imunosupresan (menurunkan sistem imun tubuh). β-actin
71
digunakan sebagai kontrol internal dalam analisis ekspresi gen karena ia
merupakan Housekeeping gene, yaitu gen yang terus menerus diekspresikan
selama suatu organisme hidup. Housekeeping gene memiliki tingkat ekspresi yang
stabil diberbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan (Dheda, et al., 2004;
Libault, et al., 2008; Yoon, et al., 2009). Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak
tersebut mempunyai aktivitas imunosupresan pada sel makrofag RAW 264.7 yang
diinduksi dengan LPS.
Berdasarkan hasil pengukuran ekspresi gen pada Gambar 4.5 dianalisis
secara statistik dengan menggunakan One way anova, kemudian dilanjutkan
dengan Post Hoc Test berupa uji Tuckey HSD memberikan hasil bahwa terdapat
perbedaan yang signifikan antara kelompok perlakuan dengan kontrol sel sebagai
kontrol normal (kontrol yang tidak diberi perlakuan), lipopolisakarida sebagai
kontrol negatif (dapat menaikkan ekspresi gen), dan deksametason sebagai kontrol
positif (dapat menurunkan ekspresi gen). Hasil ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β,
iNOS yang diberikan perlakuan (ENHP, EEAHP, EEHP) berbeda nyata secara
signifikan p<0,05 terlihat pada Tabel 4.4.
Tabel 4.4 Hasil densitas ekspresi gen dari ekstrak herba poguntano
NO Gen Kelompok Perlakuan Rata-rata nilai densitas ± SEM

1 TNF-α ENHP 1,08 ± 0,005abc
EEAHP 1,03 ± 0,012bc
EEHP 1,26 ± 0,011ab
Deksametaon 1,23 ± 0,012ab
LPS 1,46 ± 0,006ac
KS 1,00 ± 0,000bc
2 IL-6 ENHP 1,27 ± 0,008abc
EEAHP 1,29 ± 0,008abc
EEHP 1,34 ± 0,012abc
LPS 2,61 ± 0,011ac
KS 1,00 ± 0,000bc
3 IL-1β ENHP 2,33 ± 0,009abc
72
EEAHP 2,78 ± 0,009abc
EEHP 1,80 ± 0,006abc
LPS 4,03 ± 0,007ac
KS 1,00 ± 0,000bc
4 iNOS ENHP 0,67 ± 0,012ab
EEAHP 0,75 ± 0,009abc
EEHP 0,69 ± 0,009ab
LPS 1,03 ± 0,006c
KS 1,00 ± 0,000c
Keterangan:
a: Sig (P) <0,05 ada perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol normal
(KS)
b: Sig (P) <0,05 ada perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol negatif
(LPS)
c: Sig (P) <0,05 ada perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol positif
(deksametason)
Pemberian ENHP; EEAHP; EEHP dapat menurunkan ekspresi iNOS,
TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang diinduksi Lipopolisakarida
dengan nilai densitas ekspresi iNOS paling kecil pada ENHP (0,67±0,012) yang
menunjukkan efek tidak berbeda secara signifikan dengan kontrol positif p>0,05
dan berbeda secara signifikan dengan kontrol negatif dan kontrol normal p<0,05
sedangkan nilai densitas ekspresi TNF-α paling kecil pada EEAHP (1,03±0,012)
yang menunjukkan efek tidak memiliki perbedaan yang signifikan dengan kontrol
normal p>0,05 dan berbeda secara signifikan dengan kontrol positif dan kontrol
negatif p<0,05, selanjutnya nilai densitas ekspresi IL-1β paling kecil pada EEHP
(1,80±0,006) yang menunjukkan efek berbeda secara signifikan dengan kontrol
normal, kontrol positif dan kontrol negatif p<0,05, kemudian nilai densitas
ekspresi IL-6 paling kecil pada ENHP (1,27±0,008) yang menunjukkan efek
berbeda secara signifikan dengan kontrol normal, kontrol positif dan kontrol
negatif p<0,05. Hal ini menunjukkan bahwa ENHP; EEAHP; EEHP memiliki
73
efek penghambatan ekspresi iNOS, TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada sel RAW 264.7
KS
LPS
4,5
0 *^
EEHP
4,0
0 EEAHP
Nilai densitas
3,5 *#^ ENHP

*^
0 *#^
Deksametason
3,0 *#^
0 *^ *#^
*#^
*#^ *# *#^
2,5 #^ #^ *# #
*#
^
#^ ^
0 # *#
*#
*#^ *#
2,0
0
1,5 TNF-α IL-6 IL-1β iNOS
0 Ekspresi gen
Gambar.
1,0 4.6 Grafik nilai densitas ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS
0 terhadap ekstrak herba poguntano.
0,5 *p<0,05 berbeda signifikan dengan kelompok kontrol normal (KS)
0 #p<0,05 berbeda signifikan dengan kelompok kontrol negatif
0,0 (LPS). ^p<0,05 berbeda signifikan dengan kelompok kontrol
0 positif (deksametason).
Nilai densitas ekspresi gen pada Gambar. 4.6 terlihat grafik yang
mengalami penurunan yang signifikan dibandingkan dengan LPS. Pada gen TNF-
α, dengan pemberian EEAHP mengalami penurunan lebih besar dibandingkan
ENHP dan EEHP sedangkan pada gen IL-6 dengan pemberian ENHP mengalami
penurunan lebih besar dari EEAHP dan EEHP dan pada gen IL-1β, dengan
pemberian EEHP penurunan yang lebih besar dibandingkan ENHP dan EEAHP
sedangkan pada gen iNOS, dengan pemberian ENHP mengalami penurunan lebih
besar dibandingkan dengan EEAHP dan EEHP.
Berdasarkan hasil skrining fitokimia ENHP mengandung golongan
senyawa steroid/triterpenoid. Steroid merupakan suatu kelompok senyawa yang
mempunyai kerangka dasar siklopentanaperhidrofenantrena, mempunyai empat
74
cincin terpadu. Senyawa ini mempunyai efek fisiologis tertentu. Pada penelitian
terdahulu, steroid dapat menghambat ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS
(Checker, et al., 2012; Venkatesha, et al., 2016). Pada skrining fitokimia EEAHP
dan EEHP mengandung golongan senyawa flavonoid, saponin, tanin, glikosida.
Flavonoid merupakan kelompok senyawa alami golongan polifenol yang
ditemukan pada tumbuhan. Flavonoid tersusun dari dua cincin aromatis yang
dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga dengan susunan C6-C3-C6
(Markham, 1988). Saponin merupakan senyawa glikosida kompleks yaitu
senyawa hasil kondensasi suatu gula dengan suatu senyawa hidroksil organik
yang apabila dihidrolisis akan menghasilkan gula (glikon) dan non-gula (aglikon).
Pada penelitian terdahulu, flavonoid dapat menghambat ekspresi gen TNF-α, IL-6,
IL-1β dan iNOS (Lee, et al., 2009; Liu, et al., 2014; Fachnian, et al., 2017;
Tungmunnithum, et al., 2018), Saponin juga dapat menghambat ekspresi gen
TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS (Yu, et al., 2015; Ahn, et al., 2015; Jang, et al.,
2016).
TNF-α, IL-6, IL-1β dapat diproduksi dari makrofag sebagai respons
terhadap rangsangan LPS yang berasal dari bakteri, infeksi dan rangsangan
inflamasi. Sitokin tersebut juga memainkan peran penting dalam sistem kekebalan
tubuh dengan membantu efek sitotoksik dan sitostatik pada sel yang terinfeksi
atau sel ganas. TNF-α adalah salah satu faktor utama yang mengaktivasi makrofag
sebagai kekebalan tumor (Yanti, et al., 2011). TNF-α, IL-1β, dan IL-6 adalah
sitokin aktif pro-inflamasi yang mampu menyebabkan inisiasi peradangan
(Adebayo, et al., 2017). Pada makrofag yang teraktivasi juga menghasilkan NO
yang disintesis dengan bantuan enzim yaitu iNOS. iNOS yang mengalami
75
peningkatan ekspresi maka akan menghasilkan NO yang berlebih. Dengan
demikian penurunan ekspresi iNOS berpengaruh pada produksi NO yang juga
mampu menyebabkan inisiasi peradangan (Ryu, et al., 2015; Dewi, et al., 2017).
Hasil ini menunjukkan bahwa ENHP; EEAHP; EEHP dapat menghambat ekspresi
gen TNF-α, IL-1β, IL-6 dan juga menghambat enzim yang menginduksi
peradangan yaitu iNOS. Dengan penghambatan iNOS maka juga akan
menghambat produksi NO. Hal ini merupakan strategi yang kuat untuk
manajemen berbagai penyakit inflamasi serta gangguan sistem kekebalan tubuh
sehingga dapat berfungsi sebagai dasar untuk pengembangan potensi obat-obat
imunomodulator.
76
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan dan hasil penelitian diperoleh kesimpulan:
a. Pemberian ENHP; EEAHP; EEHP tidak bersifat toksik terhadap sel RAW
264.7 dengan nilai persentase sel hidup yang paling aman terlihat pada
ENHP; EEAHP; EEHP dengan konsentrasi 12,5 dan 25 μg/mL dengan
persentase sel hidup > 90 %.
b. Pemberian ENHP; EEAHP; EEHP dapat menurunkan produksi nitric
oxide (NO) pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan Lipopolisakarida,
dimana pengujian ENHP pada konsentrasi 25 μg/mL menurunkan kadar
NO paling besar dibandingkan EEAHP dan EEHP pada konsentrasi 12,5
dan 25 μg/mL dengan nilai kadar NO ENHP sebesar 10,42 μg/mL yang
menunjukkan efek tidak berbeda secara signifikan terhadap kontrol positif
dan kontrol normal p>0,05. Hal ini menunjukkan bahwa ENHP; EEAHP;
EEHP memiliki efek penghambatan produksi NO pada sel RAW 264.7
c. Pemberian ENHP; EEAHP; EEHP dapat menurunkan ekspresi iNOS,
TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang diinduksi
Lipopolisakarida dengan nilai densitas ekspresi iNOS paling kecil pada
ENHP (0,67±0,012) yang menunjukkan efek tidak berbeda secara
signifikan dengan kontrol positif p>0,05 dan berbeda secara signifikan
dengan kontrol negatif dan kontrol normal p<0,05 sedangkan nilai densitas
77
ekspresi TNF-α paling kecil pada EEAHP (1,03±0,012) yang
menunjukkan efek tidak memiliki perbedaan yang signifikan dengan
kontrol normal p>0,05 dan berbeda secara signifikan dengan kontrol
positif dan kontrol negatif p<0,05, selanjutnya nilai densitas ekspresi IL-1β
paling kecil pada EEHP (1,80±0,006) yang menunjukkan efek berbeda
secara signifikan dengan kontrol normal, kontrol positif dan kontrol
negatif p<0,05, kemudian nilai densitas ekspresi IL-6 paling kecil pada
ENHP (1,27±0,008) yang menunjukkan efek berbeda secara signifikan
dengan kontrol normal, kontrol positif dan kontrol negatif p<0,05. Hal ini
menunjukkan bahwa ENHP; EEAHP; EEHP memiliki efek penghambatan
ekspresi iNOS, TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang
diinduksi dengan Lipopolisakarida.
5.2 Saran
Berdasarkan kesimpulan penelitian ini, disarankan peneliti selanjutnya untuk
melakukan pengujian aktivitas imunomodulator pada tahapan sistem imun lainnya
seperti aktivitas fagositosis, kemotaksis dan ROS.
78
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A.K., Lichtman, A.H. and Pillai S. (2010). Celullar and Molecular.
Immunology, 6th ed. Philadelphia: W.B Saunders Company. 69, 83, 115
Abbas, A.K., Licthtman, A.H dan Pillai, S. (2016). Imunologi Dasar Fungsi dan
Kelainan Sistem Imun. Edisi Indonesia kelima. Penerjemah: Handono
Kalim. Elsevier. Hal: 1-25, 35, 47, 55.
Adebayo, S. A., Steel, H. C., Shai, L. J., and Eloff, J. N. (2017). Investigation of
the Mechanism of Anti-Inflammatory Action and Cytotoxicity of a
Semipurified Fraction and Isolated Compounds From the Leaf of
Peltophorum africanum (Fabaceae). Journal of Evidence-based
Complementary and Alternative Medicine, 22(4): 840-845
Ahn, S., Siddiqi, M.H., Noh, H.Y., Kim, Y.J., Kim, Y.J., Jin, C.G., and Yang,
D.C. (2015). Anti-inflammatory activity of ginsenosides in LPS-stimulated
RAW 264.7 cells. Science bulletin, 60(8): 773-784.
Alamgir, M. and Uddin, S.J. (2010). Recent advances on the ethnomedicinal
plants as immunomodulatory agents. Ethnomedicine: A Source of
Complementary Therapeutics, 37/661(2): 227-244.
Amanda, U.D. dan Cartealy, I.C. (2015). Isolasi RNA dari mesokarp buah Elaeis
guineenssis Jacq. var. Tenera. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, 1(2):
171-176.
Anonim. (2008). Geneaid. Diakses tanggal 13 Februari 2018.
http://www.geneaid.com/products/rna-extraction/total-rna-purification.
Anonim. (2014). Picria fel-terrae Lour. Diakses tanggal 17 April 2018.

