ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA OBA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

TUGAS 2

RESUME JURNAL ISOLASI SENYAWA BAHAN ALAM MENGGUNAKAN HPLC

OLEH:

NAMA :FEBRIZA SAFIRA

STAMBUK 15020190021

KELAS :C1

DOSEN PENDAMPING :Apt. Faradiba Abdul Rasyid, S.Si., M.S.i., Ph.D

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

MAKASSAR

2021
 Validasi Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman Sambiloto (Andrographis
paniculata Nees) Menggunakan HPLC

Yandi Syukri, Agung Endro Nugroho, Ronny Martien , & Endang Lukitaningsih

‘Program Studi Farmasi Universitas Islam Indonesia 2 Bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik,
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada 3 Bagian Farmasetika, Fakultas Farmasi Universitas
Gadjah Mada 4 Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada 5 Mahasiswa
S3 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada’

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan analisis kuantitatif untuk penentuan kadar isolat
andrographolide dari tanaman sambiloto (Andrographis paniculata) dan pelarut yang berbeda
untuk studi awal untuk pembuatan Self Nanoemulsifying Drug Delivery System (SNEDDS)
menggunakan KCKT. Pemisahan menggunakan kolom Sunfire C18 dengan campuran isokratik
metanol dan air dengan perbandingan 6: 4, v/v sebagai fase gerak. Metode untuk menentukan
isolat andrographolide menunjukkan presisi yang memadai, dengan RSD lebih kecil dari 1%.
Akurasi dianalisis dengan menambahkan andrografolid standar, dan didapatkan nilai perolehan
kembali yang baik untuk semua konsentrasi yang digunakan.

PENDAHULUAN

Andrografolid merupakan senyawa bioaktif dari tanaman sambiloto (Andrographis

paniculata Ness) yang telah memiliki riwayat digunakan sebagai pengobatan di negara-negara
Asia seperti anelgesik, antipiretik, antiinflamasi, antikanker, hipoglikemia dan antihiperlipidemia
[1,2,3,4]. Dilaporkan bahwa terdapat lebih dari 20 diterpenoid dan 10 flavonoid sebagai senyawa
aktif yang diperoleh dari ekstrak etanol atau metanol dari seluruh tanaman, daun dan batang dari
A. paniculata. Andrografolid (C20H30O5 ) merupakan diterpenoid utama yang terdapat pada
tanaman A. paniculata. Diterpenoid utama lainnya adalah deoksiandragrafolid, neoandragrafolid,
14-deoksi-11,12-didehidroandragrafolid dan isoandrografolid. Pengembangan obat dari
tumbuhan membutuhkan isolasi dan pemurnian senyawa yang berkhasiat dari campuran multi-
komponen kompleks untuk menghasilkan produk dengan kemurnian tinggi. Sampai saat ini
penggunaan isolat andrographolide sebagai bahan baku obat sangat jarang ditemukan, padahal
sudah banyak dikaji aktivitas farmakologinya. Selain itu kemurnian isolat andrografolid juga
diperlukan untuk memastikan efek farmakologinya. Dengan demikian, penentuan kadar isolat
andrographolide harus dapat ditentukan menggunakan KCKT yang tervalidasi. Validasi metode
analisis harus memenuhi semua persyaratan aplikasi analisis yang menjamin keandalan dari hasil
analisis. Untuk itu pengujian harus menunjukkan spesifisitas, linearitas, presisi, sensitifitas,
akurasi dan batas kuantitasi yang memadai untuk analisis [8]. Penelitian ini bertujuan untuk
mengembangkan analisis kuantitatif untuk penentuan kadar isolat andrographolide dari tanaman
sambiloto dan pelarut yang berbeda untuk studi awal untuk pembuatan SNEDDS menggunakan
KCKT.

Metode Penelitian

Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat andrografolid,
andrografolid standar (Sigma-Aldrich, kemurnian 98 %), pelarut untuk fase gerak seperti metanol
dan air serta bahan untuk pembuatan SNEDDS seperti Myritol 318 (Phapros Tbk), Capryol 90
(PT. Menjangan Sakti), Labrasol (PT. Menjangan Sakti), Labrafil M1944 (PT. Menjangan Sakti),
Chremophore RH 40 (PT. Bahtera Adi Jaya), asam oleat (PT. Brataco), isopropil miristat (PT.
Brataco), tween 80 (PT. Brataco), tween 20 (PT. Brataco), PEG 400 (PT. Brataco), dan propilen
glikol (PT. Brataco).

Cara Kerja

Analisis kuantitatif isolat andrografolid

Data diperoleh dengan perangkat lunak Empower 3.0. Pemisahan dilakukan dengan
menggunakan kolom C18 sunfire (150 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm)
menggunakan campuran isokratik metanol dan air dengan perbandingan 6 : 4 v/v
sebagai fase gerak. Volume injeksi 20 µL, kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/menit dan
detektor diatur pada panjang gelombang 229 nm

Pembuatan larutan standar

Larutan stok standar dengan konsentrasi 200 µg/mL dibuat menggunakan
andrografolid standar dengan pelarut metanol kualitas KCKT. Dengan menggunakan
 larutan stok, suatu seri larutan standar kerja dibuat untuk penentuan kurva baku pada
jarak konsentrasi tertentu

Kesesuaian sistem Uji

kesesuaian sistem dilakukan untuk menjamin pengkuran menggunakan kromatografi

sesuai dengan analisis yang diharapkan. Parameter kromatografi meliputi area puncak,
waktu retensi, plat teoritis dan faktor tailing diukur dan ditetapkan standar deviasinya
(RSD) masing-masing.

Parameter validasi

Metode validasi sesuai dengan pedoman ICH yang meliputi linearitas, presisi, akurasi,
selektifitas, batas deteksi dan batas kuantitasi. Analisis regresi linear digunakan untu
menghitung slope, intersep, dan koefisien regresi (r2 ) untuk plot kalibrasi. Evaluasi ini
berdasarkan area puncak. Penentuan presisi dilakukan dengan 3 konsentrasi berbeda dari
larutan isolat andrografolid yang diinjeksikan sebanyak 3 replikasi pada 3 waktu yang
berbeda pada hari yang sama dan pengulangan yang sama pada 3 hari yang berbeda untuk
memperoleh variasi intra-day dan inter-day. Akurasi ditentukan dari uji perolehan
kembali (recovery) dengan menambahkan sejumlah yang telah diketahui pada konsentrasi
80, 100 dan 120 % pada plasebo dengan analisis kuantitatif replikasi dengan metode yang
diusulkan. Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung berdasarkan respon terhadap signal
to noise dengan rasio 3 : 1 dan 10 : 1 yang secara eksperimental diverifikasi dengan
mengencerkan konsentrasi larutan standar sampai respon ratarata dengan 6 kali replikasi

Analisis Isolasi andrografolid dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Dari kromatogram tersebut terlihat bahwa andrografolid standar memiliki AUC 501613
dengan waktu retensi 5,340 menit, sedangkan isolat andrografolid memiliki AUC 430024 dan
waktu retensi 4,360 menit. Sedangkan parameter kesesuaian sistem dapat dilihat pada tabel 1.
Dari tabel diperoleh bahwa nilai RSD untuk AUC 0,267 dan 0,098 untuk waktu retensi. Nilai
yang diperoleh kurang dari 2 sehingga membuktikan bahwa reprodusibilitas dari parameter ini
sangat baik. Puncak asimetri yang baik dari andrografolid dinyatakan dengan nilai RSD 1,232 ±
0,023 dari faktor tailing. Resolusi yang diperoleh 4,890 ± 0.157 dengan nilai yang lebih dari 2
serta faktor retensi (kapasiltas) 2,414 ± 0,004 (lebih dari 2) menunjukkan kesesuaian sistem yang
baik.
 PROSEDUR KERJA
High Performance Liquid Chromatography ( HPLC )

Alat dan bahan

1. Bahan: Herba sambiloto yang berasal dari Kediri, Banyuwangi dan Surabaya yang sudah
dikeringkan dan dijadikan serbuk. andrografolid, zat pembanding (ex. Sigma); Metanol pro
HPLC (E. Merck); Aquabidestilata (ex); Asam Fosfat pa. (E.Merck).
2. Alat: Seperangkat alat HPLC Perkin Elmer PE 2000 system; kolom HPLC ODS 25 cm × 0,5
cm, dengan prekolom 5 cm × 0,5 cm; Injektor Rheodyne dengan sampel loop 20 ml.

