1.

Proses pembelahan sel secara meiosis dan mitosis :

Pembelahan mitosis

Pembelahan mitosis merupakan proses pembelahan yang terjadi pada inti sel yang
kemudian menghasilkan sel sel baru dengan jenis kromosom yang sama dengan sel lama.
Secara genetik, proses pembelahan mitosis ini akan menghasilkan dua buah sel baru yang
cenderung identik. Masing masing sel baru tersebut mewarisi sifat yang sama dengan
induknya. Dalam konteks kehidupan kita dapat dengan mudah menemukan contoh
pembelahan mitosis di sekitar kita karena proses pembelahan mitosis ini akan terjadi pada
setiap sel yang terdapat pada tubuh makhluk hidup.

gambar proses pembelahan mitosis

Meskipun terjadi pada setiap makhluk hidup, proses pembelahan mitosis ini terjadi secara
tak langsung, tidak langsung disini maksudnya adalah untuk mencapai pembelahan
mitosis diperlukan beberapa fase atau tahapan. Adapun fase dan tahapan yang terdapat
pada proses pembelahan mitosis adalah profase, metafase, anafase, dan telofase.
Profase (fase pertama mitosis)
Fase pertama mitosis ini ditandai dengan membrane inti sel yang rusak menjadi serpihan
kecil yang disebut fragment. lama kelamaan proses pembelahan akan mulai terbentuk
dengan ditandai benang benang kromatin yang mulai memadat menghasilkan kromosom.
Selanjutnya kromosom ini mulai bergerak menuju titik tengan sel.

Metafase (metaphase)
Pada fase ini benang benang gelendong yang terjadi pada fase sebelumnya akan mulai
terlihat dengan jelas. Kromosom mulai berjajar di ekuator sel. Beberapa benang akan
terlihat mencapai kutub tanpa harus melekat pada sentromer. Sentromer ini selanjutnya
 akan membelah, menyebabkan kromatid berubah menjadi kromosom tunggal.

Anafase (anaphase)

Berbeda dengan fase sebelumnya, pada tahap anafase kromosom yang mulanya saling
terikat secara tiba tiba akan terpisah hingga menjadi 2 bagian yang sama namun menuju
ke arah kutub yang berbeda. Dan pada akhir tahapan proses anafase ini setiap ujung sel
akan mempunyai kromosom yang sama sekaligus lengkap dari segi jumlah.

Telofase (telophase)
Ini merupakan tahapan pembelahan mitosis yang terakhir dimana kromosom sudah
berada pada masing masing kutub sehinga nukleus akan terlihat kembali. Kromatid yang
mulanya ada akan mulai menghilang hingga sitoplasma menebal dan membran sel akan
terpisah dari kedua sel baru tersebut.

Pembelahan meiosis

Pengertian pembeahan meiosis adalah pembelahan sel yang terdapat pada sel reproduksi.
Tujuan pembelahan meiosis ini adalah untuk menghasilkan 4 sel baru dimana setiap sel memiliki
kromosom berjumlah setengah dari kromosom sel lama atau indiknya. Perbedaan pembelahan
mitosis dan meiosis yang paling mencolok adalah jumlah kromosom yang dihasilkan pada proses
pembelahan selnya. Secara umum fase pembelahan mitosis dan pembelahan meiosis hampir
sama yang membedakan adalah proses pembelahan meiosis dibagi menjadi dua tahapan. yakni:
Proses Pembelahan Meiosis I

Profase
Profase pada pembelahan meiosis I ini ditandaii dengan adanya kerusakan pada membran inti
serta munculnya fragment (serpihan) dan terbentunya glendong pembelahan. Benang kromatin
yang mulanya tak terlihat mulai memadat kemudian berubah menjadi kromosom yang
selanjutnya saling berpasangan antar kromosom homolog.
Metafase (metapahse)
pada tahap kedua ini kromosom akan mulai berjajar pada ekuator sel. pada proses ini juga
setiap benang spindle akan mulai melekat pada setiap sentomer kromosong yang ada.
Sedangkan ujung benang ini akan membentang dan melekat pada 2 kutub pembelahan sel yang
berbeda (berlawanan).

Anafase (Anaphase)
Anaphase ditandai dengan adanya proses penarikan kromosom homolog oleh benang benang
spindle menuju ke arah yang saling berlawanan.