http://tropical.theferns.info/viewtropical.php?id=Picria+felterrae
Anonim. (2015). Picria fel-terrae Lour. Diakses tanggal 13 Februari 2018.

http://www.stuartxchange.org/Sagai-uak.html
ATCC. (2017). Product Sheet. RAW 264.7 (ATCC® TIB71™). American Type
Culture Collection. Manassas. VA 20108 USA.
Avau, A. and Matthys, P. (2015). Therapeutic Potential of Interferon-γ and Its

Antagonists in Autoinflammation: Lessons from Murine Models of
Systemic Juvenile Idiopathic Arthritis and Macrophage Activation
Syndrome. Review. Pharmaceuticals. 8: 793-815.
Baratawidjaja, K.G. dan Rengganis, I. (2012) Imunologi Dasar. Edisi ke-10.

Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Hal:
96, 110.
79
Benjamini, E., Coico, R. and Sunshine, G. (2000). Immunology A Short Course.
Forth Edition. New York: Wiley-Liss. A John Wiley dan Sons. Inc. Hal:
178
Bogdan, C. (2001). Nitric oxide and the immune response. Nat Immunol 2: 907-
916.
CCRC. Cancer Chemoprevention Research Centre. (2009). Protokol Kultur Sel.

Yogyakarta: Cancer Chemoprevention Research Centre. Halaman 1-7.
Checker, R., Sandur, S. K., Sharma, D., Patwardhan, R. S., Jayakumar, S., Kohli,
V., et al. (2012). Potent anti-inflammatory activity of ursolic acid, a
triterpenoid antioxidant, is mediated through suppression of NF-κB, AP-1
and NF-AT. PloS one, 7(2): 31318.
Chi, C., Giri, S.S., Jun, J.W., Kim, H.J., Yun, S., Kim, S.G. et al. (2016).
Immunomodulatory Effects of a Bioactive Compound Isolated from
Dryopteris crassirhizoma on the Grass Carp Ctenopharyngodon idella.
Journal of Immunology. 1-10.
Choi. J.N., Choi, Y.H., Lee, J.M., Noh, I.C., Park, J.W., Choi, W.S. et al. (2012).
Anti-inflammatory effects of β-sitosterol-β-D-glucoside from
Trachelospermum jasminoides (Apocynaceae) in lipopolysaccharide-
stimulated RAW 264.7 murine macrophages. Natural product research.
26(24): 2340-2343.
Cree, I.A. (2011). Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Edisi Kedua.
New York: Springer Human Press. Hal. 237-244.
Dalimunthe, A., Hasibuan, P.A.Z. dan Ernawaty. (2011). Aktivitas

Imunomodulator Ekstrak Etanol Pogun Tanoh (Curanga fel-terrae).
Pharmacy update 3. Seminar workshop. IAI. Medan. Hal: 1-4
Dalimunthe, A., Harahap, U., Rosidah. and Pandapotan, M. (2015). Evaluation of

diuretic activity of Picria fel-terrae Lour. leaves extracts. Asian J Pharm
Clin Resc. 8: 204-205.
Deng, G.G., Wei, W., Yang, X. W., Zhang, Y.B., Xu, W., Gong, N.B. et al.
(2015). New coumarins from the roots of Angelica dahurica var.
formosana cv. Chuanbaizhi and their inhibition on NO production in LPS-
activated RAW264. 7 cells. Fitoterapia. 101: 194-200.
Depkes, R.I. (1979). Farmakope Indonesia. Edisi III. Jakarta: Departemen

Kesehatan Republik Indonesia. Hal: 33.
Depkes, R.I. (1985). Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta: Departemen Kesehatan

Republik Indonesia. Hal: 10.
80
Depkes, RI. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Cetakan
pertama. Jakarta. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hal: 10-11.
Depkes, R.I. (2013). Suplemen III. Farmakope Herbal Indonesia. Edisi 1. Jakarta.
Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. Hal: 106-107.
Dewi, K., Widyarto, B., Erawijantari, P. P., and Widowati, W. (2017). In vitro
study of Myristica fragrans seed (Nutmeg) ethanolic extract and quercetin
compound as anti-inflammatory agent. International Journal of Research
in Medical Sciences, 3(9), 2303-2310.
Dheda, K., Huggett, J. F., Bustin, S. A., Johnson, M. A., Rook, G., and Zumla, A.
(2004). Validation of housekeeping genes for normalizing RNA
expression in real-time PCR. Biotechniques, 37(1): 112-119.
Djajakusumah, T.S. (2010). The Role of Immunomodulator In The Treatment Of

Sexuelly Transmitted Infections. PKB. New Perspective of Sexually
Transmitted Infection Problems. Surabaya. 144-163.
Doyle, A. and Griffith, J.B. (2000). Cell and Tissue Culture for Medical
Research. New York: John Willey and Sons. Ltd. Hal: 49.
Durga, M., Nathiya, S. and Devasena, T. (2014). Immunomodulatory and

antioxidant actions of dietary flavonoids. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 6(2): 50-56.
Fachinan, R., Fagninou, A., Nekoua, M. P., Amoussa, A. M., Adjagba, M.,
Lagnika, L., et al. (2017). Evidence of Immunosuppressive and Th2
Immune Polarizing Effects of Antidiabetic Momordica charantia Fruit
Juice. BioMed research international, 42(5): 265-270.
Freshney, I.R. (2000). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique.

Edisi IV. Toronto: Willey-Liss. Hal. 329-344.
Gautam M, Diwanay S, Gairola S, Shinde Y, Patki P, and Patwardhan B. (2004).