Prosedur kerja :

1. Preparasi sampel KCKT:

Andrografolid pembanding dilarutkan dalam metanol pa; Herba sambiloto 0,5 g
ditambah 5,0 ml metanol pa, dikocok dengan penggetar “ultrasonic” selama 15 menit,
saring dengan filter “Whatman” 0,2 mm.

2. Kondisi Alat KCKT:

Eluasi dilakukan gradien pada kondisi awal solvent A (As-fosfat 0,1 N dalam
aquabidest): solven B (Metanol pro HPLC) = 90 10; kemudian program gradien linier
selama 35 menit menuju 100% Metanol, dilanjutkan 15 menit metanol 100%, kemudian
diakhiri kembali kekondisi awal dalam 5 menit biarkan selama 5 menit; kromatogram
direkam selama total waktu 60 menit.

3. Rancangan kerja validasi KCKT:

Rancangan kerja validasi KCKT meliputi :
a. pengujian selektivitas, dilakukan dengan sampel ekstrak herba sambiloto berbagai
konsentrasi, dihitung linieritasnya dari puncak andrografolid;
b. Penentuan Dl (limit deteksi), LK (limit kuantitasi) dan linieritas limit;
c. Penentuan akurasi dengan metode adisi mulai dari prosedur ekstraksi herba sambiloto,
dihitung beberapa recoverynya;
d. Penentuan kadar andrografolid dalam sampel ekstrak herba sambiloto untuk penentuan
presisi.
ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA OBA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

TUGAS 3

RESUME JURNAL PENETAPAN KADAR SENYAWA DALAM SUATU BAHAN ALAM

MENGGUNAKAN METODE DENSITOMETER

OLEH:

NAMA : FEBRIZA SAFIRA

STAMBUK 15020190021

KELAS : C1

DOSEN PENDAMPING : Apt. Faradiba Abdul Rasyid, S.Si., M.S.i., Ph.D

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

MAKASSAR

2021
Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak Etanol Daun Kelor (Moringa Oleifera Lam)
Dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis Densitometri
Annisa Fatmawati 1 ,Nurwani Purnama Aji2
1)Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan, Universitas Alma Ata
2)Akademi Farmasi Al-Fatah Bengkulu
Email : annisafatma20@gmail.com

Daun kelor (Moringa oleifera Lam) mengandung senyawa flavonoid yang dapat digunakan
untuk antikanker, antidiabetes dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan
kandungan flavonoid total pada daun kelor dengan standar kuersetin. Penentuan
kandungan kuersetin dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis densitometrik
(TLC-Densitometri). Kuersetin standar dibuat dengan konsentrasi 1mg / ml dan sampel
ekstrak 250mg / ml dalam metanol, dilakukan scan panjang gelombang dan pembacaan
serapan luas area untuk penetapan kadar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rendemen
ekstrak etanol daun kelor (EEDK) 13,65%, dan kadar flavonoid total 0,45 gram / 100 gram
ekstrak dengan persentase 0,45%. Fase gerak yang digunakan toluena: etil asetat: asam
format, 5: 4: 0,2 (v / v / v) memberikan hasil elusi yang baik. Daun kelor dapat digunakan
untuk pengobatan bahan alami dengan kandungan flavonoid.

Pendahuluan
Daun kelor (Moringa oleifera Lam) mengandung senyawa flavonoid yang dapat memiliki
efek antikanker dan antioksidan (1). Kuersetin merupakan flavonoid yang terdapat dalam
daun kelor, yang secara invivo memiliki aktivitas antidiabetes bersama senyawa asam
klorogenik dan moringinine (2). Flavonoid adalah metabolit sekunder yang disintesis oleh
tanaman dengan berbagai aktivitas biologis. Sifat fisik dan biokimia flavonoid, mampu
berpartisipasi dalam interaksi tanaman dengan organisme lain (mikroorganisme, hewan,
dan tanaman lain) dan reaksi terhadap tekanan lingkungan (3). Penelitian ini bertujuan
untuk menentukan kandungan flavonoid total pada daun kelor dengan standar kuersetin.
Penentuan kandungan kuersetin dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis
densitometrik (TLC-Densitometri)
MATERIAL DAN METODE
Bahan uji yang digunakan adalah daun kelor (Moringa oleifera) yang diperoleh
dari Kranggan, Tasikmadu, Karanganyar, Jawa Tengah. Alkohol 70% digunakan untuk
pelarut ekstraksi daun kelor. Silica gel GF-245 sebagai fase diam, fase gerak (toluena:
etil asetat: asam format) dan pelarut ekstrak methanol pro-analisis (p.a) untuk uji
kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri. Peralatan yang digunakan dalam
penelitian ini yaitu alat-alat gelas (pyrex), rotary evaporator, magnetic stirer dan
Densitometer (TLC Scanner Camag)

PROSEDUR KERJA

Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kelor (EEDK)

Tanaman segar kelor diperoleh dari daerah Kranggan, Tasikmadu, Karanganyar,

Jawa Tengah dan dilakukan determinasi di Laboratorium Biologi, FMIPA, Universitas
Ahmad Dahlan, Yogyakarta. Tanaman segar kelor dicuci bersih dan dilakukan sortir
terhadap bagian daun kelor. Kemudian dilakukan pengeringan simplisia daun dengan
oven. Simplisia kering daun kelor diperoleh dengan cara pengeringan dalam oven pada
suhu 40˚C sampai kadar air kurang dari 10% dari bobot awal dan diserbuk dengan
menggunakan blender (5). Maserasi daun kelor dilakukan menurut penelitian Saputra (6)
dengan modifikasi perbandingan pelarut. Daun kelor tua segar dibersihkan, dicuci,
dikeringkan kemudian dihaluskan dan diayak dengan mesh no. 12 sampai diperoleh
serbuk kering. Sebanyak 1,316 kg serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 70% (1:5)
selama 3 hari, kemudian disaring. Ampas dimaserasi kembali dengan larutan etanol 70%
(remaserasi satu kali). Maserat kemudian diuapkan dengan menggunakan vacum rotary
evaporator (suhu 60oC, kecepatan ) hingga tidak ada uap ethanol yang menetes pada labu
alas bulat penampung kaca rotary evaporator dan dilanjutkan dengan waterbath pada suhu
50oC hingga didapat ekstrak kental etanol 70% (7). Ekstrak kental yang didapat,
dilakukan perhitungan rendemen ekstrak berdasarkan rumus: % rendemen = (berat
ekstrak kental (gram)/ berat sampel (gram)) x 100% (8).
Penetapan Kadar kuersetin pada Ekstrak Etanol Daun Kelor

