LAPORAN RESMI PRAKTIKUM X

MIKROBIOLOGI FARMASI

UJI ANGKA LEMPENG TOTAL

Disusun oleh :

Nama : 1. M Wahyu Pratomo (16/397292/FA/10975)

2. Mila Hanifa (16/397295/FA/10978)
3. Nadya Rizky S (16/397298/FA/10981)
4. Natania Kriswanti (16/397301/FA/10984)
: C 2016
Golongan : IV
Kelompok : 1
Asisten Jaga : 1. Fauzan Adzima
2. Karin
3. Usna
Asisten Koreksi : Usna
Dosen Jaga : Andyana Puspitasari Gani S.Si, M.Si., Apt
Tanggal Praktikum : 12 Mei 2017

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

DEPARTEMEN BIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2017

PRAKTIKUM X

UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

A. TUJUAN
Menetapkan cemaran bakteri yang terdapat dalam sediaan makanan, minuman,
kosmetika, atau obat, tradisional.
B. DASAR TEORI
Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada
suatu sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka
Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil
menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati
secara visual berupa angka dalam koloni(cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara
yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar (BPOM,
2008).
Prinsip pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode Analisis Mikrobiologi
(MA PPOM 61/MIK/06) yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah
cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi
pada suhu yang sesuai. Pada pengujan Angka Lempeng Total digunakan PDF
(Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer sampel dan menggunakan PCA (Plate
Count Agar) sebagai media padatnya. Digunakan juga pereaksi khusus Tri Phenyl
tetrazalim Chlotide 0,5 % (TTC).
sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka
Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil
menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati
secara visual berupa angka dalam koloni(cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara
yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar (BPOM,
2008).
Prosedur pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode Analisis  Mikrobiologi
(MA PPOM 61/MIK/06) yaitu dengan cara aseptik ditimbang 25 gram atau dipipet
25 ml sampel ke dalam kantong stomacher steril. Setelah itu ditambahkan 225 ml
PDF, dan dihomogenkan dengan stomacher selama 30 detik sehingga diperoleh
suspensi dengan pengenceran 10-1. Disiapkan 5 tabung atau lebih yang masing-
masing telah diisi dengan 9 ml PDF. Hasil dari homogenisasi pada penyiapan
sampel yang merupakan pengenceran 10-1 dipipet sebanyak 1 ml kedalam tabung
PDF pertama, dikocok homogeny hingga diperoleh pengenceran 10-2. Dibuat
pengenceran selanjutnya hingga 10-6 atau sesuai dengan pengenceran yang
 diperlukan. Dari setiap pengenceran dipipet 1ml kedalam cawan petri dan dibuat
duplo, ke dalam setiap cawan dituangkan 15-20 ml media PDA yang sudah
ditambahkan 1%TTC suhu 45°C. Cawan petri segera digoyang dan diputar
sedemikian rupa hingga suspense tersebar merata. Untuk mengetahui sterilitas
media dan pengencer dibuat uji kontrol (blangko). Pada satu cawan diisi 1 ml
pengencer dan media agar, pada cawan yang lain diisi media. Setelah media
memadat, cawan diinkubasi suhu 35-37°C selama 24-46 jam dengan posisi dibalik.
Setelah itu jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.
Keuntungan dari metode pertumbuhan agar metode uji Angka Lempeng Total
adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya dapat
diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh.
Adapaun kelemahan dari metode ini adalah :
1. Kemungkinan terjadi koloni yang berasal lebih dari satu sek mikroba, seperti
pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel.
2. Kemungkinan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya.
Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena
penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa
inkubasi.
3. Kemungkinan ada jenis mikroba yang tumbuh menyebar diseluruh permukaan
media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan
mikroba lain tersebut tidak terhitung
4. Perhitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya
antara 30-300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan
menghasilkan perhitungan yang kurang teliti secara statistic, namun bila lebih
dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan
diantara koloni.
5. Perhitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang
umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih (Buckle, 1987).
C. ALAT DAN BAHAN
Alat dan Bahan
a. Alat:
 Petri * (10)
 Tabung reaksi * (6)
  Labu Erlenmeyer untuk wadah mensterilkan media
 Blue Tip * (15)
 Gelas ukur 10 ml * (1)
b. Bahan:
 Sampel yang diperiksa (serbuk jamu)
 Medium Plate Count Agar (PCA) dan larutan fisiologis
D. CARA KERJA
Ditimbang 1 gram sampel yang akan diperiksa
kemudian dilarutkan dalam 10 ml larutan pengencer
↓
Dilakukan pengenceran sampai 10-5
↓