Immonoadjuvant potential of Asparagus racemosus aqueous extract in
experimental system. J Ethnopharmacol. 91: 251-255.
Haanwinckel., Santos, M.C., Oliveira. and Luis de, S. (2011). Production of

reactive oxygen (H2O2) and nitrogen (NO) Intermediates and TNF-α in
mice genetically selected for high and low antibody respone and
experimentally infected with leptospira serovar Pomona. J. Micro. 42: 729
-739.
Hadiarto, T., Listanto, E., Eny, I. and Riyanti. (2015). Identification of RB gene
cDNA in Genetically Modified Potato Katahdin SP951. Jurnal
AgroBiogen 11(2): 59-64.
81
Handayani, G. (2010). Imunomodulator. AL-FIKR. UIN Alauddin Makassar
Press, Makassar. 14(1) : 1-17.
Harborne, J.B. (1987). Metode Fitokimia. Terbitan Kedua. Penerjemah: Kosasih

Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung: Penerbit ITB. Hal: 49, 58.
Harfina, F., Bahri, S. dan Saragih, A. (2012). Pengaruh Serbuk Daun Poguntano
(Curanga fel-terrae Merr.) Pada Pasien Diabetes Mellitus. Journal of
Pharmaceutics and Pharmacology. 2(1): 112-118.
Hariadi, T.S. (2015). Ekspresi Imunohistokimia Aktivitas el Natural Killer

Dengan CD107a pada Endometrium Ektopik Penderita Endometriosis
Dibandingkan dengan Endometrium Normal. Tesis. Fakultas Kedokteran.
USU.
Harison, M.A. and Freshney, I.A. (1997). General Techniques of Cell Culture.
London: Cambridge. Hal: 196.
Huang, Y., Cimanga, K., Lasure, A., Van, P.B., Pieters, L. and Berghe-
Vanden, D. (1994). Biological activities of picria fel-terrae Lour. Pharm
World Sci Suppl. 16(6): 18.
Huang, Y., Bruyne, T.D., Apers, S., Ma, Y., Claeys, M., Pieters, L. et al. (1999).
Flavonoid Glucuronides from Picria fel-terrae. Elsevier Science. 52(8):
1701-1703.
Ilyas, U., Katare, D., Aeri, V. and Naseef, P. (2016). A review on hepato-
protective and immunomodulatory herbal plants Pharmacognosy Reviews;
Bangalore. 10(19): 66-70.
Jang, K. J., Choi, S. H., Yu, G. J., Hong, S. H., Chung, Y. H., Kim, C. H., et al.
(2016). Anti-inflammatory potential of total saponins derived from the
roots of Panax ginseng in lipopolysaccharide-activated RAW 264.7
macrophages. Experimental and therapeutic medicine, 11(3): 1109-1115.
Jayathirtha, M.G, and Mishra, S.H. (2004). Preliminary immunomodulatory

activities of methanol extracts of Eclipta alba and Centella asiatica.
Phytomedicine. 11:361-365.
Joo, T., Kandhasamy, S., Sunghyun, H., Jaehak, L., Sun, Y.Park., Songmun, K.,et
al. (2014). Inhibition of nitric oxide production in LPS-stimulated RAW
264.7 cells by stem bark of Ulmus pumila L. Saudi Journal of Biological
Sciences 21: 427-435
Katzung, B.G. (2002). Farmakologi Dasar dan Klinik 2. Edisi 8. Jakarta: Salemba
Medika. Hal: 386.
82
Kil, J.S., Son, Y., Cheong, Y.K., Kim, N.H., Jeong, H.J., Kwon, J.W., et al.
(2011). Okanin, a chalcone found in the genus Bidens, and 3-penten-2-one
inhibit inducible nitric oxide synthase expression via heme oxygenase-1
induction in RAW 264.7 macrophages activated with Lipopolysaccharide.
J. Clin. Biochem. Nutr. 50(1): 53-58.
Kim, K.A., Lee, I.A., Gu, W., Hyam, S.R., and Kim, D.H. (2014). β‐Sitosterol
attenuates high‐fat diet‐induced intestinal inflammation in mice by
inhibiting the binding of lipopolysaccharide to toll‐like receptor 4 in the
NF‐κB pathway. Molecular nutrition & food research. 58(5): 963-972.
Kim, G.T., Tran, N.K.S., Choi, E.H., Song, Y.J., Song, J.H, Shim, S.M. et al.
(2016). Immunomodulatory Efficacy of Standardized Annona muricata
(Graviola) Leaf Extract via Activation of Mitogen-Activated Protein
Kinase Pathways in RAW 264.7 Macrophages. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine: 1-10.
Kim, J., Heesook, H., Ara, J., Huwon, K., Hyojeong, Y., Sojeong, I., et al. (2018).
Anti-Inflammatory Effects of a Stauntonia hexaphylla Fruit Extract in
Lipopolysaccharide-Activated RAW-264.7 Macrophages and Rats by
Carrageenan-Induced Hind Paw Swelling. Nutrients. 10: 110.
Kobayashi, S.D., Voyich, J.M., Burlak, C,. and DeLeo, F.R. (2005). Neutrophils
in the innate immune response. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 53(6):
505-517.
Kupcsik, L., and Martin, J.S. (2011). Mammalian Cell Viability: Methods and
Protocols. New York: Humana Press. Hal. 13-18.
Kusmardi, S.K. dan Enif, E.T. (2007). Efek Imunomodulator Ekstrak Daun
Ketepeng Cina (Cassia alata. L) terhadap Aktivitas dan Kapasitas
Fagositosis Makrofag. Makara Kesehatan. 11(2): 50-51. Hal: 1-7.
Kresno, S.B. (2010). Imunologi Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta:

Badan Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Hal: 78, 85.
Kwon, D.H., Cheon, J.M., Choi, E.O., Jeong, J.W., Lee, K.W., Kim, K.Y. et al.
(2016). The Immunomodulatory Activity of Mori folium, the Leaf of
Morus alba L in RAW 264.7 Macrophages In Vitro. Journal Of Cancer
Prevention. 21(3): 144-151.
Lay, B.W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo

Persada. Hal: 57-58.
Lee, S. H., Kim, Y. J., Kwon, S. H., Lee, Y. H., Choi, S. Y., Park, J. S., et al.
(2009). Inhibitory effects of flavonoids on TNF-α-induced IL-8 gene
expression in HEK 293 cells. BMB reports, 42(5): 265-270.
83
Leiro, J., Alvarez, E., Arranz, J.A., Laguna, R., Uriarte, E., and Orallo, F. (2004).
Effects of cis-resveratrol on inflammatory murine macrophages:
Antioxidant activity and down-regulation of inflammatory genes. J Leukoc
Biol. 75(6): 1156-1165.
Lestari, P. (2013). Efek kombinasi ekstrak aktif daun poguntano (Picria fel-terrae
Lour.) dengan doksorubisin terhadap sel kanker payudara secara in vitro.
Tesis: Medan. Fakultas Farmasi. Universitas Sumatera Utara. Hal: 21
Libault, M., Thibivilliers, S., Bilgin, D.D., Radwan, O., Benitez, M., Clough, S.J.
et al. (2008). Identification of four soybean reference genes for gene
expression normalization. The plant Genome, 1: 44-45
Liu, X., Jia, L., Gao, Y., Li, B., and Tu, Y. (2014). Anti-inflammatory activity of
total flavonoids from seeds of Camellia oleifera Abel. Acta Biochim
Biophys Sin, 46(10): 920-922.
Long, X., Fan, M. and Bigsby, R.M. (2008). Apigenin Inhibits Antiestrogen
Resistant Breast Cancer Cell Growth Through Estrogen Receptor-Alpha-
Dependent and Estrogen Receptor-Alpha-Independent Mechanisms. Mol
Cancer Ther. 7: 2096-2108.
Markham, K. R. (1988). Distribution of flavonoids in the lower plants and its

evolutionary significance. In The flavonoids Springer, Boston, MA. Hal:
427-468.
Martínez, O., Miranda, E., Ramírez, M., Santos, S., Rivera, C., Vázquez, L. et al.
(2015). Immunomodulator-Based Enhancement of Anti Smallpox Immune
Responses. Plos One. 10(4): 1-17.
Nugroho, A.E., Hermawan, A., Putri, D.D.P., Novika, A. and Meiyanto, E.,
(2013). Combinational Effects of Hexane Insoluble Fraction of Ficus
septica Burm. F. and Doxorubicin Chemotherapy on T47D Breast Cancer
Cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2: 1-6.
Olson, K.R dan Nardin, E.D. (2014). Imunologi dan Serologi Klinis Modern.
Jakarta: EGC. Hal: 6-8.
Patilaya, P. and Dadang, I.H. (2015). Preliminary study on the anthelmintic

activity of the leaf ethanolic extract of Indonesian Curanga fel-terrae
(Lour.) Merr. Int J Pharmtech Res. 8: 347-351.
Petrunov, B., Nenkov, P. and Shekerdjiisky, R. (2007). The Role Of

Immunostimulants In Immunotherapy And Immunoprophylaxis.
Biotechnol and Biotechnol. 21(4): 454-462.
84
Plummer, M., Martel, D.C., Vignat, J., Ferlay, J., Bray, F. and Franceschi, S.
(2016). Global burden of cancers attributable to infections in 2012: a
synthetic analysis. Lancet Glob Health. 4(9): 609-616.
Playfair, J.H.L. dan Chain, B.M. (2012). At a Glance Imunologi. Edisi