Penetapan kadar kuersetin pada EEDK berdasarkan penelitian Gupta et al., (9)
dengan modifikasi konsentrasi standar dan sampel sesuai orientasi penelitian di
Laboratorium Kimia Analisis UAD. Timbang sampel EEDK sejumlah 250 mg, kemudian
dilarutkan dalam metanol pro-analisis (pa) dalam labu takar 10 ml. Standar kuersetin
sebanyak 25,0 mg dilarutkan dalam 25 ml pelarut metanol pro-analisis. Larutan dipipet
0,5; 1,0; 1,5; 2,0 dan 2,5 ml dilarutkan dalam metanol p.a dengan labu takar 10 ml (8).
Fase diam menggunakan pelat Silica Gel F254 10 x 10 cm dipanaskan dalam oven suhu
100oC selama 10 menit. Sampel dan standar ditotolkan (0,5 mikro liter) pada pelat, pada
jarak 10 mm (10). Jarak elusi yang digunakan 80 mm dilakukan pada suhu kamar (28 ±
2°C), dengan fase gerak toluena: etil asetat: asam format, 5: 4: 0,2 (v / v / v), dalam
chamber Camag kaca yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak selama 20
menit. Fase diam (plate) KLT yang telah dikeringkan di dalam lemari asam, selanjutnya
di masukkan ke dalam alat Densitometer (Camag TLC Scanner) yang terinstalasi dengan
software komputer bernama Win Cats, menggunakan lampu deuterium (9). Pembacaan
plat KLT dengan densitometer dilakukan dengan scanning panjang gelombang maksimal
dan pembacaan luas area dibawah kurva atau area under curve (AUC). Data seri kadar
dan AUC dilakukan analisis SPSS dengan metode regresi. Hasil analisis regresi
selanjutnya dilihat pada data R hitung dan dibandingkan dengan R tabel. Kadar flavonoid
total dihitung dengan regresi linier antara AUC dengan kadar kurva baku standar
kuersetin dan dinyatakan dalam % kadar.

Penetapan Panjang Gelombang kuersetin dengan Densitometer

Pembacaan panjang gelombang maksimum dilakukan pada totolan seri kurva

baku standar kuersetin dari konsentrasi terendah hingga tertinggi. Rentang pembacaan
densitometri panjang gelombang dilakukan pada 300 - 500 nm secara teori panjang
gelombang kuersetin 380 nm (9), didapatkan hasil panjang gelombang kuersetin pada
percobaan ini pada 377 nm. Hasil panjang gelombang kuersetin yang didapat pada
percobaan ini mendekati panjang gelombang secara teoritis, sehingga panjang gelombang
hasil percobaan digunakan untuk pembacaan area under cuve (AUC) plate silica gel pada
densitometer.
Pembacaan Area Under Curve (AUC) dengan Densitometer

Pembacaan serapan AUC pada plate KLT dilakukan dengan panjang gelombang
maksimum 377 nm dari scaning hasil penelitian. Selanjutnya dilakukan perhitungan nilai
Rf, dengan rumus Rf = Jarak Hasil Elusi (cm)/ Total Jarak elusi (cm) (8). Nilai Rf sampel
EEDK (0,44) sama dengan Rf standar (0,44), sehingga dapat dikatakan bahwa bercak
hasil elusi sampel EEDK mengandung senyawa kuersetin yang dapat di scan untuk
penetapan kadar. Hasil serapan luas area dibawah kurva (AUC) tersaji pada Tabel I.

Perhitungan Kadar kuersetin dalam EEDK

Hasil perhitungan regresi linear antara seri kadar dengan luas area plate EEDK
(Gambar 2) didapatkan persamaan regresi linier Y = 44,7x + 1673,3 dengan nilai
Rhitung= 0,9960. Nilai Rhitung > Rtabel = 0,8783 (derajat bebas 3; p < 0,05), sehingga
persamaan regresi linear dapat digunakan untuk menghitung kadar kuersetin. Berdasarkan
hasil penetapan kadar kuersetin dengan KLT Densitometri didapatkan kadar kuersetin =
0,0045mg/ mg EEDK, kemudian dikonversi menjadi kadar kuersetin 0,45 gram/ 100
gram EEDK = 0,45% (b/b). Daun kelor (Moringa oleifera Lam) mengandung senyawa
flavonoid yang dapat memiliki efek antikanker dan antioksidan (11). Kuersetin
merupakan flavonoid yang terdapat dalam daun kelor, yang secara invivo memiliki
aktivitas antidiabetes bersama senyawa asam klorogenik dan moringinine (2). Flavonoid
adalah metabolit sekunder yang disintesis oleh tanaman dengan berbagai aktivitas
biologis. Sifat fisik dan biokimia flavonoid, mampu berpartisipasi dalam interaksi
tanaman dengan organisme lain (mikroorganisme, hewan, dan tanaman lain) dan reaksi
terhadap tekanan lingkungan (4).
 DAFTAR PUSTAKA

Syukri ,Yandi.,dkk. 2015. Validasi Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman
Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) Menggunakan HPLC. Program Studi
Farmasi Universitas Islam Indonesia

Fatmawati,Annisa & Nurwani Purnama Aji. 2017. Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak
Etanol Daun Kelor (Moringa Oleifera Lam) Dengan Metode Kromatografi Lapis
Tipis Densitometri. Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan,
Universitas Alma Ata. Akademi Farmasi Al-Fatah Bengkulu
 Jurnal Sains Farmasi & Klin is, 2 (1), 8-14

J u r n a l S a in s F a r m a s i & K l i n i s
(p- ISSN: 2407-7062 | e-ISSN: 2442-5435)

diterbitkan oleh Ikatan Apoteker Indonesia - Sumatera Barat

homepage: http://jsfkonline.org

Validasi Penetapan Kadar Isolat Andrografolid

dari Tanaman Sambiloto (Andrographis paniculata Nees)
Menggunakan HPLC
(Validation for the quantification of andrographolide
isolated from Andrographis paniculata nees plant using HPLC)

Yandi Syukri1,5*, Agung Endro Nugroho2, Ronny Martien3, & Endang Lukitaningsih4
1
Program Studi Farmasi Universitas Islam Indonesia
2
Bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
3
Bagian Farmasetika, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
4
Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
5
Mahasiswa S3 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada

Keywords: ABSTRACT: The aim of study was to develop quantitative analysis of isolated andrographolide
andrographolide, from Andrographis paniculata and different solvent for prelimenary studies to preperation Self Nano
validation, HPLC, Emulsifying Drug Delivery System (SNEDDS) using HPLC. The separation was acquired on Sunfire
SNEDDS. C18 column with an isocratic mixture of methanol and water at a ratio of 6:4, v/v as a mobile phase. The
method to determine the content of isolated andrographolide showed an adequate precision, with a RSD
smaller than 1%. The accuracy was analyzed by adding the standard andrographolide, and good recovery
values were obtained for all concentrations used. The HPLC method developed in this study showed
specificity and selectivity with linearity in the working range and good precision and accuracy, making it
very suitable for the quantification of isolated andrographolide. Compared to the standard, the purity of
the isolated andrographolide was 95.74 ± 0.29 %. Prelimenary study to determined the highest solubility
of isolated andrographolide in oil, surfactant and co-surfactant phases for preperation of SNEDDS
were obtained 1.226 ± 0.009 of Capryol-90, 2.965 ± 0.014 of tween 20, and 6.074 ± 0.101 mg mL-1
of PEG 400, respectively. Conclusion, this method suitable used to determination solublity of isolated
andrographolide for preperation SNEDDS.

Kata kunci: ABSTRAK: Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan analisis kuantitatif untuk penentuan
andrografolid; kadar isolat andrographolide dari tanaman sambiloto (Andrographis paniculata) dan pelarut yang
KCKT; validasi; berbeda untuk studi awal untuk pembuatan Self Nanoemulsifying Drug Delivery System (SNEDDS)
SNEDDS. menggunakan KCKT. Pemisahan menggunakan kolom Sunfire C18 dengan campuran isokratik
metanol dan air dengan perbandingan 6: 4, v/v sebagai fase gerak. Metode untuk menentukan
isolat andrographolide menunjukkan presisi yang memadai, dengan RSD lebih kecil dari 1%.
Akurasi dianalisis dengan menambahkan andrografolid standar, dan didapatkan nilai perolehan
kembali yang baik untuk semua konsentrasi yang digunakan. Metode HPLC yang dikembangkan
dalam penelitian ini menunjukkan spesifisitas dan selektivitas dengan linearitas dalam rentang
kerja dan presisi dan akurasi yang baik, sehingga sangat cocok untuk menentukan kandungan
isolat andrografolida. Dibandingkan dengan standar, kemurnian isolat andrografolida adalah
95,74 ± 0,29%. Penelitian awal untuk menentukan kelarutan tertinggi isolat andrographolid
adalah dalam fasa minyak Capryol-90 1,226 ± 0,009 mg mL-1, surfaktan tween 80 2,965 ± 0,014
mg mL-1 dan co-surfaktan PEG 400 6,074 ± 0,101 mg mL-1. Dapat disimpulkan, metode ini cocok
digunakan untuk penentuan kelarutan dari isolat andrographolide untuk pembuatan SNEDDS.

