ARTIKEL DI PERS +Model

J Pediatr (Rio J). 2016;xxx(xx):xxx---xxx

www.jped.com.br

ARTIKEL ASLI

Evaluasi metode western blotting untuk diagnosis

toksoplasmosis kongenital ,
Jaqueline Dario Capobiangosebuah,*,Thaís Cabral Monica b,Fernanda Pinto
Ferreirac,Regina Mitsuka-Bregano d,Italmar Teodorico Navarro d,João Luis Garcia
d,
Edna Maria Vissoci Reichee

a
Universitas Negeri Londrina (UEL), Pusat Ilmu Kesehatan, Departemen Pediatri dan Bedah Anak, Londrina, PR, Brasil
b
Universitas Negeri Londrina (UEL), Pusat Ilmu Pertanian, Program Pascasarjana Ilmu Hewan, Londrina, PR, Brasil
c
Universitas Negeri Londrina (UEL), Departemen Kedokteran Hewan Pencegahan, Laboratorium Zoonosis dan Kesehatan Masyarakat,
Londrina, PR, Brasil
d
Universitas Negeri Londrina (UEL), Pusat Ilmu Pertanian, Departemen Kedokteran Hewan Pencegahan, Londrina, PR , Brasil
dan
Universitas Negeri Londrina (UEL), Departemen Patologi, Analisis Klinis dan Toksikologi, Londrina, PR, Brasil Diterima 13 Oktober

2015; diterima 16 Februari 2016

KATA KUNCI anak memiliki antibodi yang mengenali setidaknya satu pita pada IgG
Bawaan blot berbeda dari ibu atau dengan intensitas yang lebih besar dari
Toksoplasmosis; Blotting Barat; Diagnosa; pita ibu yang sesuai, selama tiga bulan pertama kehidupan.
Serologi Hasil: 15 anak (15,1%) memenuhi kriteria toksoplasmosis kongenital
Abstrak dan 32 (32,3%) tidak terdiagnosis. Gejala diamati pada 12 (80,0%)
Tujuan: Mengevaluasi metode Western blotting untuk deteksi IgG anak dan yang paling sering adalah kalsifikasi serebral pada 9 (60,0%),
antiToxoplasma gondii (T. gondii) (IgG-WB) dalam serum anak suspek korioretinitis pada 8 (53,3%), dan hidrosefalus pada 4 (26,6%).
toksoplasmosis kongenital. Metode: Kami mendampingi 47 ibu dengan Antibodi IgM anti-T. gondii yang dideteksi dengan chemiluminescence
toksoplasmosis didapat pada kehamilan dan anak mereka, antara Juni (CL) ditemukan pada 6 (40,0%) anak-anak dan polymerase chain
2011 dan Juni 2014. IgG-WB dilakukan di rumah dan tes positif jika reaction (PCR) untuk mendeteksi T. gondii DNAditemukan

Silakan kutip artikel ini sebagai: Capobiango JD, Monica TC, Ferreira FP, Mitsuka-Breganó R, Navarro IT, Garcia JL, dkk. Evaluasi metode
Western blotting untuk diagnosis toksoplasmosis kongenital. J Pediatr (Rio J). 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2016.02.14 Studi
dilakukan di State University of Londrina, Londrina, PR, Brazil.
*
Sesuai penulis.
Email: jaquedc@uel.br (JD Capobiango).

http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2016.02.014
0021-7557/© 2016 Brazilian Society of Pediatrics. Diterbitkan oleh Elsevier Editora Ltda. Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY-
NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

JPED-423; Jumlah Halaman 8

ARTICLE IN PRESS +Model

2 Capobiango JD dkk.

positif pada 5 dari 7 yang dilakukan (71,4%). Sensitivitas IgG-WB adalah 60,0% [95% confidence
interval (CI) 32,3---83,7%] dan spesifisitas 43,7% (95% CI 26,7---62,3%). Sensitivitas IgG-WB masing-masing
meningkat menjadi 76,0 dan 89,1% bila dikaitkan dengan penelitian anti-IgMT. gondii atau PCR
.
 Kesimpulan: IgG-WB menunjukkan sensitivitas yang lebih besar daripada deteksi IgM anti-T. gondii;
oleh karena itu, dapat digunakan untuk diagnosis toksoplasmosis kongenital yang berhubungan dengan
penanda infeksi kongenital lainnya.
© 2016 Masyarakat Pediatri Brasil. Diterbitkan oleh Elsevier Editora Ltda. Ini adalah
artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY-NC-NDhttp://creativecommons.org/licenses/
(by-nc-nd/ 4.0/).

KATA KUNCI Toksoplasmosis Pada janin yang terinfeksi, antibodi IgG dan IgM yang diproduksi
Bawaan ; melawan determinan antigenik T. gondii mungkin berbeda
blotting Barat; Diagnosa; Sebagian besar anak dengan gangguan neurologis
Serologi toksoplasmosis kongenital (CT).1
Semua anak dianggap tersangka yang ibunya menderita
toksoplasmosis akut selama kehamilan; oleh karena itu, anak-
anak ini harus menjalani pemeriksaan serologis dengan deteksi
antibodi untuk anti-Toxoplasma gondii (T. gondii).1,2
Namun, diagnosis serologisdikonfirmasi T. gondii yang
infeksimelalui deteksi antibodi IgM dan/atau IgA spesifik
terhadap parasit tidak terjadi pada semua bayi baru lahir. 1,3---5
Oleh karena itu, antibodi IgG terhadap T. gondii dalam sampel
serum serial harus dianalisis dan anak tetap di bawah
pengawasan rawat jalan, yang dapat memakan waktu
berbulan-bulan sampai diagnosis definitif. 1.6
dari antibodianti-T. gondii yang IgG dan IgMterdeteksi dalam
serum ibu, termasuk neosintesis antibodi spesifik. Dengan
demikian, anak-anak dengan CT dengan non-reaktivitas dalam
tes konvensional untuk deteksi IgM telah diselesaikan pada
bulan-bulan pertama kehidupan melalui metode western blot
(WB).7---9
Ada kebutuhan untuk diagnosis dini dan cepat menggunakan
metode kompleksitas rendah yang memungkinkan laboratorium
referensi untuk toksoplasmosis membedakan hasil meragukan
yang diperoleh dengan menggunakan metode serologi
konvensional rutin, seperti imunofluoresensi tidak langsung
(IIF), enzyme-linked immunoassay (ELISA) ) , dan immunoassay
mikropartikel menggunakan chemiluminescence (CL). Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi metode WB
untuk deteksi antibodi IgG terhadap T. gondii (IgG-WB) dalam
serum anak dan ibunya dengan didapat