Telofase (telophase)
Telophase merupakan fase terakhir dari proses pembelahan meiosis yang ditandai dengan
kromosom yang telah mencapai masing masing kutub pembelahan.

Proses Pembelahan Meiosis II

Profase (Prophase)
Fase ini ditandai dengan rusaknya membran inti dan munculnya serpihan berupa fragment,
kromatid yang mulai menuju ke arah tengah sel serta terbentuknya gelendong.

Metafase (Metaphase)
Tahapan meiosis yang kedua adalah metapahse dimana kromosom yang awalnya terbentuk
tidak beraturan mulai berjajar pada bidang sel.
 Anafase (Anaphase)
Fase ini ditandai dengan adanya proses kromatid yang mulai terpisah satu sama lain dan menuju
kutub yang saling berlawanan.

Telofase (Telophase)
Tahapan meiosis yang terakhir ini dapat ditandai dengan nukleus yang telah terbentuk dan juga
kromosom yang terurai sehingga membentuk kromatin dan terjadinya proses sitokinesis.

2. jenis mutasi gen

3. Regulasi ekspresi gen prokariotik (operon lac)
4. Regulasi ekspresi gen eukariotik (splicing)
Proses splicing
    Sel Prokariotik
Splicing merupakan proses pemotongan dan penyambungan RNA. Pada sel prokariotik
tidak terjadi splicing. Hal ini dikarenakan pada sel prokariotik tidak terdapat intron dalam
satu untai mRNA hasil transkripsi (kecuali pada beberapa Archaea tertentu).
    Sel Eukariotik
Pada sel eukariotik terjadi splicing karena dalam satu untai mRNA hasil transkripsi yang
akan diterjemahkan terdapat intron dan ekson yang berseling-seling. Terjadinya splicing
ini adalah ketika fase pasca transkripsi. Awalnya, gen memiliki 2 macam kode yakni
ekson dan intron. Ekson merupakan kode yang dipakai sedangkan intron merupakan kode
yang tidak pakai dan akan dibuang. Selanjutnya terjadi proses pemotongan intron dan
penyambungan ekson. Sehingga akan terbentuklah mRNA yang matang dan selanjutnya
akan ditransfer ke sitoplasma untuk melalui tahap selanjutnya yakni translasi di ribosom.

Seperti yang telah diketahui pada bagian sebelumnya bahwa regulasi transkripsi memiliki
peranan penting dalam mengontrol perkembangan pada organisme eukariot. Hal ini tidak
berarti bahwa cara regulasi lain tidak penting. Proses regulasi transkripsi terjadi pada banyak
sistem dan terjadi dengan beberapa mekanisme. Regulasi terjadi dengan merubah stabilitas
transkripsi, diferensiasi transpot ke sitoplasma, dan dengan diferensiasi translasi dari proses
transkripsi
1. Jelaskan kapan terjadi proses splicing alternatif serta bagaimana mekanisme
terjadinya?
2.      Jelaskan mekanisme ekspresi gen jalur kompleks menurut R.J. Britten dan E.H
Davidson (model 1), dan apa perbedaan kedua jalur dari model 1?
3.      jelaskan mengenai pembentukan RNAd dalam model Davidson dan Britten pada
model 2!
Jawaban:
1.    Splicing alternatif terjadi pada tahap pasca-transkripsi (jeda waktu antara transkripsi
dan translasi). Ekson yang telah mengalami transkripsi pada tahap pasca-transkripsi
tersebut displicing dengan alternatif yang berbeda sehingga menghasilkan banyak mRNA
yang berbeda. Susunan mRNA yang berbeda-beda yang dihasilkan tersebut bergantung
kepada tipe splicing RNA. Berikut ini beberapa tipe dari sistem splicing yang
menentukan susunan mRNA yang dihasilkan:
a.       Intron dihapus dari pre-mRNA inti dari eukariot tingkat tinggi oleh sebuah sistem
yang hanya mengenal urutan konsensus pada batas intron-ekson dan dalam intron. Reaksi
ini memerlukan sejumlah alat splicing (spliceosome).
b.      RNAs tertentu memiliki kemampuan untuk menghilangan intron mereka.
c.       Penghapusan intron dari prekursor inti tRNA yeast melibatkan
kegiatan enzimatik yang menangani substrat dengan cara yang mirip dengan enzim
pemrosesan tRNA yang memiliki fitur penting yang sesuai dengan prekursor tRNA.
(Lewin,2004)
2.    Ketika suatu sensor gen menerima signal, maka sensor gen akan berinteraksi dengan
integrator gen menghasilkan activator RNA yang akan berinteraksi dengan sequence
khusus pada reseptor gen yang dapat memicu transkripsi yang dekat dengan producer
gen. Pada model 1 terdapat dua jalur yang berbeda, yang membedakan pada kedua jalur
tersebut adalah: pada jalur a integrator gen yang berinteraksi dengan sensor hanya satu
dan reseptor gen pada struktur gen ada lebih dari satu. Sedangkan pada jalur b, integrator
gen yang berinteraksi dengan sensor lebih dari satu dan reseptor gen pada stuktur gen
hanya satu macam. Meskipun integrator gen yang berinteraksi dengan sensor lebih dari
satu, tetapi masing-masing integrator akan menghasilkan aktivator RNA yang berbeda.
3.    Pembentukan RNAd pada model 2 Davidson dan Britten adalah di mulai dari gen
struktural yang terletak di constitutive transcription units yang akan di transkripsikan
pada level basal pada semua sel. Transkripsi konstritutif ini hanya di proses pada sel yang
mengandung intergrating regulatory transcript. Pada akhirnya akan di transkripsikan sel
dengan yang spesifik dan harus ada sebelum hasil transkripsi konstitutif dari gen
struktural tersebut dapat di proses menjadi RNAd.