Kesembilan. Jakarta: Erlangga. Hal: 11.
Price, L.C., Montani, D., Tcherakian, C., Dorfmüller, P., Souza, R., Gambaryan,
N., et al. (2010). Dexamethasone reverses monocrotaline - induced
pulmonary arterial hypertension in rats. European Respiratory Journal. 37:
813-822.
Purnawian, R.S. (2015). Pengaruh Ekstrak Lompong Mentah (Colocasia

esculenta L Schoot) terhadap Aktivitas Fagositosis dan Kadar NO (Nitrit
Oksida) Mencit Balb/C Sebelum dan Sesudah Terinfeksi Listeria
monocytogenes. Artikel Penelitian. Program Studi Ilmu Gizi. Fakultas
Kedokteran Univrsita Diponegoro. Semarang. 9-14.
Rantam, F.A. (2003). Metode imunologi. Cetakan I. Surabaya: Airlangga

University Press. Hal: 167-168.
Ryu, J. H., Park, H. J., Jeong, Y. Y., Han, S., Shin, J. H., Lee, S. J., et al. (2015).
Aged Red Garlic Extract Suppresses Nitric Oxide Production in
Lipopolysaccharide-Treated RAW 264.7 Macrophages Through Inhibition
of NF-κ B. Journal of medicinal food, 18(4): 439-445.
Saeidnia, S., Manayi, A., Gohari, A.R., and Abdollahi, M. (2014). The story of
beta-sitosterol-a review. European journal of medicinal plants. 4(5): 590-
609.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning A

Laboratory. Edisi Kedua. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Hal: 75-79.
Saroj, P., Verma, M., Jha, K.K. and Pal, M. (2012). An overview on
immunomodulation. Journal of Advanced Scientific Research. 3(1): 7-12.
Satria, D., Furqan, M., Hadisahputra, S. and Rosidah. (2015). Combinational

effects of ethylacetate extract of Picria fel-terrae Lour and doxorubicin on
T47D breast cancer cells. Int J Pharm Pharm Sci. 7: 73-76.
Satria, D., Silalahi, J., Haro, G., Ilyas, S. and Hasibuan, P.A.Z. (2017).
Antioxidant and Antiproliferative Activities of an Ethylacetate Fraction of
Picria fel-terrae Lour. Herbs. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention.
18(2): 399-403.
Sihotang, Y.M., Silalahi, J., Hadisahputra, H., Hasibuan, P.A.Z. and Satria, D.
(2016). Cardioprotective effect of ethylacetate extract of poguntano (Picria
85
fel-terrae Lour.) against doxorubicin-induced cardiotoxicity in rats. Int J
Pharm Clin Resc. 8: 466-470.
Sitorus, P., Harahap, U., Pandapotan, M. and Barus, T. (2014). Isolation Of β-

Sitosterol From n-Hexane of Picria fel-terrae Lour. Leave and Study Of
Its Antidiabetic Effect in Alloxan Induced Diabetic Mice. International
Journal of PharmTech Research. 6(1): 137-141.
Sitorus, P., Hasibuan, P.A.Z and Satria, D. (2017). Total Phenolic and Flavonid
Contents and antioxidant activity of Ethanol Fraction of Picria fel-terrae
(Lour.) Herbs. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research.
10(7): 243-245.
Sostres, C., Gargallo, C.J., Arroyo, M.T and Lanas, A. (2010). Adverse effects of
non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs, aspirin and coxibs) on
upper gastrointestinal tract. Best Prac Res Cl Ga. 24: 121-132.
Subowo. (2014). Imunobiologi. Edisi 3. Jakarta: Sagung seto. Hal: 172, 206-226.
Sudiono, J. (2014). Sistem Kekebalan tubuh. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Hal:
42.
Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanius. Hal: 142.
Sun, J., Zhang, X., Broderick, M. and Fein, H. (2003). Measurement of Nitric
Oxide Production in Biological Systems. Sensors. 3: 276-284.
Surati. (2012). Pengaruh Ekstrak Daun Salam (Syzygium polyanthum) Terhadap

Aktivitas Makrofag Pada Mencit Balb/c Yang Diinfeksi Salmonella
typhimurium. Tesis. Magister Ilmu Biomedik. Program Pascasarjana.
Universitas Diponegoro. Semarang. Hal: 53
Than, N.V. and Tung, N.T. (2017). Microscopic Features and Preliminary Thin
Layer Chromatography of “Thanh ngam” (Picria fel-terrae Lour. ex Wall)
Collected in Viet Nam. Trop J Nat Prod Res. 1(6): 241-243.
Thuan, N.D., Ha, D.T., Thuong, P.T., Na, M.K, Lee, J.P., Lee, J.H. et al. (2007).
A phenylpropanoid glycoside with antioxidant activity from Picria tel-
ferae. Arch Pharm Res. 30(9):1062-1066.
Torres, A.V., Carson, J.J., Mastroeni, P., Ischiropoulos, H. and Fang, F.C. (2000).
Antimicrobial Action of the NADPH Phagocyte Oxidase and Inducible
Nitric Oxide Synthase in Experimental Salmonellosis Effect on Microbial
Killing by Activated Peritoneal Macrophages in vitro. J.Exp Med. 192(2):
227-236.
Tungmunnithum, D., Thongboonyou, A., Pholboon, A., and Yangsabai, A.

(2018). Flavonoids and Other Phenolic Compounds from Medicinal Plants
86
for Pharmaceutical and Medical Aspects: An Overview. Medicines, 5(3),
93.
Veluswamy., Rajwanth, R., Ward, S.C., Yum, K., Abramovitz, R.B., Isola, L.M.
et al. (2014). Adverse drug reaction: pomalidomide-induced liver injury.
The Lancet; London. 383(9935): 2125-2126.
Venkatesha, S.H., Dudics, S., Astry, B., and Moudgil, K.D. (2016). Control of
autoimmune inflammation by celastrol, a natural triterpenoid. Fems
Pathogens and Disease, 74(6): 59.
Wagner, H., and Bladt, S. (1996). Plant drug analysis: a thin layer
chromatography atlas. Springer Science & Business Media. Hal: 4-6, 99-
100, 196, 306, 335.
Wahab, A.S. dan Madarina, J. (2002). Sistem Imun, Imunisasi, dan Penyakit Imun.
Jakarta: Penerbit Widya Medika. Hal: 87
WHO. (2015). Kanker. Diakses tanggal 13 februari 2018
http:who.int/mediacenter.factsheets/fs297/en/
Wiedosari, E. (2007). Peranan Imunomodulator Alami (Aloe vera) Dalam sistem

imunitas Seluler dan Humoral. Wartazoa. Balai Besar Peneliti Veteriner.
Bogor. 17(4): 165-171.
Yanti., Pramudito, T.E., Nuriasari, N and Juliana, K. (2011). Lemon Pepper Fruit
Extract (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Suppresses the Expression of
Inflammatory Mediators in Lipopolysaccharide-Induced Macrophages In
Vitro. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 7(4): 190-
195.
Yannick, L., Jeanne, M. and Jean, F.S. (2011). In vitro modulation of reactive
oxygen and nitrogen intermediate (ROI/RNI) production in Crassostrea
gigas hemocytes. J. Biol.Sci. 7(9): 1401-11.
Yoon, W.J., Ham, Y.M., Kim, S.S., Yoo, B.S., Bulan, Y.J., Baik, J.S. et al.
(2009). Suppression of pro-inflammatory cytokines, iNOS and COX-2
expression by brown algae Sargassum micracanthum in RAW 264.7
macrophages. EurAsian Journal of BioSciences. 3: 130-143.
Yuandani., Jantan, I., Ilangkovan, M., Husain, K., and Chan, K.M. Inhibitory
effects of compounds from Phyllanthus amarus on nitric oxide production,
lymphocyte proliferation, and cytokine release from phagocytes. (2016).
Drug design, development and therapy. 10:1935-1945.
Yuandani., Jantan, I. and Husain K. (2017). 4,5,4′-rihydroxychalcone, 8,8′-

(ethene-1,2- diyl)-dinaphtalene-1,4,5-triol and rutin from Gynura segetum
inhibit phagocytosis, lymphocyte proliferation, cytokine release and nitric
oxide production from phagocytic cells. BMC Complementary and
Alternative Medicine. 17: 211.
87
Yu, G. J., Choi, I. W., Kim, G. Y., Kim, B. W., Park, C., Hong, S. H., et al.
(2015). Anti-inflammatory potential of saponins derived from cultured
wild ginseng roots in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7
macrophages. International journal of molecular medicine, 35(6): 1690-
1698.
Yu, L., Zhao, M., Yang, B., and Bai, W. (2009). Immunomodulatory and
anticancer activities of phenolics from Garcinia mangostana fruit pericarp.
Food Chem. 116: 969-973.
Yuwono, T. (2006). Teori dan aplikasi Polymerase Chain Reaction. Edisi I.