Pendahuluan
Evaluasi metode Western Blotting untuk diagnosis
toksoplasmosis kongenital

Abstrak
Tujuan: Untuk mengevaluasi metode Western Blotting untuk deteksi
IgG anti-Toxoplasma gondii (T. gondii) (IgG-WB) dalam serum anak
suspek kongenital toksoplasmosis. Metode: Kami mengikuti 47 ibu
dengan toksoplasmosis didapat selama kehamilan dan anak-anak
mereka, antara Juni 2011 dan Juni 2014. IgG-WB dilakukan secara
internal dan tes dianggap positif ketika anak memiliki antibodi yang
mengenali setidaknya satu pita di tempat IgG yang berbeda. dari pita
ibu atau dengan intensitas yang lebih besar dari pita ibu yang sesuai,
selama 3 bulan pertama kehidupan.
Hasil: 15 anak (15,1%) memenuhi kriteria diagnosis toksoplasmosis
kongenital dan 32 (32,3%) tidak termasuk diagnosis. Gejala diamati
pada 12 anak (80,0%) dan yang paling sering adalah kalsifikasi
serebral pada sembilan (60,0%), korioretinitis pada delapan (53,3%)
dan hidrosefalus pada empat (26,6%).IgM anti-AntibodiT. gondii yang
dideteksi dengan chemiluminescence (QL) ditemukan pada enam
anak (40,0%) dan polymerase chain reaction (PCR) untuk mendeteksi
DNA T. gondii positif pada lima dari tujuh reaksi yang dilakukan
(71,4%). Sensitivitas IgG-WB adalah 60,0% [interval kepercayaan (CI)
95%, 32,3 hingga 83,7%] dan spesifisitasnya adalah 43,7% (95% CI,
26,7% hingga 62,3%). Sensitivitas IgG-WB meningkat menjadi 76,0 dan
89,1% bila dikaitkan dengan pencarian IgM anti-T. gondii atau CPR,
masing-masing.
Kesimpulan: IgG-WB menunjukkan sensitivitas yang lebih besar
daripada deteksi IgM anti-T. gondii; oleh karena itu, dapat digunakan
untuk diagnosis toksoplasmosis kongenital yang berhubungan dengan
penanda infeksi kongenital lainnya.
© 2016 Masyarakat Pediatri Brasil. Diterbitkan oleh Elsevier Editora
Ltda. Ini adalah artikel Akses Terbuka di bawah lisensi CC BY-NC-ND
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
ARTICLE IN PRESS +Model
Western blotting untuk toksoplasmosis kongenital 3
toksoplasmosis pada kehamilan untuk membantu diagnosis
awal CT.
Metode
Subyek
Populasi terdiri dari wanita dengan dugaan toksoplasmosis
didapat pada kehamilan dan anak-anak mereka, dibantu di
Rawat Jalan Penyakit Menular Pediatric, antara Juni 2011 dan
Juni 2014. Penelitian ini termasuk anak-anak yang ibunya
menunjukkan reaktivitas untuk anti T. gondii IgM selama pra
-perawatan kelahiran. Sampel darah anak pasangan / ibu
dikumpulkan secara bersamaan selama tiga bulan pertama
kehidupan anak dan disimpan di -20 ◦C untuk WB. Kelompok
kontrol terdiri dari anak-anak yang ibunya menunjukkan
toksoplasmosis akut selama kehamilan, tetapi tidak memenuhi
kriteria untuk CT.2,10,11 Pada periode ini, 47 anak dan ibunya
dipantau. Dari jumlah tersebut, 15 (15,1%) anak didiagnosis
dengan CT dan 32 (32,3%), diagnosis ini dikeluarkan. Wanita
hamil menerima spi ramycin atau sulfadiazine ditambah
pirimetamin dan asam folinat sampai melahirkan. Anak-anak
yang dicurigai terinfeksi menerima sulfadiazin ditambah
pirimetamin dan asam folinat sampai diagnosis definitif.
Kriteria diagnostik pada anak-anak
CT dipertimbangkan ketika anak menunjukkan
peningkatananti-spesifikT. gondii titer IgGdalam sampel
berurutan pada bulan-bulan pertama hidupnya
dan/ataupersisten T. gondii titer IgGsetelah 12 bulan
kehidupan dan/atau reaktivitas untuk anti T. gondii IgM
dan/atau chorioretinitis dan/atau lesi sistem saraf pusat (SSP)
dengan reaktivitas untuk IgG dan/atau positif untuk T. gondii
DNAmenggunakan polymerase chain reaction (PCR). 2,10,11
Tes serologis untuk deteksianti-T. gondii IgM dan IgG
Tes serologis yang dilakukan selama perawatan prenatal dan
sampel dari anak-anak dilakukan dengan metode laboratorium
rutin konvensional.anti-T. gondii Antibodi IgGditentukan
dengan Indirect immunofluores cence (IIF)12 (Immunoblot,
Biolab-Mérieux, Rio de Janeiro, RJ, Brazil), dengan T. gondii
diperoleh dari cairan asites dari tikus yang terinfeksi, dan
chemiluminescence (CL) (Arsitek, Sys memiliki Abbott---
Wiesbaden, Jerman) dengan antigen rekombinan p30 (SAG1)
dan p35 (GRA8) dari T. gondii. anti-T. gondii Antibodi IgMjuga
dideteksi menggunakan CL (Architect, System Abbott---
Wiesbaden, Germany) dengan antigen p30 dan total lisat T.
gondii.
T. gondii Antigen
Lima mencit betina albino, berumur 45 sampai 60 hari dan
berat antara 25 dan 40 g digunakan untuk memperoleh takizoit
galur RH dari T. gondii. Hewan-hewan diinokulasi dengan rute
intraperitoneal dengan suspensi takizoit hidup (10 5/ mL) dalam
larutan garam steril. Empat puluh delapan jam setelah
ARTICLE IN PRESS +Model
MCMCMC PC NC ABCD
inokulasi, eksudat diperoleh dengan mencuci rongga
peritoneum dengan 3,0 mL larutan garam steril. Sampel
dilewatkan melalui jarum 27G untuk pecahnya sel inang.
Kemudian, mereka disentrifugasi dan kursi distandarisasi pada
109 takizoit/mL dengan menghitung dalam ruang Neubauer. 13
Metode IgG-WB
Protein T. gondii yang akan digunakan dalam IgG-WB
dikuantifikasi menggunakan Lowry et al. Metode, 14 dan 12% gel
poliakrilamida digunakan untuk pemisahan elektroforesis
protein dengan transfer protein berikutnya ke membran
nitroselulosa (iBlot®, Gel Transfer System California, USA).
Kertas nitroselulosa diwarnai dengan Ponceau dan, setelah
dicuci dengan air, strip nitroselulosa dipotong dan diblokir
dengan susu skim 5% ditambah tris buffered saline (TBS)
dengan Tween®. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan TBS
dan susu skim 5% kemudian serum pasien ditambahkan TBS
dengan Tween (Sigma---Aldrich, MO, USA) dan susu skim 5%,
dilakukan pencucian, dan ditambahkan IgG anti-human
terkonjugasi (Invitrogen, Life Technologies --- CA, USA)
diencerkan dalam TBS dengan Tween (Sigma --- Aldrich, MO,
USA) dan susu skim 5%. Setelah pencucian lebih lanjut, penulis
menambahkan substrat kromogen diaminobenzidine (DAB) 0,2%
(Acrös Organics, Thermo Fisher Scientific --- Geel, Bel gium)
dan hidrogen peroksida (100 L). Ketika pita divisualisasikan,
reaksi dihentikan dengan air suling. Sampel kontrol positif dan
negatif untuk anti-T. gondii dimasukkan dalam setiap tes.
Tes dianggap positif jika anak menghasilkan antibodi yang
mengenali setidaknya satu pita protein yang berbeda dari ibu
atau dengan intensitas yang lebih tinggi dari pita ibu yang
sesuai (Gbr. 1), yang mencirikan neosintesisanti-T. gondii
antibodi IgG.15---18 Untuk mengontrol subjektivitas pembacaan,
dua pengamat independen membaca pola IgG-WB secara
membabi buta dan tanpa mengetahui hasil serologis
sebelumnya dari tes konvensional; ada kesesuaian di 100,0%
dari hasil.
Spesifisitas metode IgG-WB ditentukan dengan 26 sampel
serum yang diperoleh dari individu seroneg aktif
toksoplasmosis (anti-T. gondii IgG dan IgM non reaktif oleh CL)
dan dengan seroreaktivitas terhadap antibodi patogen lain,
seperti Treponema pallidum (tidak . = 5), Trypanosoma cruzi
(n = 5), Leishmania spp. (n = 2), Paracoc cidioides brasilienses
(n = 5), atau seroreaktivitas terhadap penanda serologis
gangguan autoimunitas, seperti anti bodi antinuklear (n = 5)
dan antibodi untai ganda anti-DNA (n = 4).
PCR untuk deteksi DNA T. gondii DNA
diekstraksi dari sel darah tepi anak, dikumpulkan dengan EDTA
sebagai antikoagulan hingga tiga bulan setelah lahir,
menggunakan kit EasyPrep DNA Mini I (Easy Gen, Favorgen
Biotech --- Austria ). Amplifikasi DNA T. gondii dilakukan
dengan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Homan et
al.19 Primer Tox4 (CGCTGCAGGGAGGAAGAC GAAAGTTG) dan
Tox5 (CGCTGCAGACAGTGCATCTGGATT) digunakan untuk
amplifikasi fragmen 529 pasangan basa (bp; GenBank No.
AFI46527) T. gondii DNA. PCR dilakukan dalam volume akhir
22,5 L, mengandung 2,5 L dari
4 Capobiango JD dkk.
kDa
 160
154
130
121