2. Manfaat Bioinformatika
Kegunaan Bioinformatika
a) Bioteknologi Dalam Bidang Klinis

Bioinformatika dalam bidang klinis sering disebut sebagai informatika klinis(clinical

informatics). Aplikasi dari informatika klinis ini berbentuk manajemen data-dataklinis dari
pasien melalui  Electrical Medical Record (EMR) yang dikembangkan olehClement J.
McDonald dari Indiana University School of Medicine pada tahun 1972.McDonald pertama
kali mengaplikasikan EMR pada 33 orang pasien penyakit gula(diabetes). Sekarang EMR ini
telah diaplikasikan pada berbagai penyakit. Data yang disimpan meliputi data analisa
diagnosa laboratorium, hasil konsultasi dan saran, fotorontgen, ukuran detak jantung, dan
lain lain. Dengan data ini dokter akan bisa bertugas menunjang seluruh proses kehidupan,
antara lain sebagai katalis reaksi biokimia dalam tubuh (disebut enzim), berperan serta
dalam sistem pertahanan tubuh melawan virus, parasit dan lain-lain (disebut antibodi),
menyusun struktur tubuh dari ujung kaki(otot terbentuk dari protein actin, myosin, dan
sebagainya) sampai ujung rambut (rambut tersusun dari protein keratin), dan lain-lain. Arus
informasi, DNA -> RNA -> Protein,inilah yang disebut sentral dogma dalam biologi molekul.

Sekuen DNA satu organisme, yaitu pada sejenis virus yang memiliki kurang lebih
5.000 nukleotida/molekul DNA atau sekitar 11 gen, berhasil dibaca secara
menyeluruh pada tahun 1977. Sekuen seluruh DNA manusia terdiri dari 3 milyar
nukleotida yang menyusun 100.000 gen dapat dipetakan dalam waktu 3 tahun. Saat
ini terdapat milyaran data nukleotida yang tersimpan dalam database DNA, GenBank
di AS yang didirikan tahun 1982. Di Indonesia, ada Lembaga Biologi Molekul
Eijkman yang terletak diJakarta. Di sini kita bisa membaca sekuen sekitar 500
nukleotida hanya dengan membayar $15. Trend yang sama juga nampak pada
database lain seperti database sekuen asam amino penyusun protein, database struktur
3D protein, dan sebagainya. Inovasi teknologi DNA chip yang dipelopori oleh
perusahaan bioteknologi AS, Affymetrix diSilicon Valley telah mendorong
munculnya database baru mengenai RNA.