Yogyakarta: ANDI. Hal: 1, 11.
Zeng, J., Pan, X., Yang, K., Wei, Z., and Chen C. (2010). Experimental study on
the inhibitory effect on HBeAg and HBsAg excreted by 2215 cells of
different extracts of Picria fel-tarrae Lour. China Medical Herald.
7(16):27.
Zheng, L., Wang, M., Peng, Y. and Li, X. (2017). Physicochemical Characte-
rization of Polysaccharides with Macrophage Immunomodulatory
Activities Isolated from Red Ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer).
Journal of Chemistry. 3276430.
Zong, Y., Sun, L., Liu, B., Deng, Y.S., Zhan, D., Chen, Y.L. et al. (2012).
Resveratrol Inhibits LPS-Induced MAPKs Activation via Activation of the
Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway in Murine RAW 264.7
Macrophage Cells. Plos one. 7(8). 44107.
Zou, J.M., Wang, L.S., Niu, X.M., Sun, H.D. and Guo, Y.J. (2005).
Phenylethanoid glycosides from Picria fel-terrae Lour. J Integr Plant Biol.
47(5):632-636.
88
LAMPIRAN
Lampiran 1. Identifikasi tumbuhan
89
Lampiran 2. Surat persetujuan etik (ethical clearence)
90
Lampiran 3. Gambar Herba Poguntano
Keterangan : A. Tumbuhan Poguntano; B. Simplisia Herba Poguntano; C. Serbuk

Simplisia Herba Poguntano
91
Lampiran 4. Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi bertingkat
Serbuk Simplisia
dimaserasi dengan n-heksana
(3x perendaman)
Ampas Maserat
dimaserasi dengan etilasetat dipekatkan

(3x perendaman) dengan alat
Rotary
evaporator
Ampas Maserat Ekstrak n-heksana
dimaserasi dengan etanol dipekatkan diskrining

(3x perendaman) dengan alat
Rotary
evaporator Hasil
Maserat Ampas
dipekatkan Ekstrak Etilasetat

dengan alat
Rotary
evaporator diskrining
Ekstrak Etanol
Hasil
diskrining
Hasil
92
Lampiran 5. Bagan pembuatan media DMEM
DMEM Sachet 2 g Hepes 2 g NaHCO3
Dimasukkan ke dalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 mL aquabidest steril
Dihomogenkan menggunakan stirer magnet
Diatur pH 7,2-7,4 (HCL 1 N atau NaOH 1 N)

Ditambahkan aquabidest steril sampai 1 liter
Larutan Media
Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan
Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2-80C
Media DMEM
93
Lampiran 6. Bagan pembuatan media komplit (MK) DMEM
Fecal Bovine Penisilin- Fungizone DMEM AD

Serum (FBS) Streptomisin (amphotericin B 100 %
(10 %) (2 %) 0,5 %)
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK
Disimpan pada suhu 2-80C
Media Komplit (MK)

DMEM
94
Lampiran 7. Bagan penumbuhan sel
Sel RAW 264.7
Diambil dari Freezer

Diambil beberapa tetes
Konikel
Dimasukkan ke dalam konikel yang berisi DMEM
Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit
Dibuang supernatant
Ditambahkan 4 mL MK DMEM
Diresuspensi hingga homogen
Flask
Dimasukkan ke dalam flask
Ditambahkan 5 mL MK kedalam setiap flask
Dihomogenkan
Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
Diberi identitas pada flask
Disimpan dalam inkubator CO2
Sel RAW 264.7
95
Lampiran 8. Bagan panen sel
Sel RAW 264.7
Dipersiapkan dan dikondisikan
Diamati apakah sel telah konfluen 80%
Dibuang MK dari flask dengan mikropipet
Sel yang melekat
Dicuci sel 2 x dengan PBS
Ditambahkan 400 µL trypsine-EDTA 0,25%
Diinkubasi dalam incubator CO2 selama 5 menit
Ditambahkan 4 mL MK
Diresuspensi dengan mikropipet
Diamati sel dibawah mikroskop inverted
Diresuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
Ditransfer sel ke dalam tabung konikel
Panen Sel RAW 264.7
96
Lampiran 9. Bagan perhitungan sel
Kultur Sel RAW 264.7
Diambil 10 µL panenan sel
Dipipetkan ke dalam hemositometer
Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel RAW 264.7
97
Lampiran 10. Bagan pembuatan larutan uji
Ekstrak Herba Poguntano

(ENHP, EEAHP, EEHP)
Ditimbang sebanyak 5 mg
Dimasukkan ke dalam Polytube
Dilarutkan dalam 100 mL DMSO
Divortex
Dibuat pengenceran sampai diperoleh

konsentrasi 200; 100; 50; 25; 12,5 µg/mL
Larutan Uji
98
Lampiran 11. Bagan pengujian viabilitas sel
Sel RAW 264.7
Ditanam dengan Microplate 96-sumuran dengan

kepadatan 3x103 sel/well
Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang medium
Ditambahkan medium baru

Ditambahkan larutan uji
Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
Dicuci dengan PBS
Ditambahkan 100 µL dan 10 µL MTT (0,5 mg/mL)
Diinkubasi selama 4-6 jam
Ditambahkan reagen stoper
Dibungkus dengan aluminium foil
Dibiarkan selama 1 malam
Dibaca serapan dengan Microplate Reader (λ=595 nm)
Absorban
Dihitung % sel hidup
% Sel Hidup
99
Lampiran 12. Bagan pengujian produksi NO
Sel RAW 264.7

Dibuang medium
Ditambahkan medium baru

Ditambahkan LPS 1 µg/µL
Dipindahkan cairan kedalam plate baru
Ditambahkan Pereaksi Griess
Diinkubasi selama ±10 menit pada suhu kamar
Dibaca serapan dengan Microplate Reader (λ =595 nm)
Absorban
Dihitung kadar NO
Kadar NO
100
Lampiran 13. Bagan ekstraksi RNA
Sel RAW 264.7

Dibuang medium dan ditambahkan medium baru

Ditambahkan LPS 1 µg/µL, diinkubasi selama 6 jam

Dipindahkan kedalam tabung konikel
Ditambahkan 2 mL PBS
Dimasukkan kembali kedalam tabung konikel
Ditambahkan Tripsin 200 µL dalam plate tersebut
Diinkubasi selama 3 menit, diamati sel
apakah sudah terlepas semua
Cairan dalam konikel dimasukkan kembali kedalam plate,
diresuspensi dan pindahkan kembali ke tabung konikel
Ditambahkan 2 mL PBS, pindahkan dalam tabung konikel
Disentrifuge selama 5 menit 2500 rpm
Supernatan dibuang, endapan ditambahkan 1 mL PBS
Dipindahkan dalam mikrotube
RNA Sel RAW

264.7
101
Lanjutan. Bagan uji ekstraksi RNA
RNA Sel RAW 264.7
Ditambahkan 400 µL RB buffer

Ditambahkan 4 µL β-mercaptoetanol,
campuran dihomogenkan
Diinkubasi 5 menit pada suhu kamar
Ditambahkan 400 µL etanol 70% dalam ddH2O, kocok
kuat sampai endapan larut
Disiapkan kolom RB, di (+) 500 µL RB
Dipindahkan cairan dalam mikrotube tadi

Disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm selama 1
menit, filtrate dibuang
Dipindahkan cairan yang tersisa dan disentrifuge
12.000 rpm selama 1 menit, filtrate dibuang
Ditempatkan kolom RB pada mikrotube baru
Ditambahkan 400 µL WI buffer kedalam kolom rb, sentrifuge
12.000 rpm selama 30 detik, filtrate dibuang
Ditambahkan 600 µLWash buffer, disentrifuge 12.000 rpm
selama 30 detik, filtrate dibuang
Ditempatkan kembali kolom RB pada mikrotube, disentrifuge
12.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan matriks kolom
Ditempat kolom RB pada mikrotube 1,5 mL baru
Ditambahkan 50 µL RNAse free water,
diinkubasi selama 1 menit pada suhu kamar
Disentrifuge 12.000 rpm selama 1 menit
Dihitung konsentrasi RNA yang dihasilkan
Hasil isolasi RNA

Sel RAW 264.7
102
Lampiran 14. Bagan pembuatan cDNA
Hasil isolasi
RNA
Sel RAW 264.7
Ditambahkan DNAse/RNAse free water hingga vol.total 12 µL
Ditambahkan 8 µL Larutan campuran:

- 5x RT buffer 4 µL
- Random primer 1 µL
- dNTP 2 µL
- Rever Tra-Ace 1 µL
Diresuspensikan campuran tersebut
Dimasukkan dalam alat PCR
Diatur kondisinya:
- 30 0C selama 10 menit
cDNA
103
Lampiran 15. Bagan analisis ekspresi gen
cDNA
Ditambahkan PCR master mix dengan total 25 µL :

- GoTaq Green 12,5 µL
- Primer Forward 1 µL
- Primer Reverse 1 µL
- DNAse RNAse free water 9,5 µL
Divortex agar campurannya homogen
Dimasukkan dalam alat PCR
Diatur suhu sesuai kondisi gen (TNFα-, IL-6, β-actin, IL-1β, iNOS):
TNF-α, IL-6, β-actin IL-1β iNOS
D: 95 0C selama 2 menit 95 0C selama 2 menit 95 0C selama 2 menit
95 0C selama 30 detik 95 0C selama 45 detik 95 0C selama 30 detik
A: 55 0C selama 60 detik 62,50C selama 60dtik 60 0C selama 60 detik
E: 72 0C selama 60 detik 72 0C selama 60 detik 72 0C selama 60 detik
72 0C selama 5 menit 72 0C selama 5 menit 72 0C selama 5 menit
Produk PCR
(TNFα-,IL-6, β-
actin, IL-1β,
iNOS).
Keterangan : PCR : Polymerse Chain Reaction