kDa

94
68

72
kDa
101
104 94
78
77
76
67
64
58
 16 14
64

58 46 44

39 31

25 22

16 11

77

67 58

37 30

23 20

13 6
31
50 46 44 40 37 33 30

25 23

20 13

10 6
45 40 27
55 50

M: ibu; C: anak; PC: kontrol positif; NC: kontrol negatif

Gambar 1 Pengenalan pola protein strain RH Toxoplasma gondii oleh antibodi IgG menggunakan metode Western blotting (IgG WB) yang
dilakukan dengan sampel serum dari ibu dengan toksoplasmosis didapat selama kehamilan dan anak-anak mereka dengan dugaan
toksoplasmosis kongenital. (A) IgG-Western blotting positif untuk toksoplasmosis kongenital. Pita yang sama dikenali oleh antibodi IgG,
dengan intensitas yang lebih kuat pada sampel anak dibandingkan dengan sampel ibu. (B) IgG-Western blotting positif untuk
toksoplasmosis kongenital. Pita berbeda yang dikenali oleh IgG dari sampel anak dibandingkan dengan sampel ibu. (C) IgG Western
blotting negatif untuk toksoplasmosis kongenital. Pita yang sama dikenali oleh antibodi IgG dari sampel anak dan ibu. M, ibu; C, anak;
PC, kontrol positif; NC, kontrol negatif.