Desakan kebutuhan untuk mengumpulkan, menyimpan dan menganalisa data-

databiologis dari database DNA, RNA maupun protein inilah yang semakin
memacuperkembangan kajian Bioinformatika.

b)     Untuk Identifikasi Agent Penyakit Baru

Bioinformatika juga menyediakan tool yang sangat penting untuk identifikasi

agent penyakit yang belum dikenal penyebabnya. Banyak sekali penyakit baru yang
muncul dalam dekade ini, dan diantaranya yang masih hangat adalah SARS (Severe
Acute Respiratory Syndrome).
Pada awalnya, penyakit ini diperkirakan disebabkan oleh virus influenza
karenagejalanya mirip dengan gejala pengidap influenza. Akan tetapi ternyata dugaan
ini salahkarena virus influenza tidak terisolasi dari pasien. Perkirakan lain penyakit
ini disebabkanoleh bakteriCand ida karena bakteri ini terisolasi dari beberapa pasien.
Tapi perkiraan inijuga salah. Akhirnya ditemukan bahwa dari sebagian besar pasien
SARS terisolasi virus Corona jika dilihat dari morfologinya. Sekuen genom virus ini
kemudian dibaca dan dari hasil analisa dikonfirmasikan bahwa penyebab SARS
adalah virusCo rona yang telah berubah (mutasi) dari virusCorona yang ada selama
ini.

Dalam rentetan proses ini, Bioinformatika memegang peranan penting. Pertamapada

proses pembacaan genom virus Corona. Karena didatabase seperti GenBank, EMBL
(European Molecular Biology Laboratory), dan DDBJ (DNA Data Bank of
Japan)sudah tersedia data sekuen beberapa virus Corona, yang bisa digunakan untuk
mendisainprimer yang digunakan untuk amplifikasi DNA virus SARS ini. Software
untukmendisain primer juga tersedia, baik yang gratis maupun yang komersial.
Contoh yanggratis adalah Webprimer yang disediakan oleh Stanford Genomic
Resources, GeneWalker yang disediakan oleh Cybergene AB, dan lain sebagainya.
Untuk yang komersial ada  Primer Disainer yang dikembangkan olehScientific &
Education Software, dan software-software untuk analisa DNA lainnya seperti
Sequencher (Gene Codes Corp.), SeqMan II (DNA STAR Inc.),Genetyx(GENETYX
Corp.),DNASIS (HITACHI Software), dan lain lain. Menentukan obat yang sesuai
dengan kondisi pasien tertentu dan lebih jauh lagi, dengandibacanya genom manusia,
akan memungkinkan untuk mengetahui penyakit genetikseseorang, sehingga
penanganan terhadap pasien menjadi lebih akurat. 

c)      Untuk Mendiagnosa Penyakit Baru

Untuk menangani penyakit baru diperlukan diagnosa yang akurat sehingga dapat
dibedakan dengan penyakit lain. Diagnosa yang akurat ini sangat diperlukan untuk
pemberian obat dan perawatan yang tepat bagi pasien.

Ada beberapa cara untuk mendiagnosa suatu penyakit, antara lain: isolasi agent
penyebab penyakit tersebut dan analisa morfologinya, deteksi antibodi yang
dihasilkan dari infeksi dengan teknik  enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),
dan deteksi gendari agent pembawa penyakit tersebut dengan Polymerase Chain
Reaction (PCR).

Teknik yang banyak dan lazim dipakai saat ini adalah teknik PCR. Teknik ini
sederhana, praktis dan cepat. Yang penting dalam teknik PCR adalah disain primer
untuk amplifikasi DNA, yang memerlukan data sekuen dari genom agent yang
bersangkutan dan software seperti yang telah diuraikan di atas. Disinilah
Bioinformatika memainkan peranannya. Untuk agent yang mempunyai genom RNA,
harus dilakukan reverse transcription (proses sintesa DNA dari RNA) terlebih dahulu
dengan menggunakan enzim  reverse transcriptase. Setelah DNA diperoleh baru
dilakukan PCR. Reverse transcription dan PCR ini bisa dilakukan sekaligus dan
biasanya dinamakan RT-PCR.  Teknik PCR ini bersifat kualitatif, oleh sebab itu sejak
beberapa tahun yang lalu dikembangkan teknik lain, yaitu Real Time PCR yang
bersifat kuantitatif. Dari hasil Real Time PCR ini bisa ditentukan kuantitas
suatu agent di dalam tubuh seseorang, sehingga bisa dievaluasi tingkat emergensinya.
Pada Real Time PCR ini selain primer diperlukan probe yang harus didisain sesuai
dengan sekuen agent yang bersangkutan. Di sini juga  diperlukan software atau
program Bioinformatika 