D : Denaturasi
A : Annealing
E : Elongasi
104
Lampiran 16. Bagan pengujian elektroforesis
Produk PCR
(TNFα-, IL-6, β-
actin, IL-1β, iNOS)
Dimasukkan dalam sumuran gel agarosa 2% yang

telah dicetak pada piringan gel dengan formula :
- 2 gram serbuk agarosa + 100 mL TBE
- Dipanaskan dalam microwave selama 3-4
menit
- Ditambahkan flouroVue 4 µL.
Dimasukkan DNA ladder 100 Bp sebanyak 5 µL
Dilakukan elektroforesis 30-45 menit

dengan kecepatan 70 volt
Diambil foto gel hasil elektroforesis dengan

software gel doc
Gambaran pita
ekspresi gen
Dihitung berapa nilai densitas

gambaran pita ekspresi gen
Nilai densitas
ekspresi gen
Keterangan : PCR : Polymerse Chain Reaction

Bp : Base Pair
105
Lampiran 17. Sel RAW 264.7 dibawah mikroskop
b c
Keterangan : a. Sel RAW 264.7 dalam Hemositometer

b. Sel RAW 264.7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10x40)
c. Sel RAW 264.7 setelah diberi larutan uji (perbesaran 10x40)
106
Lampiran 18. Microplate-96 sumuran pengujian viabilitas sel
EEHP ENHP EEAHP Deksametason

a aa
b bb
c cc
d dd
ee
e
Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji serta
deksametason
a. 200 μg/mL
b. 100 μg/mL aa. 20 μg/mL
c. 50 μg/mL bb. 10 μg/mL
d. 25 μg/mL cc. 5 μg/mL
e. 12,5 μg/mL dd. 2,5 μg/mL
f. Kontrol sel ee. 1,25 μg/mL
g. Kontrol media
107
Lampiran 19. Microplate-96 sumuran pada uji produksi NO
(a)
(b)
Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji

(a). Uji produksi kadar NO sampel
(b). Uji produksi kadar NO larutan standar nitrit
108
Lampiran 20. Microplate-6 sumuran pada uji ekspresi gen
a b c
d e f
Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji

a. Kontrol sel
b. LPS
c. Ekstrak n-heksan herba poguntano
d. Ekstrak etilasetat herba poguntano
e. Ekstrak etanol herba poguntano
f. Deksametason
109
Lampiran 21. Perhitungan pembuatan larutan uji
Perhitungan pembuatan larutan ekstrak herba poguntano :

 Sampel : ENHP, EEAHP, EEHP.
 Konsentrasi : 12,5 ; 25; 50; 100; 200 µg/µL
 Sampel 5 mg dilarutkan dengan 100 µL DMSO
V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
C1 : Konsentrasi awal
V2 : Volume yang akan dibuat untuk pengenceran
C2 : Konsentrasi yang akan dibuat untuk pengenceran
 Cara pembuatan pengenceran larutan uji:

Dipipet 4 µl larutan induk (50.000 µg/µL) kemudian diadkan sampai 1000 µl
dengan MK DMEM. Selanjutnya dipipet kembali 500 µl (200 µg/µL) lalu
ditambahkan 500 µl MK DMEM dan seterusnya.
110
Perhitungan pembuatan larutan Deksametason :
 Berat bahan aktif deksametason : 0,5 mg

 0,5 mg deksametason dilarutkan dengan 100 µL DMSO
 Cara pembuatan larutan deksametason:

Serbuk tablet deksametason (0,5 mg deksametason) yang telah dihaluskan
lalu dimasukkan kedalam mikrotube dan dilarutkan dengan 100 µL DMSO.
Dihomogenkan dan dilakukan pengenceran sesuai dengan konsentrasi yang
digunakan.
V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
 Konsentrasi : 1,25 ; 2,5; 5; 10; 20 µg/µL
 Cara pembuatan pengenceran larutan deksametason:

Dipipet 4 µL larutan induk deksametason (5000 µg/µL) kemudian diadkan
sampai 1000 µL MK DMEM. Selanjutnya dipipet kembali 500 µL (20
µg/µL) deksametason lalu ditambahkan 500 µL MK DMEM dan seterusnya.
111
Perhitungan pembuatan larutan Lipopolisakarida :
 Konsentrasi Lipopolisakarida : 1 mg
LPS 1 mg dilarutkan dalam 1 ml aquadest
Buat stok, yang dibutuhkan : 0,1 µg/µL

Diambil 1 µL dari stok 1 µg/µL + aquadest 9 µL = 10 µL,
sehingga konsentrasi : 1 µg / 10 µL = 0,1 µg/µL
Jika yang diberikan 10 µl pada masing-masing well (96-well) maka pengenceran

1 µl (1 µg/µL) ad volume 100 µL
= 1 µg/100µL x 10 µL
= 0,1 µg
Dipipet 10 µL LPS dari konsentrasi (1 µg/µL)

+ 990 µL MK DMEM=total volume 1000 µL (10 µg/1000µL = 0,01 µg/µL)
Cara kerja :
Dipipet 10 µL LPS ad 1000 µL MK DMEM lalu dimasukkan kedalam masing-
masing sumuran (96-well) inkubasi 24 jam
 Konsentrasi Lipopolisakarida : 1 mg
LPS 1 mg dilarutkan dalam 1 ml aquadest
Untuk 6-wellplate :
20 µL konsentrasi (1 µg/µL) + 1980 µl MK DMEM = 2000 µL =2 mL
Konsentrasi : 0,01 µg/µL x 200 µL = 2 µg/µL
Cara kerja :
Dipipet 20 µL LPS ad 2000 µL MK DMEM lalu dimasukkan 1 ml kedalam
masing-masing sumuran (6-well) inkubasi 24 jam
112
Lampiran 22. Perhitungan penanaman sel :
Sel dihitung terlebih dahulu dengan menggunakan hemositometer.
Keterangan:
A : Jumlah sel pada bagian A
B : Jumlah sel pada bagian B
C : Jumlah sel pada bagian C
D : Jumlah sel pada bagian D
 Perhitungan sel untuk uji viabilitas sel
lalu dihitung jumlah sel yang akan ditanam pada well yang digunakan (96 well
plate) :
Jumlah well yang digunakan : 96 well 100

Jumlah sel yang akan ditanam : 3000 sel/well
Jumlah sel / mL : 2617500 /mL
Cara kerja :
Dipipet 115 µL sel di ad kan sampai 10 mL dengan MK DMEM lalu dimasukkan
100 µL kedalam masing-masing sumuran (96-well) inkubasi 24 jam.
 Perhitungan sel untuk uji produksi NO
plate) :
Jumlah well yang digunakan : 96 well 100

Jumlah sel yang akan ditanam : 3000 sel/well
Cara kerja :
Dipipet 250 µL sel di ad kan sampai 10 mL dengan MK DMEM lalu dimasukkan
100 µL kedalam masing-masing sumuran (96-well) inkubasi 24 jam.
113
 Perhitungan sel untuk uji ekspresi gen
plate) :
Jumlah well yang digunakan : 6 well

Jumlah sel yang akan ditanam : 500.000 sel/well
Cara kerja :
Dipipet 2,87 mL sel di ad kan sampai 12 mL dengan MK DMEM lalu
dimasukkan 2 ml kedalam masing-masing sumuran (6-well) inkubasi 24 jam
114
Lampiran 23. Perhitungan Viabilitas sel
Rumus perhitungan viabilitas sel :
Ekstrak n-heksana herba poguntano (ENHP)

Absorbansi Rata-rata
1 2 3 Absorbansi
Kontrol Sel 0,998 1,000 0,995 0,998
Kontrol Media 0,083 0,081 0,090 0,085
Konsentrasi Absorbansi % Sel Hidup % Sel Hidup

(µg/µL) 1 2 3 1 2 3 Rata-rata
200 0,708 0,706 0,705 68,27 68,05 67,94 68,09
100 0,844 0,845 0,850 83,17 83,28 83,83 83,42
50 0,868 0,870 0,874 85,80 86,02 86,45 86,09
25 0,902 0,910 0,911 89,52 90,40 90,51 90,14
12,5 0,932 0,930 0,925 92,81 92,59 92,04 92,48
Ekstrak etilasetat herba poguntano (EEAHP)

200 0,145 0,148 0,142 6,61 6,94 6,28 6,61
100 0,688 0,690 0,682 66,08 66,30 65.43 65,94
50 0.870 0,876 0,875 86,02 86,67 86,56 86,42
25 0,922 0,930 0,928 91,71 92,59 92,37 92,22
12,5 0,946 0,940 0,938 94,34 93,68 93,46 93,83
Ekstrak etanol herba poguntano (EEHP)

200 0,853 0,857 0,855 84,15 84,59 84,37 84,37
100 0,850 0,855 0,856 83,83 84,37 84,48 84,23
50 0,902 0,905 0,902 89,52 89,85 89,52 89,63
25 0,952 0,950 0,948 95,00 94,78 94,56 94,78
12,5 0,989 0,980 0,990 99,05 98,06 99,16 98,76
Deksametason
Absorbansi Rata-rata
1 2 3 Absorbansi
Kontrol Sel 0,875 0,880 0,878 0,878
Kontrol Media 0,087 0,087 0,086 0,087