DNA diekstraksi dari sampel; 1.0 L 1,0 mM untuk setiap primer,
100 mM dNTP (Invitrogen, Life Technologies --- CA, Amerika
Serikat), 60 mM Tris---HCl (pH 9.0), 15 mM (NH4) 2SO4, 2 mM
MgCl2, dan 0,25 L Taq DNA polimerase (Invitrogen, Life
Technologies --- CA, Amerika Serikat), juga dilengkapi dengan
7.75 L air Milli Q. Amplifikasi dilakukan dengan 35 siklus dalam
siklus termal (PTC-100, MJ Research --- CA, Amerika Serikat),
menggunakan kondisi siklus berikut: 7 menit pada 94 Cuntuk
denaturasi pada siklus 1, diikuti oleh 33 siklus dari 1 menit
pada 94 C untuk denaturasi, 1 menit pada 55 ◦C untuk anil, dan
1 menit pada 72 ◦C untuk perpanjangan; Siklus 35 itu fol
melenguh dengan ekstensi akhir dari 10 menit pada 72 ◦aliquot
C.dari masing-masing produk PCR Apakah Dikenakan
elektroforesis di 2% gel agarosa. Strain RH Tachyzoites
(107/mL) DNA-nya diekstraksi untuk digunakan sebagai kontrol
positif. Air dianggap sebagai kontrol negatif. Sampel kontrol
positif dan negatif untuk T. gondii dimasukkan dalam setiap
tes.
Analisis
statistik Analisis statistik dilakukan pada GraphPad Prism 5
(GraphPad Software, Inc. --- San Diego, Amerika Serikat).
Variabel egoris kucing dinyatakan sebagai bilangan mutlak (n)
dan persentase (%) dan dianalisis dengan uji chi-kuadrat atau
uji eksak Fisher. Parameter sensitivitas, spesifisitas, nilai
prediksi positif (PPV), dan nilai prediksi negatif (NPV) dihitung,
dengan interval kepercayaan (CI)
sebesar 95,0%. Nilai p <0,05 dianggap signifikan secara
statistik.
Studi ini disetujui oleh Komite Etika untuk Penelitian yang
Melibatkan Manusia. Semua ibu berpartisipasi secara sukarela
dan menandatangani informed consent.
Hasil
Dari 15 anak dengan CT, 12 (80,0%) bergejala dan memenuhi
kriteria klinis untuk definisi penyakit (sembilan dengan
kalsifikasi serebral, delapan dengan korioretinitis, dan empat
dengan hidrosefalus), enam (40,0%) menunjukkan reaktivitas
untuk anti-T. gondii IgM, lima (33,3%) menunjukkan
peningkatan anti-T. gondii IgG pada bulan-bulan pertama
kehidupan, dan satu (6,7%) menunjukkan persistensianti-T.
gondii titer IgGdalam sampel berurutan. Lima dari tujuh anak
(71,4%) yang menjalani PCR untuk mendeteksi T. gondii
DNAmenunjukkan hasil positif (Tabel 1).
Di antara 15 anak dengan CT, tes IgG-WB positif pada
sembilan (60,0%), dan di antara 32 anak tanpa CT, tes positif
pada 18 (56,3%), yang menghasilkan sensitivitas 60,0% (95 % CI:
32,3---83,7%, spesifisitas 43,7% (95% CI: 26,4---62,3%), PPV
33,3% (95% CI: 16,5---54,0%), dan NPV 70,0% (95% CI: 45,7---
88,1%) (p = 0,05875). Di antara anak-anak dengan CT, dua
menunjukkan IgG-WB negatif dan positif untukanti-T. gondii
IgM; lima anak menunjukkan IgG-WB positif dan negatif
untukanti-T. gondii IgM,

ARTICLE IN PRESS +Model

Western blotting adalah bawaan toksoplasmosis 5 Tabel 1 klinis dan laboratorium karakteristik 15 anak-anak dengan toksoplasmosis

kongenital, dari Juni 2011 hingga Juni 2014.

KasusAnti-IgGT. 1 PCR sampel Mengikuti Barat Tandadan Gejala pada

gondii IgM CL IIF IgGb nodab bulan 1 kehidupan

1 NR Negatif 1: 512.000 NR ↓ Negatif chorioretinitis + kalsifikasi + hidrosefalus

2 Positif NR 1: 32.000 926,8 ↑ Positif chorioretinitis + kalsifikasi 3 Positif NR 1: 512.000 NR ↓ Positif Vitritis (chorioretinitis setelah) +
kalsifikasi + hidrosefalus
4 NR negatif <01:16 NR ↑ Positif chorioretinitis 5 negatif NR 1: 1024 162,0 ↔ Positif pengapuran 6 negatif Positif NR 200,0 ↑
Positif asimtomatik 7 negatif Positif 1: 32.000 147,5 NR negatif Hydrocephalus 8 negatif negatif 1: 8000 312,0 ↑ negatif
asimtomatik 9 negatif positif 1: 512.000 175,6 ↓ Negatif asimtomatik 10 positif positif 1: 512.000 188.1 ↓ positif chorioretinitis
11 Negatif positif 1: 32.000 139,8 NR positif pengapuran 12 Negatif positif NR 84,8 ↑ Negatif Vitritis + kalsifikasi 13 positif NR
NR 200,0 NR positif chorioretinitis + kalsifikasi 14 Negatif NR NR 173,9 ↓ Positif chorioretinitis + kalsifikasi + hidrosefalus
15 Positif NR NR 1655,0 ↓ Negatif Chorio retinitis + kalsifikasi