Dituang sebanyak 1 ml suspense hasil

pengenceran pada cawan petri
↓
Ke dalam setiap cawan petri tersebut dituangkan medium PC
(suhu ± 40⁰C) yang telah disterilkan
↓
Cara kerja nomor 3 dan 4 dilakukan pada 2 cawan petri (duplo)
↓
Diinkubasi petri pada suhu 37⁰C selama 24 jam dalam posisi terbalik
↓
Dilakukan penghitungan koloni bakteri yang tumbuh pada cawan petri. Angka
lempeng total dihitung dengan ketentuan seperti di bawah ini

 Perhitungan:
Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni
antara 30-300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan petri dihitung lalu
dikalikan dengan faktor pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka
Lempeng Total dalam tiap gram contoh. Untuk beberapa kemungkinan lain yang
berbeda dari pernyataan di atas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut:
1. Bila hanya salah satu diantaranya kedua cawan petri dari pengenceran yang
sama menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, dihitung rata-rata dari
kedua cawan dikalikan dengan faktor pengenceran.
2. Bila pada cawan petri dari kedua tingkat pengenceran yang berurutan
menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka dihitung jumlah koloni dan
dikalikan factor pengenceran kemudian diambil angka rata-rata. Jika pada
tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapati koloni yang lebih besar dua
kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat
pengenceran terendah.
3. Bila dari seluruh cawan petri tidak satupun yang menunjukkan 30-300
koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah
dan dihitung sebagai Angka Lempeng Total perkiraan.
4. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan petri dan bukan disebabkan
karena inhibitor, maka Angka Lempeng total dilaporkan sebagai kurang dari
satu dikalikan dengan factor pengencer paling rendah
5. Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 300, maka cawan dengan tingkat
pengenceran tertinggi dibagi dalam beberapa sector (2,4 atau 8) Jumlah
koloni dikalikan dengan factor pembagi dan fakor pengencerannya. Hasil
dilaporkan sebagai Angka Lempeng Perkiraan.
6. Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada 1/8 bagian cawan, maka jumlah
koloni adalah 200 x 8 x factor pengenceran. Angka lempeng total perkiraan
dihitung sebagai lebih besar dari jumlah koloni yang diperoleh.
E. DATA DAN HASIL PENGAMATAN

Pengenceran 10ˉ¹ (1) Pengenceran 10ˉ2 (1)

Pengenceran 10ˉ²(1) Pengenceran 10ˉ³ (1)

Pengenceran 10ˉ4 (1) Pengenceran 10−5 (1)

Pengenceran Jumlah koloni

10−1 (1) 93
10−1 (2) 20
10−2 (1) 54
10−2 (2) 48
10 −3
(1) 37
10−3 (2) 92
10−4 (1) 51
10 −4
(2) 10
10−5 (1) 81
10−5 (2) 6
 Rumus penghitungan angka lempeng total (ALT)
1
faktor pengenceran
ALT = jumlah koloni x
gram sampel

Pada pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 didapatkan koloni bakteri yang sesuai
dengan rentang 30-300 koloni, sehingga dapat dihitung ALT nya.

a) Pengenceran 10-1 (1)

1
0,1
ALT =9300 x =930
1

b) Pengenceran 10-1 (2)

1
0,1
ALT =20 x =200
1

c) Pengenceran 10-2 (1)

1
0,01
ALT =54 x =5400
1

d) Pengenceran 10-2 (2)

