Alat dan bahan

Setiap reaksi transkrip balik total volume sebesar 10 uL, terdiri atas:
1. 2 uL total isolat RNA
2. 3,7 uL H2O
3. 2 uL buffer enzim M-MuLV Rev 10x
4. 0,35 uL 50 mM DTT
5. 0,5 uL 10 mM dNTP
6. 0,35 uL enzim M-MuLV Rev
7. 0,35 uL Rnase inhibitor
8. 0,75 uL Loligo d(T) 10 mM

Reaksi transkripsi balik dilakukan menggunakan automated thermal cycler (Gene Amp PCR
System 9700; PE Applied Biosystem, USA). Diprogram dalam 1 siklus pada suhu 25C selama 5
menit, 42C selama 60 menit dan 70C selama 15 menit.

Hasil berupa cDNA yang akan diamplifikasi, dengan perkiraan ukuran produk amplifikasi sebesar
1000 pb.

Reaksi amplifikasi total volume sebesar 25 uL, terdiri atas:

1. 1 uL DNA templat
2. 1 uL primer BC57 (10 uM)
3. 1 uL primer BC58 (10 uM)
4. 12,5 uL Go Taq Green Master Mix 2x
5. 9,5 uL H2O

CARA KERJA

1. Tahapan denaturasi awal pada 94C selama 3 menit

2. Sebanyak 35 siklus yang terdiri atas denaturasi pada 94C selama 30 detik
3. Penempelan primer pada 50C selama 1 menit
4. Sintesis pada 72C selama 1 menit 10 detik
5. Tambah 10 menit pada 72C untuk tahap sintesis akhir

Visualisasi hasil amplifikasi DNA menggunakan,

1. Gel agarosa 1 % dalam 25 mL buffer Tris-Borat EDTA (TBE) 0,5x
2. Sebanyak 7 uL penanda DNA (1kb)
3. Kemudian 7 uL DNA hasil amplifikasi dimasukan kedalam sumuran gel agarose
4. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt selama 30 menit dan hasil elektroforesis
diamati dibawah transluminator ultraviolet.