PCR, reaksi berantai polimerase untuk deteksi DNA Toxoplasma gondii; IFI, imunofluoresensi tidak langsung untuk deteksi IgG anti-T. gondii;
CL, microparticle chemiluminescence immunoassay untuk mendeteksi anti-T. gondi IgG, diekspresikan dalam UI/mL; NR, belum terealisasi;
↑,peningkatan kadar antibodiantiT.gondii IgG dalam sampel serum serial; ↔,kegigihan tingkat antiT. gondii IgG dalam sampel serum selama
tindak lanjut; ↓,penurunan antibodi.
Sampel
dikumpulkan dalam 1 bulan kehidupan.
b
Sampel dikumpulkan dalam 3 bulan pertama kehidupan, dengan semua anak dalam pengobatan.

dan F

empat menunjukkan kedua tes c

10 dengan
P 94
20 P 78 P 58
sebagai positif, dan empat intensitas yang lebih besar
berkisar antara 1 hingga 160
menunjukkan daripada yang disajikan oleh
kDa. Di antara sembilan anak
40 sampel ibu mereka. Pita
kedua tes sebagai negatif. dominan yang dikenali oleh
Berat molekul (MW) protein yang antibodi IgG dari sampel anak-
dikenali oleh anak dengan CT dantidak

30 dan

anti-T. gondii IgG dalam serum

u

melalui IgG-WB, tujuh

anak-anak dengan CT berkisar
menunjukkan pita yang berbeda
antara 2 hingga 94 kDa, dan
dari
mengenai protein yang dikenali
P 44
oleh P 31 P 30 P 13

0
%
yangterinfeksi ditunjukkan pada
q
Gambar.
,

antibodi IgG dalam serum yang

dan

r yang

tidak terinfeksi, MW diamati dalam serum ibu dan

dua menunjukkan pita
Adapun 26 sampel dari pasien dengan penyakit lain, dua Dengan toksoplasmosis kongenital Tanpa toksoplasmosis kongenital

tidak menunjukkan reaktivitas dan 24 menunjukkan reaktivitas

untuk antibodi IgG yang mengenali protein dengan MW berkisar
antara 17 hingga 118 kDa. Yang paling sering dikenali adalah
p22 (11/40.7%), p34 (9/33,3%), p38 (8/29,6%), p94 (6/22,2%),
p56 (5/18,5%), dan p30 (5/ 18,5%).
Analisis hasilantiT. gondii IgMmenggunakan sensitivitas CL
40,0% (95% CI: 16,3---67,6%), spesifisitas 100,0% (95% CI:
89,1---100,0%), PPV sebesar 100,0% (95% CI: 54,1---100,0%),
dan NPV sebesar 78,1% (95% CI: 62,4---89,4%; p = 0,0005).
Untuk deteksi DNA parasit menggunakan PCR, sensitivitasnya
adalah 71,4% (95% CI: 29,0---96,3%), spesifisitas 100,0% (95%
CI: 69,2---100,0%), PPV 100,0% (95% CI: 47,8---100,0%), dan
NPV sebesar 83,3% (95% CI: 51,6---98,0%; p = 0,0034).
Sensitivitas dan spesifisitas IgG-WB bila dikaitkan dengan
penanda CT lainnya --- seperti adanya anti-T.
Antigenic bands (kDa)
Gambar 2 Distribusipaling sering Toxoplasma gondii yang
proteindikenali oleh Antibodi IgG dalam serum anak-anak dengan
toksoplasmosis kongenital dan anak-anak tanpa penyakit, menurut
berat molekulnya (kDa) (p > 0,05 untuk semua protein yang
dikenali).
gondii IgM, PCR positif, dan gejala klinis --- ditunjukkan pada
Tabel 2.
IgG-WB positif pada enam dari sembilan pasien (66,7%)
dengan cedera mata dan pada tiga dari enam pasien (50,0%)
dengan CT tanpa cedera mata (p = 0,6224), dengan sensitivitas
66,7% (95% CI: 29,9 ---92,5%), spesifisitas 50,0% (95% CI: 11,8---
88,2%), PPV 66,7% (95% CI: 29,9---92,5%), dan NPV 50% (95%
CI : 11,8---88,2%).

ARTIKEL DI PERS +Model

6 Capobiango JD dkk.

Tabel 2 Sensitivitas dan spesifisitas metode Western blotting toksoplasmosis kongenital.