*Corresponding Author: Yandi Syukri (Prodi Farmasi Universitas Islam Article History:
Indonesia, Yogyakarta) Received: 3 Oct 2015 Accepted: 30 Oct 2015
email: yandi.sy@gmail.com Published: 1 Nov 2015 Available online: 30 Dec 2015

8
Validasi Untuk Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman ...
PENDAHULUAN
Andrografolid merupakan senyawa bioaktif
dari tanaman sambiloto (Andrographis paniculata
Ness) yang telah memiliki riwayat digunakan
sebagai pengobatan di negara-negara Asia
seperti anelgesik, antipiretik, antiinflamasi,
antikanker, hipoglikemia dan antihiperlipidemia
[1,2,3,4]. Dilaporkan bahwa terdapat lebih dari
20 diterpenoid dan 10 flavonoid sebagai senyawa
aktif yang diperoleh dari ekstrak etanol atau
metanol dari seluruh tanaman, daun dan batang
dari A. paniculata. Andrografolid (C20H30O5)
merupakan diterpenoid utama yang terdapat pada
tanaman A. paniculata. Diterpenoid utama lainnya
adalah deoksiandragrafolid, neoandragrafolid, 14-
deoksi-11,12-didehidroandragrafolid dan
isoandrografolid [5].
Permintaan tanaman yang berkhasiat
sebagai obat yang digunakan sebagai produk
kesehatan, suplemen makanan dan kosmetika
pada negara maju ataupun berkembang semakin
meningkat. Hal ini disebabkan karena adanya
pengakuan bahwa produk dari bahan alam tidak
toksik, memiliki sedikit efek samping, mudah
didapatkan dan harga yang terjangkau. Selain itu
juga diperoleh data bahwa produk dari bahan alam
memiliki aktifitas biologis yang lebih luas serta
batas keamanan lebih tinggi dibandingkan obat
sintetik [6].
Sebagai negara kepulauan, Indonesia
diberkahi dengan keanekaragaman hayati yang kaya
dan unik. Luas hutan tropis Indonesia mencakup
sekitar 143 juta hektar dan ditumbuhi sekitar
80% dari tanaman obat di dunia dan diperkirakan
terdapat 28.000 spesies tanaman tumbuh pada
hutan tropis Indonesia [7]. Pengembangan
obat dari tumbuhan membutuhkan isolasi dan
pemurnian senyawa yang berkhasiat dari campuran
multi-komponen kompleks untuk menghasilkan
produk dengan kemurnian tinggi. Sampai saat ini
Jurnal Sains Farmasi & Klinis | Vol. 02 No. 01 | November 2015
| Syukri, dkk.
penggunaan isolat andrographolide sebagai bahan
baku obat sangat jarang ditemukan, padahal sudah
banyak dikaji aktivitas farmakologinya. Selain itu
kemurnian isolat andrografolid juga diperlukan
untuk memastikan efek farmakologinya. Dengan
demikian, penentuan kadar isolat andrographolide
harus dapat ditentukan menggunakan KCKT yang
tervalidasi.
Validasi metode analisis harus memenuhi
semua persyaratan aplikasi analisis yang
menjamin keandalan dari hasil analisis. Untuk
itu pengujian harus menunjukkan spesifisitas,
linearitas, presisi, sensitifitas, akurasi dan batas
kuantitasi yang memadai untuk analisis [8].
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan
analisis kuantitatif untuk penentuan kadar isolat
andrographolide dari tanaman sambiloto dan
pelarut yang berbeda untuk studi awal untuk
pembuatan SNEDDS menggunakan KCKT.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini
adalah isolat andrografolid, andrografolid standar
(Sigma-Aldrich, kemurnian 98 %), pelarut untuk
fase gerak seperti metanol dan air serta bahan
untuk pembuatan SNEDDS seperti Myritol 318
(Phapros Tbk), Capryol 90 (PT. Menjangan Sakti),
Labrasol (PT. Menjangan Sakti), Labrafil M1944
(PT. Menjangan Sakti), Chremophore RH 40
(PT. Bahtera Adi Jaya), asam oleat (PT. Brataco),
isopropil miristat (PT. Brataco), tween 80 (PT.
Brataco), tween 20 (PT. Brataco), PEG 400 (PT.
Brataco), dan propilen glikol (PT. Brataco).
Cara Kerja
Analisis kuantitatif isolat andrografolid
Kondisi kromatografi : Kandungan isolat
andrografolid dianalisis menggunakan KCKT
(WATERS e2695, dengan detektor UV-Vis 2486).
9
Validasi Untuk Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman ... | Syukri, dkk.

Data diperoleh dengan perangkat lunak Empower analisis kuantitatif replikasi dengan metode yang
3.0. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan diusulkan. Batas deteksi dan batas kuantitasi
kolom C18 sunfire (150 mm x 4,6 mm, ukuran dihitung berdasarkan respon terhadap signal to
partikel 5 µm) menggunakan campuran isokratik noise dengan rasio 3 : 1 dan 10 : 1 yang secara
metanol dan air dengan perbandingan 6 : 4 v/v eksperimental diverifikasi dengan mengencerkan
sebagai fase gerak. Volume injeksi 20 µL, kecepatan konsentrasi larutan standar sampai respon rata-
alir fase gerak 0,8 mL/menit dan detektor diatur rata dengan 6 kali replikasi [11,12,13].
pada panjang gelombang 229 nm [2].
HASIL DAN DISKUSI
Pembuatan larutan standar
Larutan stok standar dengan konsentrasi Penentuan kandungan andrografolid pada
200 µg/mL dibuat menggunakan andrografolid isolat andrografolid
standar dengan pelarut metanol kualitas KCKT.
Dengan menggunakan larutan stok, suatu seri Kesesuaian sistem
larutan standar kerja dibuat untuk penentuan Hasil analisis yang diperoleh dari metode yang
kurva baku pada jarak konsentrasi tertentu. dikembangkan hanya valid jika kriteria kesesuaian
sistem terpenuhi. Uji kesesuaian sistem dilakukan
Kesesuaian sistem dengan menginjeksikan larutan standar yang
Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk mengandung andrografolid 10 µg/mL sebanyak
menjamin pengkuran menggunakan kromatografi 6 kali sehingga diperoleh kromatogram pada
sesuai dengan analisis yang diharapkan. Parameter gambar 1.
kromatografi meliputi area puncak, waktu retensi, Dari kromatogram tersebut terlihat bahwa
plat teoritis dan faktor tailing diukur dan ditetapkan andrografolid standar memiliki AUC 501613
standar deviasinya (RSD) masing-masing [9,10]. dengan waktu retensi 5,340 menit, sedangkan
isolat andrografolid memiliki AUC 430024 dan
Parameter validasi waktu retensi 4,360 menit. Sedangkan parameter
Metode validasi sesuai dengan pedoman ICH kesesuaian sistem dapat dilihat pada tabel 1.
yang meliputi linearitas, presisi, akurasi, selektifitas,
batas deteksi dan batas kuantitasi. Analisis regresi Tabel 1. Parameter kesesuaian sistem (n = 6)
linear digunakan untu menghitung slope, intersep, No Parameter Data yang RSD Persyara-
diperoleh (%) tan
dan koefisien regresi (r2) untuk plot kalibrasi. 1 AUC 501675,500 ± 0,267 RSD < 1
Evaluasi ini berdasarkan area puncak. Penentuan 1337,985
2 Waktu retensi 4,337 ± 0,004 0,098 RSD < 1
presisi dilakukan dengan 3 konsentrasi berbeda
3 Faktor tailing 1,232 ± 0,023 T≤2
dari larutan isolat andrografolid yang diinjeksikan 4 Resolusi 4,890 ± 0,157 Rs > 2
sebanyak 3 replikasi pada 3 waktu yang berbeda 5 Faktor retensi 2,414 ± 0,004 k≥2
(kapasitas)
pada hari yang sama dan pengulangan yang sama
pada 3 hari yang berbeda untuk memperoleh Dari tabel diperoleh bahwa nilai RSD untuk
variasi intra-day dan inter-day. Akurasi ditentukan AUC 0,267 dan 0,098 untuk waktu retensi.
dari uji perolehan kembali (recovery) dengan Nilai yang diperoleh kurang dari 2 sehingga
menambahkan sejumlah yang telah diketahui pada membuktikan bahwa reprodusibilitas dari
konsentrasi 80, 100 dan 120 % pada plasebo dengan parameter ini sangat baik. Puncak asimetri yang