d)     Bagaimana Penemuan Obat-obatan

Cara untuk menemukan obat biasanya dilakukan dengan menemukan

zat/senyawayang dapat menekan perkembangbiakan suatu agent penyebab penyakit.
Karena perkembangbiakan agent tersebut dipengaruhi oleh banyak faktor, maka
faktor-fakto rinilah yang dijadikan target. Diantaranya adalah enzim-enzim yang
diperlukan untuk perkembangbiakan suatu agent. Mula-mula yang harus dilakukan
adalah analisa struktur dan fungsi enzim-enzim tersebut. Kemudian mencari atau
mensintesa zat/senyawa yangdapat menekan fungsi dari enzim-enzim tersebut.

Analisa struktur dan fungsi enzim ini dilakukan dengan cara mengganti asam amino
tertentu dan menguji efeknya. Analisa penggantian asam amino ini dahulu dilakukan
secara random sehingga memerlukan waktu yang lama. Setelah Bioinformatika
berkembang, data-data protein yang sudah dianalisa bebas diakses oleh siapapun,
baik data sekuen asam aminonya seperti yang ada di SWISS-PROT maupun struktur
3D-nya yang tersedia di Protein DataBank (PDB). Dengan database yang tersedia ini,
enzim yangbaru ditemukan dapat dibandingkan sekuen asam amino-nya, sehingga
bisa diperkirakanasam amino yang berperan untuk aktivitas (active site) dan
kestabilan enzim tersebut.

Setelah asam amino yang berperan sebagai active site dan kestabilan enzim tersebut
ditemukan, kemudian dicari atau disintesa senyawa yang dapat berinteraksi dengan
asam amino tersebut. Dengan data yang ada di PDB, maka dapat dilihat struktur3D
suatu enzim termasuk active site-nya, sehingga bisa diperkirakan bentuk
senyawayang akan berinteraksi dengan active site tersebut. Dengan demikian, kita
cukup mensintesa senyawa yang diperkirakan akan berinteraksi, sehingga obat
terhadap suatu penyakit akan jauh lebih cepat ditemukan. Cara ini dinamakan
“docking” dan telah banyak digunakan oleh perusahaan farmasi untuk penemuan obat
baru.

Meskipun dengan Bioinformatika ini dapat diperkirakan senyawa yang berinteraksi

dan menekan fungsi suatu enzim, namun hasilnya harus dikonfirmasi dahulu melalui
eksperimen di laboratorium. Akan tetapi dengan Bioinformatika, semua proses ini
bisa dilakukan lebih cepat sehingga lebih efisien baik dari segi waktu
maupun finansial.

Tahun 1997, Ian Wilmut dari Roslin Institute dan PPL Therapeutics Ltd,Edinburgh,
Skotlandia, berhasil mengklon gen manusia yang menghasilkan faktor IX (faktor
 pembekuan darah), dan memasukkan ke kromosom biri-biri. Diharapkan biri-biri
yang selnya mengandung gen manusia faktor IX akan menghasilkan susu yang
mengandung faktor pembekuan darah. Jika berhasil diproduksi dalam jumlah
banyakmaka faktor IX yang diisolasi dari susu harganya bisa lebih murah untuk
membantu para penderita hemofilia.

3. Tujuan Score Pada Bioinformatika Blast

Penggunaan pensejajaran berganda ini bertujuan untuk mensejajarkan dan
mencocokan hasil sekuensing yang diperoleh dari sampel penelitian dengan data di
genbank. Analisis hasil BLAST tersebut memberikan informasi mengenai bakteri apa
yang mempunyai kesamaan dengan urutan DNA sampel sehingga dapat digunakan
untuk identifikasi bakteri. Informasi dari hasil BLAST tersebut berupa Score, Query
Coverage, E-value dan Maximum identity.   
Score adalah jumlah keselarasan semua segmen dari urutan database yang cocok
dengan urutan nukleotida. Nilai skor menunjukkan keakuratan nilai penjajaran
sekuens berupa nukleotida yang tidak diketahui dengan sekuens nukleotida yang
terdapat di dalam genbank. Semakin tinggi nilai skor yang diperoleh maka semakin
tinggi tingkat homologi kedua sekuens.   