untuk deteksiantiToxoplasma gondii IgG(IgG- memungkinkan deteksi 94,0%, 94,0%, dan 100,0% kasus,
WB),antiToxoplasma gondii uji IgM, polymerase chain reaction masing-masing.24
(PCR) terhadap Toxoplasma gondii, dan adanya gejala klinis Hasil IgG-WB yang diperoleh dalam penelitian ini mendekati
yang kompatibel dengan toksoplasmosis kongenital, dituduh yang ditemukan oleh penulis lain, yang melaporkan situasi
secara seri dan paralel, menurut ada atau tidak adanya 73,5%.18 Penulis yang sama ini melaporkan bahwa kombinasi
 IgG-WB dan IgM-WB meningkatkan sensitivitas hingga 86,5%. 18
Uji Sensitivitas (%) Sensitivitas yang lebih rendah yang
diperoleh dalam penelitian ini dapat
Spesifitas (%) dijelaskan, sebagian, karena semua pasien
IgG-WB+ 60,0 43,7 IgM T. gondii+ 40,0 100,0 IgM anti-T.
gondii atau IgG-WB+ 76.0 43,7 IgM anti-T. gondii dan IgG-
WB+ 24.0 100,0 PCR+ 71,7 100,0 PCR + atau IgG-WB+ 89,1
43,7 PCR + dan IgG-WB+ 42,6 100,0 Gejala+ 80,0 100,0
Gejala + atau IgG-WB+ 92,0 43,7 Gejala + dan IgG-WB+
48,0 100,0
IgG-WB, Barat blotting untuk diagnosis infeksi kongenital dengan
deteksi antibodi IgG; anti-Toxoplasma gondii IgM terdeteksi oleh
chemiluminescence; Gejala, adanya gejala dan/atau tanda klinis
yang sesuai dengan plasmosis tokso kongenital; +, tes positif.
Diskusi
Diagnosis CT merupakan tantangan dalam praktek klinis,
karena sensitivitasanti-T. gondii IgMmenggunakan metode
serologi konvensional sangat bervariasi, dari 48,3% menjadi
75,0%.3----5 Tidak adanyaanti-T. gondii IgMdapat dibenarkan
oleh fakta bahwa infeksi janin terjadi pada awal kehamilan
atau sebagai akibat dari pengobatan ibu untuk tokso plasmosis
yang dilakukan selama dua trimester pertama kehamilan, yang
akan menyebabkan penyumbatan atau keterlambatan respon
imun.20 Selain itu, keterlambatan atau tidak adanya respon
imun yang dapat dideteksi dengan metode standar (dosis IgG
dan IgM atau WB) dapat dikaitkan dengan perbedaan respon
imun individu. Kerugian lain dari penanda ini adalah
keterlambatan dalam pengumpulan sampel, dengan penurunan
positif IgM setelah 30 hari pertama kehidupan. 21 Oleh karena
itu, seringkali perlu untuk memantau hasil serologis dengan
identifikasi titer anti-stabil atau meningkatT. gondii IgG yang,
yang menunda diagnosis dan menyebabkan ketidakpastian bagi
keluarga.16 Dalam konteks ini, IgG-WB dapat digunakan untuk
membandingkan pola antibodi terhadap T. gondii dalam
sampel serum dari ibu dan anak mereka, dan menentukan
apakah antibodi ditransmisikan secara pasif atau disintesis
oleh janin atau bayi dalam kasus CT.15
Penulis lain telah mengamati kontribusi yang lebih tinggi
dari IgG WB untuk diagnosis CT pada bulan-bulan pertama
kehidupan.22.23 Selain itu, hubungan IgG-WB dengan metode
serologis lainnya dapat meningkatkan kemungkinan diagnosis.
Dalam kohort anak-anak, sensitivitas IgG-WB adalah 82,4% dan
meningkat menjadi 85,7% ketika IgG-WB dikaitkan dengan
keberadaan IgM dan/atau IgA anti-T. gondii menggunakan
ELISA.16 Studi lain menunjukkan bahwa kombinasi tes
imunocapture IgA dan IgM, analisis pola IgG dan IgM WB, dan
kombinasi kedua teknik
asam folinat selama penyelidikan, dapat menghambat
neosintesis antibodi.20
ARTICLE IN PRESS +Model
Western blotting untuk toksoplasmosis kongenital 7
bulan kehidupan, anak ini, yang menunjukkan cincin parut
korioretinitis, tetap non-reaktif terhadapanti-T. gondii yang
antibodi IgGdievaluasi dengan CL dan IIF; namun, kepositifan
ditunjukkan untuk IgG-WB.
CT dengan non-reaktivitas untuk anti-T. gondii IgG dan IgM
mungkin hasil dari pengobatan toksoplasmosis pada ibu dan
neonatus.20 Perawatan anak selama satu tahun setelah
kelahiran juga dapat menyebabkan non-reaktivitas antibodi.
Namun, pada sebagian besar kasus ini terdapat deteksianti-T.
gondii IgGsegera setelah penghentian pengobatan, yang
disebut efek rebound.1.7.20
Dalam penelitian ini, Pasien 1 menunjukkan non-
reaktivitas, tetapi menunjukkananti-terdeteksiT. gondii yang
antibodisetelah penghentian pengobatan. Demikian pula untuk
dengan dugaan CT diobati dengan
sulfadiazin, pirimetamin, dan
Strategi lain untuk meningkatkan sensitivitas metode yang
diusulkan ini adalah pengulangan IgG-WB selama tiga bulan
pertama kehidupan.8 Dalam sebuah penelitian dengan sampel
yang dikumpulkan saat lahir, sensitivitasanti-T. gondii
IgMdengan metode konvensional (ISAGA dan ELISA) adalah
52,0% dan untuk WB (dengan IgG dan IgM) adalah 67,0%.
Dengan menggabungkan dua metode, sensitivitas meningkat
menjadi 78,0% saat lahir dan 85,0% pada tiga bulan kehidupan,
dengan deteksi 94,0% kasus CT.17
Penelitian ini menganalisis beberapa sampel berurutan IgG-
WB. Di antara anak-anak yang terinfeksi, dengan hasil negatif
palsu pada sampel pertama oleh IgG-WB, dua dari enam
(33,3%) anak-anak memiliki protein yang berbeda dalam
kaitannya dengan sampel ibu dalam koleksi kedua, yang
mencirikan neosintesis anti-T. IgG, yang membenarkan
perlunya pengulangan IgG-WB dalam sampel serial.
Dalam analisis sebelumnya, waktu pengambilan sampel ibu
mempengaruhi hasil tes IgG-WB, karena ibu yang menerima
pengobatan toksoplasmosis selama kehamilan mungkin tidak
lagi bereaksi terhadap antigen T. gondii pada akhir periode
setelah kelahiran, dengan salah -hasil negatif 16 Dalam