10 Jurnal Sains Farmasi & Klinis | Vol. 02 No. 01 | November 2015

Validasi Untuk Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman ... | Syukri, dkk.

Gambar 1. Kromatogram andrografolid standar (A) dan isolat andrografolid (B) pada panjang gelombang 229 nm

baik dari andrografolid dinyatakan dengan nilai Linearitas

RSD 1,232 ± 0,023 dari faktor tailing. Resolusi Penentuan linearitas dilakukan dengan
yang diperoleh 4,890 ± 0.157 dengan nilai yang membuat kurva baku untuk menilai kemampuan
lebih dari 2 serta faktor retensi (kapasiltas) 2,414 suatu metode analisis untuk mendapatkan
± 0,004 (lebih dari 2) menunjukkan kesesuaian hasil yang proporsional terhadap konsentrasi
sistem yang baik. andrografolid dalam sampel. Linearitas dihitung
dengan menggunakan 6 konsentrasi larutan dari
Parameter validasi untuk penetapan kadar standar andrografolid. Kurva baku yang diperoleh
andrografolid dengan memplotkan antara konsentrasi dan AUC
Metode yang diusulkan telah divalidasi untuk dari larutan standar pada panjang gelombang 229
penentuan kadar andrografolida diisolasi dari nm. Respon linearitas dari jarak konsentrasi dapat
sambiloto seperti yang ditunjukkan dalam tabel 2. dilihat pada gambar 2.

Tabel 2. Parameter validasi untuk penetapan kadar

andrografolid

No Parameter Data yang

diperoleh
1 Linearitas (koefisien korelasi) 0,9999
2 Jarak kadar (µg/mL) 0,8 - 32
3 Presisi intra-day (% RSD, n = 6) 0,267
4 Presisi inter-day (% RSD, n = 6) 0,558
Gambar 2. Kurva baku andrografolid pada 229 nm.
5 Batas deteksi (µg) 0,09
6 Batas kuantitasi (µg) 0,31
Gambar 2 diperoleh nilai r2 0,9999 dan ini
menunjukkan linearitas yang baik.

Jurnal Sains Farmasi & Klinis | Vol. 02 No. 01 | November 2015 11

Validasi Untuk Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman ... | Syukri, dkk.

Presisi Pengukuran akurasi dilakukan dengan

Presisi dari sistem dilakukan dengan manambahkan standar dengan konsentrasi
melakukan injeksi 6 kali pada vial yang sama tertentu pada isolat andrografolid dengan
dari isolat andografolid yang dinyatakan dengan konsentrasi tertentu juga. Berikut dibandingkan
persen relatif standar deviasi (%RSD) dari AUC. hasilnya dengan penjumlahan dari masing-masing
Presisi intra-day yang diperoleh adalah 0,267 % standar dan isolat andrografolid. Hasil penentuan
dan inter-day 0,558 %. Nilai % RSD yang rendah perolehan kembali dapat dilihat pada tabel 3.
(kurang dari 2 %) menunjukkan bahwa metode ini Hasil recovery yang diperoleh adalah 101,09
memenuhi persyaratan presisi. - 103,17 %. Hasil ini menunjukkan hasil akurasi
yang baik karena masuk ke dalam jarak 95-105%.
Batas deteksi dan batas kuantitasi
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit Penetapan kadar isolat andrografolid
dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih Berikut adalah hasil penetapan kadar isolat
memberikan respon signifikan dibandingkan andrografolid.
dengan blanko. Batas kuantitasi merupakan
parameter pada analisis sebagai kuantitas terkecil Tabel 4. Hasil penetapan kadar isolat andrografolid
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi Replikasi AUC Kadar (µg/ml) Kadar (%)
1 502757 9,60 95,97
kriteria cermat dan seksama. Penentuan batas
2 499484 9,53 95,27
deteksi dan batas kuantitasi standar andrografolid
3 501504 9,57 95,70
dilakukan dengan menggunakan kurva baku linear 4 501613 9,57 95,73
yang memberikan hasil 0,09 µg/ml LOD dan 0,31 5 503358 9,61 96,10
µg/ml LOQ. 6 501337 9,57 95,67
Rata-rata 9,57 95,74
SD 0,03 0,29
Akurasi RSD 0,30 0,30
Akurasi merupakan ukuran yang
menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis Dari tabel di atas terlihat bahwa kandungan
dengan kadar andrografolid yang sebenarnya. andrografolid yang terdapat pada isolat adalah
Akurasi dinyatakan dengan persen perolehan 95,74 ± 0,29 % yang dihitung terhadap standar
kembali isolat andrografolid yang ditambahkan. andrografolid. Data menunjukkan bahwa isolat
andrografolid mengandung jumlah andrografolid
Tabel 3. Hasil penentuan perolehan kembali dengan tingkat kemurnian yang tinggi.
Data yang diperoleh
Parameter
1 2 3
Konsentrasi awal isolat andro- Uji kelarutan dan pemilihan minyak, surfaktan dan
3.97 4.75 5.58
grafolid (µg/ml) kosurfaktan untuk sediaan SNEDDS
Konsentrasi yang ditambahkan
(µg/ml)
7.39 7.39 7.39 Minyak, surfaktan dan kosurfaktan yang
Konsentrasi total (µg/ml) 11.36 12.14 12.97 cocok pada sediaan SNEDDS harus memiliki
Konsentrasi yang diperoleh
11.41 12.30 13.05
kapasitas penglarutan yang tinggi (high
(µg/ml)
solubilizing capacity) pada obat yang dipilih dalam
RSD (%) (n=3) 0.704 1.635 1.138
Perolehan kembali (%) 101.09 103.17 101.34 upaya untuk mendapatkan loading obat yang
Rata-rata perolehan kembali (%) 101.87 optimum. Uji kelarutan isolat andrografolid dalam
berbagai pembawa meliputi minyak, surfaktan dan

12 Jurnal Sains Farmasi & Klinis | Vol. 02 No. 01 | November 2015

Validasi Untuk Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman ... | Syukri, dkk.

