BAB II

METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

3.1.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif dengan pendekatan kuantitatif
untuk tingkat ekspresi gen Wnt5a, ROR1 dan CREB pada hasil biopsi segar pasien kanker
payudara dari RSUD Dr. Saiful Anwar.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan April sampai dengan Juni 2018 di Laboratorium
Kultur Jaringan Hewan dan Regulasi Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam.

3.3 Instrumen Penelitian

3.3.1 Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah hasil fresh biopsy pasien kanker
payudara dari RSUD Dr.Saiful Anwar Malang.
3.3.2 Alat
Gunting bedah, pinset, scapel, glas arloji, cawan petri, mikropistil, Laminar Air Flow
(LAF), sentrifuge dingin, mikropipet, mikrotube, mikrotip, nanodrop spectrophotometer
2000, Thermal Cylcler, box es, vorteks, Rotor GeneQ, refrigrator 4oC.

3.3.3 Bahan
4 Qiazol (Qiagen), Kloroform, Isopropanol, Etanol 70%, RNAse free water, Tetro Reverse
Transcriptase, Ribosafe RNAse Inhibitor,OligodT primer, dNTP Mix, 5x RT-Buffer,
DEPC-treated water, Sybr Green, Sterile Destilated Water (SDW), FastStart Universal
SYBR Green Master (ROX) ®, dan primer target meliputi primer forward gen Wnt5a, 5’-
ATTCTTGGTGGTCGCTAGG-3’ dan primer reverse Wnt5a, 5’-
CTGTCCTTGAGAAAGTCCTG-3’ (Lin et al., 2014). Primer forward gen ROR1, 5’-
CAACAAGAAGCCTCCCTAATGG-3’ dan primer reverse ROR1, 5’-
CCTGAGTGACGGCACCTAGAA-3’ (Zhang, et al., 2012). Primer forward gen CREB,
5’-GATGCAGCTGTAACAGAAGC-3’ dan primer reverse gen CREB, 5’-
ATGACTCCATGGACTTGAACT-3’ (Lu, et al., 2016). Primer forward gen
 housekeeping GAPDH, 5’- ATGCTGGCGCTGAGTACGTC -3’ dan reverse GAPDH,
5’- GGTCATGAGTCCTT CCACGATA -3’ (Chen & Wu, 2013).

4.1 Prosedur Penelitian

3.4.1 Persiapan Sampel
Sampel diperoleh dari biopsi oleh tim dokter bedah RSSA kemudian segera dibawa ke
Laboratorium Regulasi Genetik Universitas Negeri Malang (UM) dalam kondisi steril dan
beku di dalam nitrogen cair untuk dilakukan isolasi RNA.

3.4.2 Isolasi RNA Total

RNA total diisolasi dari masing-masing sampel dilakukan secara terpisah. Sebanyak
100mg sampel ditambah dengan 250ml Qiazol (Qiagen) dan dihancurkan hingga halus di
dalam mikrotube 1,5 ml dengan menggunakan mikropistil. Setelah halus ditambah dengan
250ml, kemudian dicampur hingga homogen. Selanjutnya ke dalam suspensi ditambahkan
500ml kloroform, kemudian dikocok dengan kuat hingga benar-benar tercampur dengan baik
dan diinkubasi di dalam suhu kamar selama 5 menit. Selanjutnya suspensi disentrifuse pada
kecepatan 13.000rpm selama 10 menit di dalam refrigerated centrifuge. Fasa air hasil
sentrifugasi dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse baru, kemudian ditambah dengan 500ml
isopropanol dan dicampur dengan baik. Setelah diinkubasi di dalam suhu ruang selama 5
menit, larutan disentrifus pada kecepatan 13.000rpm selama 10 menit di dalam refrigerated
centrifuge. Selanjutnya, supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan menggunakan etanol
dengan cara menambahkan 500ml etanol 70% dan melakukan sentrifugasi pada kecepatan
13.000rpm selama 10 menit di dalam refrigerated centrifuge. Setelah supernatan dibuang,
pelet yang diperoleh dikeringanginkan di dalam laminar air flow selama 1,5-2 jam.
Selanjutnya pelet yang telah kering dilarutkan di dalam 50-100ml RNAse-free water
tergantung dari besarnya pelet yang diperoleh. Total RNA kemudian diukur kualitas serta
kuantitasnya menggunakan nanodrop spectrophotometer 2000.