penelitian ini, fenomena ini diamati pada satu ibu dari anak
yang terinfeksi. Namun, sebagian besar ers menunjukkan
peningkatan jumlah pita yang dikenali dalam sampel yang
dikumpulkan segera setelah penghentian pengobatan saat
melahirkan.
Dalam penelitian sebelumnya, MW pita antigenik yang
dikenali oleh IgG neonatus dengan CT bervariasi dari 21 hingga
116 kDa.18 Dalam penelitian ini, serupa dengan yang ditemukan
oleh penulis lain,15,16 antibodi yang ditemukan dengan
frekuensi tinggi pada anak-anak adalah antibodi yang melawan
protein dengan MW lebih tinggi dari 30 kDa. Perbedaan dalam
MW protein yang diakui yang dilaporkan oleh penelitian
sebelumnya dapat dijelaskan oleh persyaratan metodologis
yang berbeda, seperti persiapan T. gondii antigen, kondisi
elektroforesis pada gel akrilamida, dan serum. 20 Penjelasan
lain adalah keragaman genetik di antara strain T. gondii, yang
dapat menyebabkan pengenalan protein yang berbeda, selain
fakta bahwa beberapa individu menyajikan IgG yang mengenali
beberapa protein, sementara yang lain, protein tunggal.25
Dalam penelitian ini, IgG-WB juga berguna dalam
menunjukkan sintesis aktifanti-T. gondii IgGpada pasien
dengan IgG non-reaktif dengan metode konvensional. Pada
Pasien 4, dengananti-T. gondii titer IgG< 1:16 oleh IIF pada
sampel pertama dan sedikit peningkatan pada sampel
berurutan (maksimum 1:64), hilangnya antibodi IgG diamati
saat diuji dengan metode CL dan IIF setelah pengobatan.
Namun, dengan metode IgG-WB, dimungkinkan untuk
menunjukkan anti-T. gondii IgG, yang mengenali protein p22
dan p46, yang tidak ada dalam serum ibu. Setelah 12
Pasien 4, Pasien 6, 8, dan 9 juga menunjukkan penurunan
antibodi ke titik non-reaktivitas dan dengan demikian tetap
setelah penghentian pengobatan. Ada kemungkinan bahwa
pasien ini tidak lagi mengenali protein p30 dan p35 yang ada
dalam tes CL, yang membenarkan non-reaktivitas dalam tes ini
dengan evolusi infeksi.
Oleh karena itu, daripada hanya mengevaluasi
persistensianti-T. gondii IgGoleh CL, penulis menyarankan
penggunaan IgG-WB dalam pemantauan serologis, karena anak
yang terinfeksi dapat menghasilkan antibodi terhadap protein
lain dari situs tersebut dan dengan demikian tetap positif
setelah 12 berumur beberapa bulan. Dalam kasus ini, tidak
adanyaanti-T. gondii IgGdi CL mungkin tidak mengecualikan
CT, yang juga akan membenarkan spesifisitas yang lebih
rendah dari IgG-WB yang ditemukan selama penelitian ini
dibandingkan dengan penelitian sebelumnya. 16----18,22,23 Namun,
penelitian lebih lanjut harus dilakukan sebelum menggunakan
IgG-WB dalam pemantauan serologis.
Menurut sebuah penelitian yang dilakukan pada populasi
Brasil, pasien dengan IgM reaktif dengan metode WB (IgM-WB)
menunjukkan risiko lebih besar untuk cedera makula aktif
dibandingkan pasien dengan IgM-WB negatif. 18 Namun, tidak
ada perbedaan signifikan yang ditemukan antara kepositifan
IgG-WB dan adanya cedera makula, seperti dalam penelitian
ini. Tidak jelas apakah ada protein spesifik dariprotein
tersebut T. gondii yang strainterkait dengan cedera mata dan
apakahdapat menjelaskan frekuensi cedera mata yang lebih
besar pada anak-anak Brasil dengan CT dibandingkan di negara
lain.26 Keterbatasan utama untuk penelitian ini adalah tidak
adanya evaluasi sampel dengan IgM-WB, yang dapat
meningkatkan sensitivitas diagnosis tes.
Prosedur teknis untuk IgG-WB memiliki kompleksitas yang
rendah dan dengan biaya yang tersedia, yang membuatnya
layak dalam rutinitas laboratorium. Kelemahan dari metode in-
house adalah kelambatannya, yang dapat dikurangi dengan
standarisasi satu set reagen yang akan diproduksi di Brasil. The
semi automation of the method with the use of a program for
the reading of band intensity viewed though WB would
facilitate the reading and the reproducibility of results. 20
The results reinforce the usefulness of the IgG-WB method
for serological evaluation of patients with CT, with greater
sensitivity than the detection of anti-T. gondii IgM by
conventional methods. Therefore, IgG-WB can be used for the
early diagnosis of CT in combination with other markers of the
congenital T. gondii infection.
Funding
Program of Support to the University Extension of the Min istry
of Education of Brazil (PROEXT --- MEC/SESu) and the
National Council of Scientific and Technological Develop ment
(CNPq).
Conflicts of interest
The authors declare no conflicts of interest.
Acknowledgments
ARTICLE IN PRESS +Model
12. Camargo ME. Improved technique of indirect immunofluores cence
for serological diagnosis of toxoplasmosis. Rev Inst Med Trop Sao
Paulo. 1964;6:117---8.
13. Lundén A. Immune responses in sheep after immunization with
Toxoplasma gondii antigens incorporated into iscoms. Vet Para
sitol. 1995;56:23---5.
14. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem.
1951;193:265---75.
15. Chumpitazi BF, Boussaid A, Pelloux H, Racinet C, Bost M, Fleuret
AG. Diagnosis of congenital toxoplasmosis by immunoblot ting and
relationship with other methods. J Clin Microbiol. 1995;33:1479---
85.
16. Gross U, Lüder CG, Hendgen V, Heeg C, Sauer I, Weidner A, et al.
Comparative immunoglobulin G antibody profiles between mother
and child (CGMC Test) for early diagnosis of congenital