ko-surfaktan dapat dilihat pada tabel 5. UCAPAN TERIMA KASIH

Tabel 5. Hasil uji kelarutan andrografolid Ucapan terima kasih kepada Direktorat
dalam fase minyak, surfaktan dan ko-surfaktan Penelitian dan Pengabdian Masyarakat dan
No Bahan Fungsi Kelarutan (mg/ml) Laboratorium Farmasi Universitas Islam Indonesia
1 Myritol 318 Minyak 0,123 ± 0,002
atas bantuan fasilitas dan biaya penelitian.
2 Capryol 90 Minyak 1,226 ± 0,009
3 Asam oleat Minyak 0,208 ± 0,022
DAFTAR PUSTAKA
4 Isopropil Minyak 0,018 ± 0,001
miristat
5 Labrasol Surfaktan 2,536 ± 0,026 1. Chellampillai, B., & Pawar, A. P. (2011). Improved bioavailability
6 Labrafil M1944 Surfaktan 0,241 ± 0,008 of orally administered andrographolide from pH-sensitive
7 Chremophore Surfaktan 0,383 ± 0,074 nanoparticles. European journal of drug metabolism and
RH 40 pharmacokinetics, 35(3-4), 123-129.
8 Tween 20 Surfaktan 2,965 ± 0,014 2. Sermkaew, N., Ketjinda, W., Boonme, P., Phadoongsombut,
9 Tween 80 Surfaktan 2,498 ± 0,042 N., & Wiwattanapatapee, R. (2013). Liquid and solid self-
10 Propilenglikol Ko-surfaktan 5,991 ± 0,830 microemulsifying drug delivery systems for improving the
oral bioavailability of andrographolide from a crude extract of
11 PEG 400 Ko-surfaktan 6,074 ± 0,101
Andrographis paniculata. European Journal of Pharmaceutical
Sciences, 50(3), 459-466.
Tabel diatas menunjukkan bahwa untuk fasa 3. Nugroho, A. E., Rais, I. R., Setiawan, I., Pratiwi, P. Y.,
minyak kelarutan yang tertinggi pada Capryol 90 Hadibarata, T., Tegar, M., & Pramono, S. (2014). Pancreatic
effect of andrographolide isolated from Andrographis paniculata
dengan nilai 1,226 ± 0,009, surfaktan pada tween (Burm. f.) Nees. Pakistan Journal of Biological Sciences, 17(1),
20 sebesar 2,965 ± 0,014 dan untuk ko-surfaktan 22-31.
PEG 400 sebesar 6,074 ± 0,101. Dengan demikian 4. Nugroho, A. E., Andrie, M., Warditiani, N. K., Siswanto, E.,
Pramono, S., & Lukitaningsih, E. (2012). Antidiabetic and
untuk pembuatan SNEDSS terpilih Capryol 90
antihiperlipidemic effect of Andrographis paniculata (Burm. f.)
untuk fasa minyak, tween 20 untuk surfaktan dan Nees and andrographolide in high-fructose-fat-fed rats. Indian
PEG 400 untuk ko-surfaktan. journal of pharmacology, 44(3), 377-381.
5. Chao, W. W., & Lin, B. F. (2010). Review Isolation and
identification of bioactive compounds in Andrographis paniculata
KESIMPULAN (Chuanxinlian). growth, 5(17).
6. Kataky, A., & Handique, P. J. (2010). A brief overview on
Andrographis paniculata (Burm. f) Nees., a high valued medicinal
Metode KCKT dapat dikembangkan untuk
plant: Boon over synthetic drugs. Asian J Sci Technol, 6, 113-
menentukan kadar isolat andrografolid dari 118.
tanaman sambiloto yang memenuhi persyaratan 7. Elfahmi, Woerdenbag, H. J., & Kayser, O. (2014). Jamu:
validasi dengan kemurnian andrografolid 95,74 ± Indonesian traditional herbal medicine towards rational
phytopharmacological use. Journal of Herbal Medicine, 4(2), 51-
0.29 % terhadap standar andrografolid. Studi awal 73.
untuk pembuatan SNEDDS dengan menentukan 8. Urban, M. C. C., Mainardes, R. M., & Gremião, M. P. D. (2009).
kelarutan isolat andrografolid dalam fase minyak, Development and validation of HPLC method for analysis of
dexamethasone acetate in microemulsions. Brazilian journal of
surfaktan dan ko surfaktan diperoleh kelarutan
pharmaceutical sciences, 45(1), 87-92..
tertinggi pada fasa minyak Capryol-90 dengan 9. Gao, J. (2004). Bioanalytical method validation for studies on
konsentrasi andrografolid yang terlarut 1,226 pharmacokinetics, bioavailability and bioequivalence: Highlights
of the FDA’s Guidance. Asian J Drug Metab Pharmacokinet,
± 0,009 mg/ml, surfaktan tween 20 dengan
4(1), 5-13.
konsentrasi andrografolid terlarut 2,965 ± 10. Shabir, G. A. (2004). A practical approach to validation of HPLC
0,014 mg/ml dan ko surfaktan PEG 400 dengan methods under current good manufacturing practices. Journal of
konsentrasi andrografolid terlaut sebesar 6,074 ± validation technology, 10, 210-218.

0,101 mg/ml.

Jurnal Sains Farmasi & Klinis | Vol. 02 No. 01 | November 2015 13

Validasi Untuk Penetapan Kadar Isolat Andrografolid dari Tanaman ... | Syukri, dkk.

11. Bhope, S., Kuber, V., Nagore, D., Gaikwad, P., & Patil, M.
(2012). Development and validation of RP-HPLC method for
simultaneous analysis of andrographolide, phyllanthin, and
hypophyllanthin from herbal hepatoprotective formulation. Acta
Chromatographica, 25(1), 159-169.
12. Ravikanth, K., Kanaujia, A., Singh, P., & Thakur, D. (2013).
Validated RP’HPLC method for the quantification of
andrographolide in Toxiroak premix, a polyherbal mycotoxin
inhibitor. International Journal of Pharmaceutical Sciences and
Research, 4(7), 2623-2628.
13. Rukoyah, U., & Fidrianny, I. (2015). Method development for
simultaneous analysis of marker scopoletine, andrographolide,
quercetin, and luteolin in antihypertension jamu formulation using
RP-HPLC. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, 7(3), 332-336.

14 Jurnal Sains Farmasi & Klinis | Vol. 02 No. 01 | November 2015

 Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak Etanol Daun Kelor

(Moringa Oleifera Lam) Dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis Densitometri

1 2
Annisa Fatmawati ,Nurwani Purnama Aji
1)
Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan, Universitas Alma Ata
2)
Akademi Farmasi Al-Fatah Bengkulu

Email : annisafatma20@gmail.com

Abstrak

Daun kelor (Moringa oleifera Lam) mengandung senyawa flavonoid yang

dapat digunakan untuk antikanker, antidiabetes dan antioksidan. Penelitian ini
bertujuan untuk menentukan kandungan flavonoid total pada daun kelor dengan
standar kuersetin. Penentuan kandungan kuersetin dilakukan dengan metode
kromatografi lapis tipis densitometrik (TLC-Densitometri). Kuersetin standar dibuat
dengan konsentrasi 1mg / ml dan sampel ekstrak 250mg / ml dalam metanol,
dilakukan scan panjang gelombang dan pembacaan serapan luas area untuk
penetapan kadar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rendemen ekstrak etanol
daun kelor (EEDK) 13,65%, dan kadar flavonoid total 0,45 gram / 100 gram ekstrak
dengan persentase 0,45%. Fase gerak yang digunakan toluena: etil asetat: asam
format, 5: 4: 0,2 (v / v / v) memberikan hasil elusi yang baik. Daun kelor dapat
digunakan untuk pengobatan bahan alami dengan kandungan flavonoid.