1
0,01
ALT =48 x =4800
1

e) Pengenceran 10-3 (1)

1
0,001
ALT =37 x =37000
1

f) Pengenceran 10-3 (2)

1
0,001
ALT =92 x =92000
1
 g) Pengenceran 10-4 (1)
1
0,0001
ALT =51 x =510000
1

h) Pengenceran 10-4 (2)

1
0,0001
ALT =10 x =100000
1

i) Pengenceran 10-5 (2)

1
0,00001
ALT =35 x =8100000
1

j) Pengenceran 10-5 (2)

1
0,00001
ALT =35 x =600000
1

Diambil 2 ALT pada pengenceran yang berurutan, yaitu 10-2 dan 10-3 , maka ALT
rata-rata:
5400+37000
ALT rata−rata(1)= =42400
2

4800+92000
ALT rata−rata(2)= =96800
2

F. PEMBAHASAN
Praktikum ini bertujuan untuk menetapkan cemaran bakteri yang terdapat dalam
makanan, minuman, kosmetika, obat atau obat tradisional. Dalam praktikum ini
sampel yang diuji adalah obat tradisional, yaitu Jamu Habacus saitivus
yang mempunyai indikasi meningkatkan daya tahan tubuh, meningkatkan stamina,
dan memperlancar peredaran darah. Jamu ini berbentuk kapsul, jadi saat akan
digunakan untuk praktikum, kapsul ini dibuka dan dituangkan isinya. Uji angka
lempeng total merupakan metode umum yang digunakan untuk menghitung adanya
bakteri yang terdapat pada sediaan yang diperiksa. Walaupun suatu bentuk sediaan
dinyatakan steril, belum tentu bebas dari bakteri yang terdapat dalam sediaan.
Jumlah koloni bakteri yang memenuhi aturan Departemen Kesehatan RI adalah
kurang dari 106 (jumlah angka lempeng total). Jika jumlah koloni dalam sediaan
kurang dari 106, maka sediaan itu dinyatakan aman untuk dikonsumsi. Sebaliknya,
jika jumlah koloni bakteri lebih dari 106, maka sediaan tersebut tidak aman untuk
dikonsumsi.
Terdapat dua metode untuk menguji angka lempeng total, yaitu Metode
Cawan Tuang (Pour Plate) dan metode Sebaran (Spread Plate). Metode yang
digunakan adalah metode cawan tuang (Pour Plate). Prinsipnya, dibuat suatu serial
dilusi (pengenceran) mulai dari 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, hingga 10-5. Agar cair
didinginkan sampai suhu sekitar 440°C dan baru kemudian dituangkan ke cawan
petri. Setelah agar padat, cawan diinkubasi selama 24-48 jam (37°C). Lempengan
yang digunakan dalam perhitungan bakteri ialah lempengan yang mengandung 30-
300 koloni. Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Larutan Saline karena
larutan ini merupakan larutan fisiologis yang mengandung NaCl 0,09%. Dipilih
larutan saline dengan tujuan agar tekanan osmotik sitoplasma sama dengan tekanan
osmotik medium dan menghindari lisis atau mengerutnya sel bakteri yang ada
dalam sediaan uji. Proses pengenceran ini perlu dilakukan untuk memperkecil
populasi bakteri atau mempersempit daerah (area) uji sehingga bakteri yang tumbuh
tidak menumpuk sehingga dapat mempersulit pengamatan.
 Medium yang digunakan adalah PCA (Pour Count Agar) yang memiliki
komposisi tiap liternya: yeast ekstrak, pepton, D (+) Glukosa, dan agar. Yeast
merupakan sumber vitamin B, nitrogen organic dan senyawa karbon. Pepton adalah
sumber nitrogen organic juga mengandung vitamin dan karbohidrat. Glukosa
merupakan sumber gula dan karbohidrat. Digunakan PCA karena merupakan media
yang selektif terhadap bakteri, sehingga cemaran selain bakteri tidak bisa tumbuh.
Agar hanya sebagai pembeku. Agar diperoleh dari marine tertentu (Red Algae).
Sebelum digunakan, PCA telah disterilisasi dan dipanaskan terlebih dahulu.
Medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri harus sesuai dan memenuhi
syarat, antara lain:
- derajat keasaman (pH) relatif netral
- susunan makanan/nutrisi harus memenuhi persyaratan tumbuh bakteri, misalnya
sumber karbon dan nitrogen
- tekanan osmotik harus isotonis
- temperatur sekitar 370 C
 - sterilitas harus terjaga melalui pengerjaan secara aseptis
Saat penuangan medium pada cawan yang telah berisi sampel uji perlu
diperhatikan medium diperkirakan telah bersuhu ±400 C agar tidak mematikan
bakteri yang ingin diamati dari sampel. Medium yang telah berisi sampel uji
diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam dalam posisi terbalik agar embun yang
mungkin dihasilkan ketika inkubasi tidak mencemari medium dan terjadi
kontaminasi. Diharapkan pada kondisi inkubasi tersebut, bakteri dapat tumbuh
optimum dan terbentuk koloni yang akan dihitung.
Pengenceran yang digunakan untuk perhitungan adalah pengenceran 10--2 dan
10-3 saja karena diasumsikan pada pengenceran tersebut perhitungan jumlah koloni
dapat dilakukan dalam rentang ketentuan perhitungan 30-300 koloni dan data masih
dapat diterima karena tidak mempunyai penyimpangan. Kontrol hasil dibandingkan
dengan media asli atau dari daerah jernih yang masih ada pada hasil percobaan.
Dari hasil percobaan diperoleh ALT rata-rata (1) sebesar 42400 dan ALT rata-
rata (2) sebesar 96800, hasil ini kurang dari 106 sehingga memenuhi aturan jumlah
ALT Departemen Kesehatan RI. Ini menandakan bahwa jamu tersebut masih dapat
diedarkan dipasaran dan aman dikonsumsi.
Metode Pour Plate ini memiliki keuntungan sebagai berikut:

1. Tidak diperlukan keterampilan yang tinggi dalam pelaksanaannya.

2. Bakteri dapat tertanam di agar, bukan hanya di permukaan saja.

Kerugian dari metode ini adalah:

1. Tidak dapat mengisolasi koloni tunggal.

2. Riskan untuk mikroba yang tidak tahan panas.

Suatu produk makanan, obat dikatakan secara mikrobiologi bersifat rusak

apabila terdapat metabolit yang bersifat toksik, konsentrasi tinggi mikroogranisme
yang berpotensial pathogen, dan secara fisik maupun kimia ditandai oleh perubahan
bentuk, warna, rasa, dan bau. Zat pengawet dapat ditambahkan asal tidak toksik atau
tidak iritatif mampu membunuh kontaminan, stabil dan aktif serta selektif dan tidak
bereaksi dengan bahan.

G. KESIMPULAN
 Metode yang digunakan adalah cawan tuang (pour plate)
  ALT rata-rata (1) dan (2) adalah 42400 dan 968000 (tidak lebih dari
106 ¿
 Persyaratan Depkes untuk produk yang layak edar, cemarannya tidak
lebih dari 106
 Pengenceran yang dimasukkan dalam rata-rata adalah pengenceran 10−2
dan 10−3
H. DAFTAR PUSTAKA
Sastro Utomo, Sutikno S.1992., Dasar-dasar Peptisida dan Dampak
Penggunaannya., Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
W.Lay,Bibiana,1994.,Analisis Mikroba di Laboratorium.,Jakarta:PT. Raja Grafindo
Persada
Buckle,K.A., dkk, 1987., Ilmu Pangan., Diterjemahkan oleh Adiono dan Hari
Purnomo, UI Press, Jakarta

Yogyakarta, 16 Mei 2017

Asisten Koreksi Praktikan

M Wahyu Pratomo
(16/397292/FA/10975)

Mila Hanifa
(16/397295/FA/10978)

Nadya Rizky S
(16/397298/FA/10981)

Natania Kriswanti
(16/397301/FA/10984)