3.4.3 Sintesis cDNA

Hasil RNA yang telah diisolasi dikuantitasi terlebih dahulu menggunakan Nanodrop
Spectrophotometer untuk mengetahui konsentrasi RNA murni dalam sampel. Bila hasil pada
panjang gelombang 260/280 dari mesin Nanodrop menghasilkan angka antara 1,6-2,0 maka
sampel tersebut adalah RNA murni, dan dilanjutkan dengan tahapan proses selanjutnya, yaitu
sintesis cDNA menggunakan Tetro Reverse Transcriptase Protocol.
 Bahan yang diperlukan untuk membuat cDNA master mix yaitu 5x RT Buffer, Ribosafe
RNAse Inhibitor, OligodT primer,10mM dNTP mix, Tetro Reverse Transcriptase, dan DEPC-
treated water. Reagen diletakan dalam box es. Reagen divorteks sebelum digunakan. Reagen
yang dicampurkan dijadikan master mix yang dibagi ke dalam beberapa microtube untuk
ditambahkan RNA sampel.
Master mix cocktail yang telah ditambah dengan RNA sampel tiap tabung memiliki
total volume sebanyak 20 µl. Master mix diletakkan dalam box berisi es, dan dicampur secara
perlahan menggunakan micropippete. Bila ada reagen di dinding microtube, lakukan flash
dengan sentrifuge. Microtube yang berisi sampel diletakkan dalam mesin Rotor Gene Q,
kemudian diatur waktu dan suhu inkubasi dalam sistem software mesin (thermal cycler)
menjadi 2 tahapan. Tahapan pertama dengan suhu 45°C selama 30 menit, dan tahapan kedua
dengan suhu suhu 85°C selama 5 menit. Sampel yang telah menjalani proses reverse
transcription disimpan di refrigerator pada suhu 4°C.

3.4.4 qRT-PCR
Bahan yang digunakan dalam pengukuran ekspresi gen ini adalah FastStart Universal
SYBR Green Master (ROX) ®, 30µM primer target meliputi gen Wnt5a, ROR1, CREB, serta
gen GAPDH sebagai housekeeping gene, dan Sterilized Distilled Water (SDW). Reagen
diletakan dalam box es. Reagen divorteks sebelum digunakan. Reagen yang dicampurkan
merupakan master mix yang akan dibagi ke dalam beberapa microtube untuk ditambahkan
sebanyak 5µl cDNA sampel. Volume setiap reagen yang dicampurkan disesuaikan dengan
metode yang tertulis pada FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) ® protocol.
Cocktail master mix yang telah ditambahkan dengan cDNA sampel tiap tabung memiliki total
volume sebanyak 50 µl. Master mix diletakkan dalam box berisi es, dan dicampur secara
perlahan menggunakan micropippete. Bila ada reagen di dinding microtube, lakukan flash
dengan sentrifuge. Microtube yang berisi sampel diletakkan dalam mesin Rotor Gene Q,
kemudian diatur waktu dan suhu inkubasi dalam sistem software mesin (thermal cycler).
Tahapan qPCR mengikuti protokol FastStart Universal SYBR Green Master.

4.2 Analisis Data

Dari penelitian ini akan diperoleh data kualitatif berupa ada tidaknya ekspresi gen
Wnt5a, ROR1, CREB dan GAPDH pada sampel hasil biopsi segar kanker payudara pasien
RSUD Dr. Saiful Anwar Malang dan data kuantitatif berupa tingkat ekspresi gen-gen
tersebut. Data kualitatif akan dianalisis secara deskriptif untuk menemukan kemungkinan
jalur regulasi yang terganggu, sedangkan data tingkat ekspresi gen Wnt5a, ROR1, CREB dan
GAPDH akan dianalisis dengan menggunakan software SPSS version 20.0 dan software
JMP6 untuk mengetahui kemungkinan terjadinya downregulation atau upregulation.