Kata kunci: Moringa oleifera, kuersetin, KLT-Densitometri

Abstract

Moringa leaf (Moringa oleifera Lam) contains flavonoid compounds that can
be used for anticancer, antidiabetes and antioxidants. This study aims to determine
the total flavonoid content in moringa leaves with standard quercetin. Determination
of quercetin content was done by thin layer chromatography densitometric (TLC-
Densitometry) method. The standard quercetin was prepared with a concentration of
1mg/ml and the extract sample 250mg/ml in methanol, wavelength scans and uptake
readings for area determination were carried out. The results showed that the
rendemen of 13.65% moringa leaf ethanol extract, and total flavonoid content 0,45
gram/100 gram extract with percentage 0,45%. The mobile phase used toluene: ethyl
acetate: formic acid, 5: 4: 0.2 (v / v / v) gives good elution results. Moringa leaves can
be used for the treatment of natural ingredients with flavonoid content.
Keywords : Moringa oleifera, quercetin, TLC-Densitometry

PENDAHULUAN

Indonesia memiliki ragam tumbuhan yang dapat dijadikan sebagai sumber

nutrisi dan telah diteliti memiliki khasiat obat. Berbagai macam penyakit dengan
terapi obat sintetis dapat menyebabkan efek samping, sehingga pengobatan bahan
alam menjadi alternatif terapi. Bahan alam yang berasal dari tumbuhan yang dapat
digunakan untuk pengobatan yaitu daun kelor.
Daun kelor (Moringa oleifera Lam) mengandung senyawa flavonoid yang dapat
memiliki efek antikanker dan antioksidan (1). Kuersetin merupakan flavonoid yang
terdapat dalam daun kelor, yang secara invivo memiliki aktivitas antidiabetes
bersama senyawa asam klorogenik dan moringinine (2). Flavonoid adalah metabolit
sekunder yang disintesis oleh tanaman dengan berbagai aktivitas biologis. Sifat fisik
dan biokimia flavonoid, mampu berpartisipasi dalam interaksi tanaman dengan
organisme lain (mikroorganisme, hewan, dan tanaman lain) dan reaksi terhadap
tekanan lingkungan (3).

Beberapa penelitian melaporkan mekanisme quersetin sebagai antidiabetes,

seperti penurunan peroksidasi lipid, peningkatan aktivitas enzim antioksidan (seperti
SOD, GPX, dan CAT), penghambatan aktivasi PI3K dan penurunan penyerapan
glukosa usus dengan menghambat GLUT2 (4). Penelitian ini bertujuan untuk
menentukan kandungan flavonoid total pada daun kelor dengan standar kuersetin.
Penentuan kandungan kuersetin dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis
densitometrik (TLC-Densitometri).

MATERIAL DAN METODE

Bahan uji yang digunakan adalah daun kelor (Moringa oleifera) yang diperoleh
dari Kranggan, Tasikmadu, Karanganyar, Jawa Tengah. Alkohol 70% digunakan
untuk pelarut ekstraksi daun kelor. Silica gel GF-245 sebagai fase diam, fase gerak
(toluena: etil asetat: asam format) dan pelarut ekstrak methanol pro-analisis (p.a)
untuk uji kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri. Peralatan yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu alat-alat gelas (pyrex), rotary evaporator, magnetic stirer
dan Densitometer (TLC Scanner Camag).

Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kelor (EEDK)

Tanaman segar kelor diperoleh dari daerah Kranggan, Tasikmadu,

Karanganyar, Jawa Tengah dan dilakukan determinasi di Laboratorium Biologi,
FMIPA, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta. Tanaman segar kelor dicuci bersih
dan dilakukan sortir terhadap bagian daun kelor. Kemudian dilakukan pengeringan
simplisia daun dengan oven. Simplisia kering daun kelor diperoleh dengan cara
pengeringan dalam oven pada suhu 40˚C sampai kadar air kurang dari 10% dari
bobot awal dan diserbuk dengan menggunakan blender (5).
 Maserasi daun kelor dilakukan menurut penelitian Saputra (6) dengan modifikasi
perbandingan pelarut. Daun kelor tua segar dibersihkan, dicuci, dikeringkan
kemudian dihaluskan dan diayak dengan mesh no. 12 sampai diperoleh serbuk
kering. Sebanyak 1,316 kg serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 70% (1:5)
selama 3 hari, kemudian disaring. Ampas dimaserasi kembali dengan larutan etanol
70% (remaserasi satu kali). Maserat kemudian diuapkan dengan menggunakan
vacum rotary evaporator (suhu 60oC, kecepatan ) hingga tidak ada uap ethanol yang
menetes pada labu alas bulat penampung kaca rotary evaporator dan dilanjutkan
dengan waterbath pada suhu 50oC hingga didapat ekstrak kental etanol 70% (7).
Ekstrak kental yang didapat, dilakukan perhitungan rendemen ekstrak berdasarkan
rumus: % rendemen = (berat ekstrak kental (gram)/ berat sampel (gram)) x 100% (8).

Penetapan Kadar kuersetin pada Ekstrak Etanol Daun Kelor

Penetapan kadar kuersetin pada EEDK berdasarkan penelitian Gupta et al., (9)
dengan modifikasi konsentrasi standar dan sampel sesuai orientasi penelitian di
Laboratorium Kimia Analisis UAD. Timbang sampel EEDK sejumlah 250 mg,
kemudian dilarutkan dalam metanol pro-analisis (pa) dalam labu takar 10 ml. Standar
kuersetin sebanyak 25,0 mg dilarutkan dalam 25 ml pelarut metanol pro-analisis.
Larutan dipipet 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 dan 2,5 ml dilarutkan dalam metanol p.a dengan
labu takar 10 ml (8).

Fase diam menggunakan pelat Silica Gel F254 10 x 10 cm dipanaskan dalam

oven suhu 100oC selama 10 menit. Sampel dan standar ditotolkan (0,5 mikro liter)
pada pelat, pada jarak 10 mm (10). Jarak elusi yang digunakan 80 mm dilakukan
pada suhu kamar (28 ± 2°C), dengan fase gerak toluena: etil asetat: asam format, 5:
4: 0,2 (v / v / v), dalam chamber Camag kaca yang sebelumnya telah dijenuhkan
dengan fase gerak selama 20 menit. Fase diam (plate) KLT yang telah dikeringkan di
dalam lemari asam, selanjutnya di masukkan ke dalam alat Densitometer (Camag
TLC Scanner) yang terinstalasi dengan software komputer bernama Win Cats,
menggunakan lampu deuterium (9). Pembacaan plat KLT dengan densitometer
dilakukan dengan scanning panjang gelombang maksimal dan pembacaan luas area
dibawah kurva atau area under curve (AUC). Data seri kadar dan AUC dilakukan
analisis SPSS dengan metode regresi. Hasil analisis regresi selanjutnya dilihat pada
data R hitung dan dibandingkan dengan R tabel. Kadar flavonoid total dihitung
dengan regresi linier antara AUC dengan kadar kurva baku standar kuersetin dan
dinyatakan dalam % kadar.
HASIL DAN PEMBAHASAN

Daun kelor (Moringa oleifera) dilakukan determinasi di Laboratorium Ilmu Alam,

Biologi, Fakultas MIPA, UAD dengan tujuan untuk mengetahui secara pasti bahwa
sampel yang digunakan merupakan daun kelor. Hasil determinasi daun kelor yang
diperoleh sebagai berikut:

1b - 2b - 3b - 4b - 17b - 18b - 19b - 20b - 21b - 22b - 23b - 24b - 25b - 26b - 27a - 28b
- 29b - 30b - 21a - 32a - 33a - 34a - 35a - 36d - 37b - 38b - 39b - 41b - 42b - 44b - 45b
- 46a - 47a Moringaceae - Moringa - 1 Moringa oleifera Lamk

Ekstrak etanol daun kelor dibuat dengan metode maserasi yaitu dengan cara
menimbang serbuk simplisia kering daun kelor sebanyak 1,316 kg dan direndam
menggunakan etanol 70% sebanyak 6,58 Liter (perbandingan 1 : 5). Etanol 70%
dipilih untuk maserasi karena merupakan pelarut dengan daya ekstraktif terbesar
untuk semua bahan alam berbobot molekul rendah, seperti alkaloida, saponin dan
flavonoid[10].