20 0,510 0,518 0,520 53,52 54,53 54,78 54,28
10 0,629 0,630 0,635 68,56 68,69 69,32 68,86
5 0,682 0,685 0,690 75,26 75,64 76,27 75,72
2,5 0,751 0,755 0,767 83,99 84,49 86,01 84,83
1,25 0,812 0,805 0,810 91,70 90,81 91,45 91,32
115
Lampiran 24. Perhitungan Viabilitas sel dengan SPSS
Descriptives
95% Confidence
Std. Interval for Mean Mini
N Mean Std. Error Maximum
Deviation Lower Upper mum
Bound Bound
ENHP 12.50 3 92.4790 .39491 .22800 91.4980 93.4600 92.04 92.81
25.00 3 90.1424 .54029 .31194 88.8002 91.4846 89.52 90.51
50.00 3 86.0898 .33462 .19319 85.2586 86.9210 85.80 86.45
100.00 3 83.4246 .35209 .20328 82.5500 84.2992 83.17 83.83
200.00 3 68.0905 .16731 .09660 67.6749 68.5062 67.94 68.27
Total 15 84.0453 8.87890 2.29252 79.1283 88.9622 67.94 92.81
EEAHP 12.50 3 93.8299 .45601 .26328 92.6971 94.9626 93.46 94.34
25.00 3 92.2234 .45601 .26328 91.0907 93.3562 91.71 92.59
50.00 3 86.4184 .35209 .20328 85.5438 87.2930 86.02 86.67
100.00 3 65.9365 .45601 .26328 64.8037 67.0693 65.43 66.30
200.00 3 6.6083 .32859 .18971 5.7920 7.4245 6.28 6.94
Total 15 69.0033 33.89670 8.75209 50.2319 87.7747 6.28 94.34
EEHP 12.50 3 98.7587 .60324 .34828 97.2601 100.2572 98.06 99.16
25.00 3 94.7791 .21906 .12647 94.2349 95.3233 94.56 95.00
50.00 3 89.6313 .18971 .10953 89.1600 90.1025 89.52 89.85
100.00 3 84.2278 .35209 .20328 83.3532 85.1025 83.83 84.48
200.00 3 84.3739 .21906 .12647 83.8297 84.9180 84.15 84.59
Total 15 90.3541 5.93623 1.53273 87.0668 93.6415 83.83 99.16
Deksametason
95% Confidence
Std. Interval for Mean
N Mean Std. Error Minimum Maximum
Deviation Lower Upper
Bound Bound
1.25 3 91.3190 .45582 .26317 90.1867 92.4513 90.81 91.70
2.50 3 84.8293 1.05268 .60776 82.2143 87.4443 83.99 86.01
5.00 3 75.7269 .51093 .29499 74.4577 76.9961 75.26 76.27
10.00 3 68.8580 .40639 .23463 67.8485 69.8675 68.56 69.32
20.00 3 54.2773 .66896 .38623 52.6155 55.9391 53.52 54.78
Total 15 75.0021 13.35292 3.44771 67.6075 82.3967 53.52 91.70
116
Lampiran 25. Perhitungan pengujian produksi NO
Perhitungan pembuatan larutan standar nitrit :

 Konsentrasi lar. Standar nitrit : 1000 µM
 Konsentrasi pengenceran : 0,78125; 1,5625; 3,125; 6,25; 12,5 ; 25; 50; 100 µM
Rumus pengenceran : V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
 Cara pembuatan pengenceran larutan uji:

Dipipet 25 µl larutan induk (1.000 µM) kemudian diadkan sampai 250 µl
dengan Aquabidest steril. Selanjutnya dipipet kembali 125 µl (100 µM) lalu
ditambahkan 125 µl Aquabidest steril dan seterusnya.
117
Hasil nilai absorbansi Larutan standar nitrit :
Konsentrasi (µM) Absorbansi

100 0.121
50 0.081
25 0.061
12.5 0.050
6.25 0.047
3.125 0.044
1.5625 0.037
0.78125 0.033
0,150
y = 0.0008x + 0.041
Absorbansi
R² = 0.9995
0,100
0,050
0,000
0 20 40 60 80 100 120
Konsentrasi
(µg/µLdiperoleh
Hasil persamaan regresi yang ) : Y= 0,0008 x + 0,041
Rumus perhitungan kadar NO:
Keterangan : a = Nilai (a) dari persamaan regresi (Y= a x + b)

b = Nilai (b) dari persamaan regresi (Y= a x + b)
Konsentrasi Absorbansi Kadar NO

Sampel
(µg/µL) 1 2 3 1 2 3 Rata2
ENHP 25 0,049 0,047 0,052 10,00 7,50 13,75 10.42
12,5 0,101 0,092 0,104 75,00 63,75 78,75 72.50
EEAHP 25 0,056 0,066 0,075 18,75 31,25 42,50 30.83
12,5 0,103 0,111 0,121 77,50 87,50 100,00 88.33
EEHP 25 0,059 0,055 0,062 22,50 17,50 26,25 22.08
12,5 0,102 0,103 0,098 76,25 77,50 71,25 75.00
Deksametason 2,5 0,043 0,043 0,051 2,50 2,50 12,50 5.83
1,25 0,042 0,045 0,054 1,25 4,75 16,25 7.42
Kontrol Sel 0,042 0,045 0,043 1,25 5,00 2,50 2.92
LPS 0,125 0,119 0,121 105,00 97,50 100,00 100.83
118
Lampiran 26. Perhitungan pengujian produksi NO dengan SPSS
Descriptives
Kadar NO
95% Confidence
Std. Std. Interval for Mean
N Mean Minimum Maximum
Deviation Error Lower Upper
Bound Bound
ENHP 12.5 3 72.5000 7.80625 4.50694 53.1082 91.8918 63.75 78.75
ENHP 25 3 10.4167 3.14576 1.81621 2.6022 18.2312 7.50 13.75
EEAHP 12.5 3 87.9167 10.63113 6.13788 61.5075 114.3258 77.50 98.75
EEAHP 25 3 30.8333 11.88048 6.85920 1.3206 60.3461 18.75 42.50
EEHP 12.5 3 75.0000 3.30719 1.90941 66.7845 83.2155 71.25 77.50
EEHP 25 3 22.0833 4.38986 2.53448 11.1783 32.9883 17.50 26.25
Deksametason
3 7.4767 .05132 .02963 7.3492 7.6041 7.42 7.52
1.25
Deksametason
3 4.1800 .02646 .01528 4.1143 4.2457 4.16 4.21
2,5
LPS 3 98.7500 1.25000 .72169 95.6448 101.8552 97.50 100.00
KS 3 2.5000 2.16506 1.25000 -2.8783 7.8783 1.25 5.00
Total 30 41.1657 37.06960 6.76795 27.3236 55.0077 1.25 100.00
Homogeneous Subsets
Kadar NO
a
Tukey HSD
Subset for alpha = 0.05
Perlakuan N 1 2 3 4 5
KS 3 2.5000
Deksametason 2,5 3 4.1800
Deksametason 1.25 3 7.4767 7.4767
ENHP 25 3 10.4167 10.4167
EEHP 25 3 22.0833 22.0833
EEAHP 25 3 30.8333
ENHP 12.5 3 72.5000
EEHP 12.5 3 75.0000
EEAHP 12.5 3 87.9167 87.9167
LPS 3 98.7500
Sig. .827 .148 .738 .110 .483
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
119
Lampiran 27. Perhitungan pengujian ekspresi gen
Konsentrasi RNA yang diperoleh dari hasil ekstrasksi RNA :

KS : 312,8 ng/µL
LPS : 259,6 ng/µL
ENHP : 452,8 ng/µL
EEAHP : 406,4 ng/µL
EEHP : 435,6 ng/µL
Dexa : 359,2 ng/µL
Perhitungan RNA yang digunakan :
Rumus :
Total RNA yang dipakai 2000 ng.
 Cara pembuatan larutan cDNA :

Dipipet masing-masing RNA (hasil ekstraksi RNA) dari KS (6,40 µL), LPS
(7,70 µL), ENHP (4,42 µL), EEAHP (4,92 µL), EEHP (4,60 µL), Dexa
(5,57 µL) dan dimasukkan dalam mikrotube kemudian diadkan sampai 12
µL dengan ddH2O. Selanjutnya ditambahkan larutan campuran 8 µL (5x
RT buffer 4 µL, random primer 1 µL, dNTP 2 µL, Rever Tra-Ace 1 µL)
diresuspensi dan dimasukkan dalam alat PCR serta diatur kondisi PCRnya.
Konsentrasi cDNA yang diperoleh hasil pembuatan cDNA :

KS : 744 ng/µL
LPS : 880 ng/µL
ENHP : 820 ng/µL
EEAHP : 991,5 ng/µL
EEHP : 1040 ng/µL
Dexa : 1048 ng/µL
Kemudian cDNA diencerkan untuk mendapatkan konsentrasi 100 ng/µL
120
Rumus : V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
 Cara pembuatan pengenceran cDNA :

Dipipet masing-masing cDNA dari KS (6,72 µL), LPS (5,68 µL), ENHP (6,10 µL), EEAHP
(5,04 µL), EEHP (4,82 µL), Dexa (4,78 µL) dan dimasukkan dalam mikrotube kemudian
diadkan sampai 50 µL dengan ddH2O.
Konsentrasi cDNA yang diperoleh :