Query coverage adalah persentasi dari panjang nukleotida yang selaras dengan
database yang terdapat pada BLAST. Max identity adalah nilai tertinggi dari
persentasi identitas atau kecocokan antara sekuen query dengan sekuen database yang
tersejajarkan. 

Nilai E-value merupakan nilai dugaan yang memberikan ukuran statistik yang
signifikan terhadap kedua sekuen. Nilai E-value yang semakin tinggi menunjukkan
tingkat homologi anta sekuens semakin rendah, sedangkan nilai E-value yang
semakin rendah menunjukkan tingkat homologi antar sekuens semakin tinggi. Nilai
E-value bernilai 0 (nol) menunjukkan bahwa kedua sekuens tersebut identik.

Nilai max identity sebesar 99% mengindikasikan bahwa isolat dianggap sebagai spesies yang
sama. Sedangkan homologi ≥97% dapat dinyatakan bahwa isolat yang dibandingkan berada
pada genus yang sama dan homologi antara 89-93% menunjukkan famili yang berbeda.
Tetapi hal ini perlu ditelusuri lagi melalui analisis filogenetik dengan melihat percabangan
yang dibentuk oleh isolat melalui pengamatan posisi yang ditempati diantara spesies-spesies
yang lain atau spesies pembandingnya.
4. Isolasi DNA, Uji kuantitatif dan Uji Kualitatif
Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu
secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara
kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah
analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam
 suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan
DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif.
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini
sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan
DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas
gradient sentrifugasi. Selanjutnya, lokasi DNA dalam gel tersebut dapat
diidentifikasi secara langsung dengan menggunakan pewarna berfluorescen.
Sedangkan pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan
metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis
(visible), spektrofotometri UV (ultraviolet), Spektrofotometri UV-Vis
(ultraviolet–visible) dan Spektrofotometri Infra Red Dalam tulisan ini, hanya
akan dijelaskan mengenai spektrofotometri Vis dan UV–Vis.
Uji kuantitatif DNA dengan metode spektrofometri ini bertujuan untuk
mengetahui keberadaan dan jumlah DNA di dalam suatu larutan contoh uji
dan untuk memahami penggunaan dan perbedaan spektrofotometer Vis dan
UV-Vis.
Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk
mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian
dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel
agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan
contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode
spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk
mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa
tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah
pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Uji
kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain :
5.
6. 1.    Spektrofotometri Vis (Visible)
7. Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah
cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik
yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang cahaya
tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua cahaya yang dapat
dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun
selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam
cahaya tampak (visible). Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada
spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan
nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74.
Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam
lainnya, karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Alat ini
bekerja berdasarkan hukum Lambert-beer. Logika prinsip dari alat spektro-
vis adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah
cahaya yang diserap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang
diserap. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang
memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode
spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki
warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent
spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang
digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan
dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus
benar-benar stabil.
8. 2.    Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet-Visible)
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV
tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap
sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening
dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa
meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus
dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada
spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi.
Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV
dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah
menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu
photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling
populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik
untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.
DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap
cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm,
sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada 280
nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga
kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA
berkisar antara 1.8-2.0. Jika nilai melebihi 2.0 maka larutan yang diuji masih
mengandung kontaminan dari protein membran/senyawa lainnya sehingga
kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1.8 maka
ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu
sedikit. Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri
UV-Vis antara lain : mikropipet, kuvet, nanodrop spektrofotometer dan
seperangkat komputer. Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan
aquadest sebagai blanko. Cara kerja pengujian kuantitatif DNA diawali
dengan menghidukan alat nanodrop spektrofotometer. Kemudian melakukan
uji blanko menggunakan aquadest. Setelah itu dilanjutkan dengan menguji
isolat DNA dengan cara meneteskannya pada tempat sampel sebanyak 1
mikroliter. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan baca hasil kemurnian
DNA-nya.