toxoplasmosis. J Clin Microbiol. 2000;38:3619---22.
17. Rilling V, Dietz K, Krczal D, Knotek F, Enders G. Evaluation of a
commercial IgG/IgM western blot assay for early postnatal
diagnosis of congenital toxoplasmosis. Eur J Clin Microbiol Infect
Dis. 2003;22:174---80.
18. Machado AS, Andrade GM, Januário JN, Fernandes MD, Carneiro AC,
Carneiro M, et al. IgG and IgM western blot assay for diagnosis of
To all the patients and family members who contributed to the
fulfillment of this work, to the Postgraduate Program in Health
Sciences of the Universidade Estadual de Londrina (UEL), and
to the Postgraduate Program in Animal Sciences of the UEL.
References
1. Remington JS, McLeod R, Wilson CB, Desmonts G. Toxoplasmo sis.
In: Remington JS, Klein JO, Wilson CB, Nizet V, Maldonado YA,
editors. Infectious disease of the fetus and newborn infant. 7 ed.
Philadelphia: Elsevier Saunders; 2011. p. 918---1041.
2. American Academy of Pediatrics. Report of committee on infec
tious diseases. Toxoplasma gondii infections (Toxoplasmosis). In:
American academy of pediatrics. Red book. 28 ed. Illinois: Elk
Grove Village; 2009. p. 667---72.
3. Lebech M, Andersen O, Christensen NC, Hertel J, Nielsen HE,
Peitersen B, et al. Feasibility of neonatal screening for toxoplasma
infection in the absence of prenatal treat ment. Danish Congenital
Toxoplasmosis Study Group. Lancet. 1999;353:1834---7.
4. Lago EG, Neto EC, Melamed J, Rucks AP, Presotto C, Coelho JC, et
al. Congenital toxoplasmosis: late pregnancy infections detected
by neonatal screening and maternal serologicaltesting at delivery.
Paediatr Perinat Epidemiol. 2007;21:525---31.
5. Capobiango JD, Mitsuka-Breganó R, Navarro IT, Rezende Neto CP,
Casella AM, Lopes-Mori FM, et al. Congenital toxoplasmosis in a
reference center of Paraná, Southern Brazil. Braz J Infect Dis.
2014;18:364---71.
6. Rodrigues IM, Castro AM, Gomes MB, Amaral WN, Avelino MM.
Congenital toxoplasmosis: evaluation of serological methods for
detection of anti-Toxoplasma gondii IgM and IgA antibodies. Mem
Inst Oswaldo Cruz. 2009;104:434---40.
7. Pinon JM, Dumon H, Chemla C, Franck J, Petersen E, Lebech M, et
al. Strategy for diagnosis of congenitaltoxoplasmosis: evalua tion
of methods comparing mothers and newborns and standard
methods for postnatal detection of immunoglobulin G, M and A
antibodies. J Clin Microbiol. 2001;39:2267---71.
8. Tissot-Dupont D, Fricker HH, Pinchart MP, Bost-Bru C, Thomas PA,
Pelloux H. Usefulness of Western Blot in serological follow up of
newborns suspected of congenital toxoplasmosis. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2003;22:122---5.
9. Remington JS, Thulliez P, Montoya JG. Recent developments for
diagnosis of toxoplasmosis. J Clin Microbiol. 2004;42:941---5. 10.
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenc¸ão à Saúde.
Departamento de Ac¸ões Programáticas Estratégicas. Atenc¸ão à saúde
do recém-nascido: guia para os profissionais de saúde: intervenc¸ões
comuns, icterícia e infecc¸ões. 2 ed. Brasília: Min istério da Saúde;
2013. p. 109---22.
11. Lebech M, Joynson DH, Seitz HM, Thulliez P, Gilbert RE, Dutton
GN, et al. Classification system and case definitions of Toxo
plasma infection in immunocompetent pregnant women and their
congenitally infected offspring. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.
1996;15:799---805.
8 Capobiango JD et al.
congenital toxoplasmosis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2010;105:757---
61.
19. Homan WL, Vercammen M, De Braekeleer J, Verschueren H.
Identification of a 200- to 300-fold repetitive 529 bp DNA frag ment
in Toxoplasma gondii, and its use for diagnostic and quantitative
PCR. Int J Parasitol. 2000;30:69---75.
20. Sensini A. Toxoplasma gondii infection in pregnancy: opportu nities
and pitfalls of serological diagnosis. Clin Microbiol Infect.
2006;12:504---12.
21. Lago EG, Oliveira AP, Bender AL. Presence and duration of anti
Toxoplasma gondii immunoglobulin M in infants with congenital
toxoplasmosis. J Pediatr (Rio J). 2014;90:363---9.
22. Magi B, Migliorini L. Western blotting for the diagnosis of con
genital toxoplasmosis. New Microbiol. 2011;34:93---5. 23. L'Ollivier C,
Wallon M, Faucher B, Piarroux R, Peyron F, Franck J. Comparison of
mother and child antibodies that target high molecular-mass
Toxoplasma gondii antigens by immunoblotting improves neonatal
diagnosis of congenital toxoplasmosis. Clin Vaccine Immunol.
2012;19:1326---8.
24. Gamgneux FR, Commere V, Schaefer CT, Camet JD. Performance of
a Western Blot assay to compare mother and newborn anti
Toxoplasma gondii antibodies for the early neonatal diagnosis of
congenital toxoplasmosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.
1999;18:648---54.
25. Sun X, Lu H, Jia B, Chang Z, Peng S, Yin J, et al. A compara tive
study of Toxoplasma gondii seroprevalence in three healthy
Chinese populations detected using native and recombinant
antigens. Parasit Vectors. 2013;6:241---7.
26. Gilbert RE, Freeman K, Lago EG, Bahia-Oliveira LM, Tan HK, Wallon
M, et al. European Multicentre Study on Congenital Toxoplasmosis
(EMSCOT). Ocular sequelae of congenital toxo plasmosis in Brazil
compared with Europe. PLoS Negl Trop Dis. 2008;2(e277):1---7.