Sebanyak 1,316 kg serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 70%. Metode

penyarian dilakukan dengan cara maserasi dan remaserasi selama 3 hari.
Pengadukan selama 3 jam menggunakan magnetic stirrer dengan skala 3 (Ika
Labortechnik) bertujuan untuk memudahkan penetrasi cairan penyari kontak dengan
serbuk simplisia. Selanjutnya dilakukan penyaringan dan didapatkan filtrat, dan
diuapkan menggunakan rotary evaporator (kecepatan , dengan suhu 60oC ) sampai
agak kental. Kemudian ekstrak dipekatkan pada waterbath dengan suhu 60oC sampai
terbentuk ekstrak kental. Setelah didapatkan ekstrak etanol kental daun kelor,
dilakukan penimbangan bobot ekstrak yaitu sebanyak 179,7 gram, sehingga
didapatkan rendemen ekstrak sebanyak 13,66%.

Gambar 1. Plate KLT Hasil Elusi Sampel EEDK dan Standar Kuersetin
Penetapan Panjang Gelombang kuersetin dengan Densitometer

Pembacaan panjang gelombang maksimum dilakukan pada totolan seri kurva

baku standar kuersetin dari konsentrasi terendah hingga tertinggi. Rentang
pembacaan densitometri panjang gelombang dilakukan pada 300 - 500 nm secara
teori panjang gelombang kuersetin 380 nm (9), didapatkan hasil panjang gelombang
kuersetin pada percobaan ini pada 377 nm. Hasil panjang gelombang kuersetin yang
didapat pada percobaan ini mendekati panjang gelombang secara teoritis, sehingga
panjang gelombang hasil percobaan digunakan untuk pembacaan area under cuve
(AUC) plate silica gel (Gambar 1) pada densitometer.

Pembacaan Area Under Curve (AUC) dengan Densitometer

Pembacaan serapan AUC pada plate KLT dilakukan dengan panjang
gelombang maksimum 377 nm dari scaning hasil penelitian. Selanjutnya dilakukan
perhitungan nilai Rf, dengan rumus Rf = Jarak Hasil Elusi (cm)/ Total Jarak elusi (cm)
(8). Nilai Rf sampel EEDK (0,44) sama dengan Rf standar (0,44), sehingga dapat
dikatakan bahwa bercak hasil elusi sampel EEDK mengandung senyawa kuersetin
yang dapat di scan untuk penetapan kadar. Hasil serapan luas area dibawah kurva
(AUC) tersaji pada Tabel I.

14000
y = 44.70x + 1673.3
12000 R2 = 0.9918

10000
Luas Area (AUC)

8000

6000 AUC
Linear (AUC)
4000

2000

0
0 50 100 150 200 250 300
Seri Kadar (ppm)

Gambar 2. Kurva linier antara Luas Area (AUC) dengan Seri Kadar (ppm) Kuersetin
 Tabel I. Hasil KLT Densitometri Penetapan Kadar Kuersetin EEDK
Seri Kadar
Keterangan Luas Area Hasil Elusi Jarak Elusi
Rf
( ppm ) (AUC) (cm) (cm)

Standar 50 4253,6 3,5 8 0,44

Standar 100 5905,3 3,5 8 0,44

Standar 150 8177,8 3,5 8 0,44

Standar 200 10348,1 3,5 8 0,44

Standar 250 13207,5 3,5 8 0,44

Sampel EEDK Replikasi 1 6771,0 3,5 8 0,44

Sampel EEDK Replikasi 2 6882,6 3,5 8 0,44

Sampel EEDK Replikasi 3 6487,8 3,5 8 0,44

Perhitungan Kadar kuersetin dalam EEDK

Hasil perhitungan regresi linear antara seri kadar dengan luas area plate EEDK
(Gambar 2) didapatkan persamaan regresi linier Y = 44,7x + 1673,3 dengan nilai
Rhitung= 0,9960. Nilai Rhitung > Rtabel = 0,8783 (derajat bebas 3; p < 0,05),
sehingga persamaan regresi linear dapat digunakan untuk menghitung kadar
kuersetin. Berdasarkan hasil penetapan kadar kuersetin dengan KLT Densitometri
didapatkan kadar kuersetin = 0,0045mg/ mg EEDK, kemudian dikonversi menjadi
kadar kuersetin 0,45 gram/ 100 gram EEDK = 0,45% (b/b).
Daun kelor (Moringa oleifera Lam) mengandung senyawa flavonoid yang dapat
memiliki efek antikanker dan antioksidan (11). Kuersetin merupakan flavonoid yang
terdapat dalam daun kelor, yang secara invivo memiliki aktivitas antidiabetes
bersama senyawa asam klorogenik dan moringinine (2). Flavonoid adalah metabolit
sekunder yang disintesis oleh tanaman dengan berbagai aktivitas biologis. Sifat fisik
dan biokimia flavonoid, mampu berpartisipasi dalam interaksi tanaman dengan
organisme lain (mikroorganisme, hewan, dan tanaman lain) dan reaksi terhadap
tekanan lingkungan (4).

KESIMPULAN DAN SARAN

Daun kelor mengandung senyawa kuersetin yang dinyatakan dalam kadar

flavonoid total 0,45 gram/ 100 gram EEDK = 0,45%. Ekstrak etanol daun kelor dapat
digunakan untuk pengobatan bahan alami dengan kandungan flavonoid. Perlu
dilakukan penetapan kadar flavonoid total pada hasil fraksi etil asetat dari ekstrak
etanol daun kelor dengan metode KLT Densitometri.

DAFTAR PUSTAKA

[1] Gopalakrishnan, L., Doriya, K., & Kumar, D. S. Moringa oleifera: A review on
nutritive importance and its medicinal application. Food Science and Human
Wellness,(2016); 5(2), 49-56.

[2] Ali, Fahmy T., Nahla S. Hassan dan Rehab R. Abdrabou. Potential activity of
Moringa Oleifera leaf extract and some active ingredients against diabetes in rats.
International Journal of Scientific & Engineering Research, May-2015; Volume
6, Issue 5

[3] Mierziak, J.,K.Kostyn, A.Kulma. Flavonoids as important molecules of plants

interactions with the environment. Molecules. 2014; 19.16240-16265.

[4] Vinayagam, Ramachandran dan Baojun Xu. Antidiabetic properties of dietary

flavonoids: a cellular mechanism review. Nutrition & Metabolism. 2015, 12:60.
Bio Med Central.

[5] Srijanto, Bambang, Olivia Bunga P., Lely Khojayanti, Eriawan Rismana, dan
Sriningsih, Pemurnian Ekstrak Etanol Sambiloto (Andrographis paniculata Ness.)
Dengan Teknik Ekstraksi Cair-Cair. Prosiding InSINas, Jakarta; 2012

[6] Saputra, Irfan, Ghuzrina Prihandini, Siti Zullaikah, M Rachimoellah. Ekstraksi

Senyawa Aktif dari Daun Moringa oleifera. Jurnal Teknik Pomits Vol. 2, No. 1,
(2013) ISSN-2337-3539(2301-9271 Print)

[7] Departemen Kesehatan RI. Buku Panduan Teknologi Ekstrak, Direktorat Jendral
Pengawasan Obat dan Makanan. Departemen Kesehatan Republik Indonesia,
Jakarta. 2000; Hlm. 3,6,11-15,17,39.

[8] Anonim. Farmakope Herbal Indonesia. Edisis I. Jakarta: Departemen Kesehatan

Republik Indonesia. 2008

[9] Gupta, Arti, Navin R Sheth, Sonia Pandey and Jitendra Singh Yadav.
Determination of Quercetin a Biomarker in Hepatoprotective Polyherbal
Formulation through High Performance Thin Layer Chromatography. J
Chromatogr Sep Tech 2015, 6:6

[10] Bhandari, Pamita, Neeraj Kumar, Ajai P. Gupta, Bikram Singh dan Vijay K. Kaul.
A rapid RP-HPTLC densitometry method for simultaneous determination of
major flavonoids in important medicinal plants. J. Sep. Sci. 2007, 30, 2092–
2096.

[11] Agoes, Goeswin. Teknologi Bahan Alam. 2009; Serial Farmasi Industri-2 ed.
Revisi