KS : 100 ng/µL
LPS : 101 ng/µL
ENHP : 109 ng/µL
EEAHP : 98 ng/µL
EEHP : 97 ng/µL
Dexa : 99 ng/µL
Keterangan : “ Syarat kadar cDNA : 100 ng/µL ± 10 % ”
Kemudian dilakukan pengujian ekspresi gen dengan campuran sebagai berikut :
GoTaq Green 12,5 µL
Primer Forward 1 µL
Primer Reverse 1 µL
cDNA 1 µL
Nuklease free water 9,5 µL
Jumlah 25 µL
Dipipet GoTaqGreen 12,5 µL lalu dimasukkan dalam mikrotube dan ditambahkan primer
forward (1 µL) dan primer reverse (1 µL) sesuai pengujian lalu ditambahkan masing-masing
cDNA 1 µL dan diadkan sampai 25 µL dengan Nuklease free water. Total campuran
disentrifuge dan dimasukkan dalam alat PCR dan diatur kondisinya sesuai pengujian ekspresi
gen yang dilakukan.
121
Hasil nilai densitas ekspresi gen
Nilai densitas
No Ekspresi gen Sampel Rata-rata
1 2 3
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 1,47 1,45 1,47 1,46
ENHP 1,09 1,07 1,08 1,08
1 TNF-α
EEAHP 1,01 1,04 1,05 1,03
EEHP 1,28 1,24 1,26 1,26
Dexa 1,21 1,24 1.25 1,23
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 2,61 2,59 2,63 2,61
ENHP 1,27 1,28 1,25 1,27
2 IL-6
EEAHP 1,27 1,29 1,30 1,29
EEHP 1,33 1,32 1,36 1,34
Dexa 0,78 0,76 0,80 0,78
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 4,02 4,04 4,02 4,03
ENHP 2,33 2,35 2,32 2,33
3 IL-1β
EEAHP 2,78 2,76 2,79 2,78
EEHP 1,79 1,80 1,81 1,80
Dexa 1,07 1,03 1,06 1,05
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 1,03 1,04 1,02 1,03
ENHP 0,69 0,65 0,68 0,67
4 iNOS
EEAHP 0,73 0,75 0,76 0,75
EEHP 0,69 0,70 0,67 0,69
Dexa 0,65 0,64 0,66 0,65
122
Lampiran 28. Perhitungan analisis ekspresi gen dengan SPSS
Descriptives
95%
Confidence
Std. Std. Interval for
N Mean Mean Minimum Maximum
Deviation Error
Lower Upper
Bound Bound
Beta_Actin KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.0400 .01000 .00577 1.0152 1.0648 1.03 1.05
ENHP 3 1.0867 .00577 .00333 1.0723 1.1010 1.08 1.09
EEAHP 3 1.0633 .00577 .00333 1.0490 1.0777 1.06 1.07
EEHP 3 1.0500 .02000 .01155 1.0003 1.0997 1.03 1.07
Dexa 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
Total 18 1.0400 .03361 .00792 1.0233 1.0567 1.00 1.09
TNF_AlphaKS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.4633 .01155 .00667 1.4346 1.4920 1.45 1.47
ENHP 3 1.0800 .01000 .00577 1.0552 1.1048 1.07 1.09
EEAHP 3 1.0333 .02082 .01202 .9816 1.0850 1.01 1.05
EEHP 3 1.2600 .02000 .01155 1.2103 1.3097 1.24 1.28
Dexa 3 1.2333 .02082 .01202 1.1816 1.2850 1.21 1.25
Total 18 1.1783 .16508 .03891 1.0962 1.2604 1.00 1.47
IL_6 KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 2.6100 .02000 .01155 2.5603 2.6597 2.59 2.63
ENHP 3 1.2667 .01528 .00882 1.2287 1.3046 1.25 1.28
EEAHP 3 1.2867 .01528 .00882 1.2487 1.3246 1.27 1.30
EEHP 3 1.3367 .02082 .01202 1.2850 1.3884 1.32 1.36
Dexa 3 .7800 .02000 .01155 .7303 .8297 .76 .80
Total 18 1.3800 .60027 .14149 1.0815 1.6785 .76 2.63
iNOS KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.0300 .01000 .00577 1.0052 1.0548 1.02 1.04
ENHP 3 .6733 .02082 .01202 .6216 .7250 .65 .69
EEAHP 3 .7467 .01528 .00882 .7087 .7846 .73 .76
EEHP 3 .6867 .01528 .00882 .6487 .7246 .67 .70
Dexa 3 .6500 .01000 .00577 .6252 .6748 .64 .66
Total 18 .7978 .16152 .03807 .7175 .8781 .64 1.04
IL_1 KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
Beta LPS 3 4.0267 .01155 .00667 3.9980 4.0554 4.02 4.04
ENHP 3 2.3333 .01528 .00882 2.2954 2.3713 2.32 2.35
EEAHP 3 2.7767 .01528 .00882 2.7387 2.8146 2.76 2.79
EEHP 3 1.8000 .01000 .00577 1.7752 1.8248 1.79 1.81
Dexa 3 1.0533 .02082 .01202 1.0016 1.1050 1.03 1.07
Total 18 2.1650 1.07883 .25428 1.6285 2.7015 1.00 4.04
123
Homogeneous Subsets
TNF_Alpha
Sampel N
1 2 3 4 5
Tukey KS 3 1.0000
HSDa EEAHP 3 1.0333
ENHP 3 1.0800
Dexa 3 1.2333
EEHP 3 1.2600
LPS 3 1.4633
Sig. .175 1.000 .364 1.000
IL_6
Sampel N
1 2 3 4 5
Tukey Dexa 3 .7800
HSDa KS 3 1.0000
ENHP 3 1.2667
EEAHP 3 1.2867
EEHP 3 1.3367
LPS 3 2.6100
Sig. 1.000 1.000 .696 1.000 1.000
iNOS
Sampel N
1 2 3 4 5
Tukey Dexa 3 .6500
HSDa ENHP 3 .6733
EEHP 3 .6867
EEAHP 3 .7467
KS 3 1.0000
LPS 3 1.0300
Sig. .054 1.000 .143
IL_1Beta
Sampel N 1 2 3 4 5 6
Tukey KS 3 1.0000
HSDa Dexa 3 1.0533
EEHP 3 1.8000
ENHP 3 2.3333
EEAHP 3 2.7767
LPS 3 4.0267
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
124
Lampiran 29. Gambar pita dari ekspresi gen ekstrak herba poguntano
TNF-α 374 Bp
400 Bp
300 Bp
200 Bp
100 Bp
Ladder a b c d e f Ladder
IL-6 269 Bp
300 Bp
200 Bp
100 Bp
a b c d e f Ladder
iNOS 311 Bp
400 Bp
300 Bp
200 Bp
100 Bp
IL-1 β 441 Bp
500 Bp
400 Bp
300 Bp
200 Bp
100 Bp
a b c d e f Ladder
β-actin 349 Bp
400 Bp
300 Bp
200 Bp
100 Bp
Keterangan : a. Deksametason 2,5 μg/mL
b. Ekstrak Etanol Herba Poguntano 25 μg/mL
c. Ekstrak Etilasetat Herba Poguntano 25 μg/mL
d. Ekstrak n-Heksan Herba Poguntano 25 μg/mL
e. LPS
f. KS
125
Lampiran 30. Gambar alat
b c
d
Keterangan: a. Laminar Air Flow
b. Inkubator CO2
c. Microscope inverted
d. Microplate reader
126
Lanjutan. Gambar alat
a b
d
Keterangan: a. Nano drop c. Elektroforesis
b. PCR multibox d. Gel Doc
127

Coba

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Coba

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

TESIS

AKTIVITAS IMUNOMODULATOR EKSTRAK HERBA

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI

Universitas Sumatera Utara

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI

Universitas Sumatera Utara

AKTIVITAS IMUNOMODULATOR EKSTRAK HERBA

Prof. Dr. Rosidah, M.Sr., Apt

Yuandani, S.Farm., M.Si., Ph.D., Apt

Prof. . Urip Harahap, pt Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.

Universitas Sumatera Utara

Nama Mahasiswa : Novycha Auliafendri

Nomor Induk Mahasiswa 167014031

Program Studi : Magister Ilmu Farmasi

Judul Tesis : Aktivitas Imunomodulator Ekstrak Herba

Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) Terhadap Sel

RAW 264.7 Secara In Vitro

Komisi Penguji Tesis

Ketua : Prof. Dr. Rosidah, M. Si., Apt.

Sekretaris : Yuandani, S.Farm., M.Si., Ph.D., Apt

Anggota : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si., M.Si., Apt

Dr. Aminah Dalimunthe, S.Si., M.Si., Apt

Universitas Sumatera Utara

pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak

tiada terhingga kepada:

Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas

kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister

Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister

Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang

telah memberikan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan

Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.

sebagai Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan,

ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian

sehingga tesis ini semakin baik.

6. Ibu Dr. Marline Nainggolan, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi

7. Bapak Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., S.U., Ph.D., Sp.Park., Kepala

Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada

yang telah mendidik penulis selama perkuliahan.

memberi semangat, saran dan nasehat.

bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

Medan, 23 Januari 2019

Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) merupakan salah satu tumbuhan obat di

Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) is one of the medicinal plants in North

HALAMAN JUDUL .................................................................................................i

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................12

BAB III METODE PENELITIAN.........................................................................44

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................59

BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN ...............................................................77

2.1 Sitokin dan fungsinya ...................................................................................18

1.1 Kerangka pikir penelitian ............................................................................... 11

1. Identifikasi tumbuhan .....................................................................................89

ADCC : Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity

1.1 Latar belakang

Imunitas didefinisikan sebagai pertahanan terhadap penyakit, terutama

penyakit infeksi. Kumpulan sel-sel, jaringan dan molekul-molekul yang berperan

terserang berbagai penyakit terutama penyakit kronik seperti kardiovaskular,

hidup. Pada keadaan normal, paparan mikroorganisme patogen terhadap tubuh

imun rendah, paparan mikroorganisme patogen dapat menimbulkan berbagai

dengan baik sehingga mampu menghadapi serangan zat asing seperti