com
Isolasi Bakteri Asam Laktat Yang Menghasilkan Protease dan Sejenis Bakteriosin
Zat Dari Kepiting Bakau (Scyllasp.) Saluran Pencernaan
Abstrak
Isolasi Bakteri Asam Laktat yang Menghasilkan Protease dan Senyawa Bacteriocin-Like
dari Saluran Pencernaan Kepiting (Scylla sp.)
Saluran pencernaan merupakan kompleks lingkungan bakteri yang terdiri atas berbagai spesies. Saluran pencernaan biota perairan terdiri atas bakteri aerob dan anaerob
yang mampu memproduksi senyawa antibakteri dan enzim. Tujuan penelitian ini adalah untuk menginokulasi bakteri asam laktat yang menghasilkan protease dan
senyawa bakteriosin-like dari usus pencernaan kepiting bakau. Isolasi dan karakterisasi isolat dilakukan menggunakan media MRS. Supernatan netral bebas sel isolat telah
diuji dengan menggunakan disc difusi agar terhadap bakteri patogen dan pembusuk. Uji produksi enzim protease telah diuji dengan metode disc difusi agar
menggunakan media kasein agar. Di antara seratus isolat, terdapat 96 isolat menunjukkan zona bening di MRS + CaCO3, katalase negatif, dan bakteri Gram positif. Tiga
puluh empat isolat bakteri asam laktat menghasilkkan protease dan hanya empat isolat (yaitu IKP29, IKP30, IKP52, dan IKP94) menunjukkan penghambatan yang kuat
terhadap bakteri patogen dan pembusuk. Terdapat tiga pola inhibisi dari keempat isolate terhadap Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan Salmonella
sp. Empat isolat tersebut berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai starter pada produksi yang memicu hasil memancing. Penelitian ini adalah penelitian pertama terkait
isolasi bakteri asam laktat yang menghasilkan protease dan bakteriosin dari pencernaan usus dari kepiting bakau. Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan Salmonella
sp. Empat isolat tersebut berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai starter pada produksi yang memicu hasil memancing. Penelitian ini adalah penelitian pertama terkait
isolasi bakteri asam laktat yang menghasilkan protease dan bakteriosin dari pencernaan usus dari kepiting bakau. Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan Salmonella
sp. Empat isolat tersebut berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai starter pada produksi yang memicu hasil memancing. Penelitian ini adalah penelitian pertama terkait
isolasi bakteri asam laktat yang menghasilkan protease dan bakteriosin dari pencernaan usus dari kepiting bakau.
Kata kunci:asam asam laktat, senyawa seperti bakteriosin, protease, Scylla sp.
Abstrak
Saluran pencernaan merupakan lingkungan yang kompleks yang terdiri dari sejumlah besar spesies bakteri. Bakteri usus
ikan terdiri dari bakteri aerob atau anaerob fakultatif yang dapat menghasilkan antibakteri dan enzim. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk mengisolasi bakteri asam laktat penghasil bacteriocin-like dan protease dari saluran
pencernaan kepiting bakau. Isolasi dan karakterisasi isolat dilakukan dengan media MRS. Supernatan bebas sel yang
dinetralkan dari isolat diuji menggunakan agar difusi cakram terhadap bakteri patogen dan pembusuk untuk
menunjukkan bakteri asam laktat penghasil seperti bakteriosin. Isolat penghasil protease diuji dengan metode difusi
cakram pada kasein agar. Dari 100 isolat, 96 isolat menunjukkan zona bening MRS+CaCO3,, katalase negatif, dan bakteri
gram positif. Tiga puluh empat isolat menghasilkan protease dan hanya empat isolat (yaitu IKP29, IKP30, IKP52, dan
IKP94) yang menunjukkan daya hambat kuat terhadap bakteri patogen dan pembusuk. Terdapat tiga pola inhibisi
diantara ketiga isolat terhadap Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan Salmonella sp. Ketiga isolat
menunjukkan potensi penggunaan untuk menghasilkan kultur starter untuk tujuan fermentasi produk perikanan. Ini
merupakan laporan pertama isolasi bakteri asam laktat penghasil protease dan bacteriocin-like dari saluran pencernaan
kepiting bakau.
Kata kunci:bakteri asam laktat, zat mirip bakteriosin, protease, Scylla sp.
karena dapat menghasilkan asam organik, H2HAI2, ke media deMan, Rogosa, dan Sharpe (MRS, Merck) yang
reuterin dan bakteriosin. Bakteriosin adalah peptida disiapkan dalam air laut (30 ppt) dan ditambah dengan
antimikroba yang disintesis secara ribosom yang 0,5% CaCO3kemudian diinkubasi di 37HAIC selama 24 jam.
diproduksi oleh bakteri, dan sering menghadirkan Bakteri yang menunjukkan zona bening di sekitar koloni
efek bakterisidal terhadap spesies yang berkerabat diambil secara aseptik kemudian digoreskan ke dalam
dekat (Cotteret al., 2005). BAL telah diisolasi dari media MRS dan diinkubasi 37HAIC. Kultur murni dari cawan
lingkungan seperti sedimen mangrove, daun, dan air diuji untuk prosedur pewarnaan katalase dan Gram. Isolat
(Hwanhlemet al., 2014), produk buku harian yang menunjukkan katalase negatif dan Gram positif
(Iranmaneshet al., 2014), butir kefir (Zaniratiet al., diambil ditambahkan gliserol 50% dan disimpan dalam
2015), ikan fermentasi (Hwanhlemet al., 2014; Adnan freezer (-10HAIC) sebelum digunakan untuk pengujian
dan Tan, 2007), usus ikan (Kudaet al., 2014; Gurovićet selanjutnya.
al., 2014; Huanget al., 2014), dan rajungan (Talpuret
al., 2012) namun penelitian mengenai isolasi BAL Skrining bakteri penghasil protease
mirip bakteriosin dari saluran pencernaan kepiting
bakau masih terbatas (Scyllasp.). Isolat BAL dicairkan dan 100 μL pertumbuhan
kultur induk dalam satu mL kaldu MRS selama 18 jam.
Protease adalah enzim yang paling penting untuk Sepuluh µL biakan diteteskan dalam cakram kertas steril
tujuan industri dan fermentasi. Mikroba protease dan diletakkan di atas agar kasein (susu skim 1%, agar
merupakan kelompok enzim yang dapat 1,5%, pH 6,5) kemudian diinkubasi 2-3 hari. Isolat yang
menghasilkan protease memperlihatkan zona bening di
diaplikasikan di berbagai industri, proses farmasi,
sekitar paper disc.
industri makanan, ekstraksi minyak,dll.. (Borlaet al.,
2010). Bakteri proteolitik berperan penting sebagai
Aktivitas antimikroba
starter kultur untuk fermentasi. Fungsi peptidase
bakteri pada fermentasi daging adalah memecah
Isolat yang menunjukkan aktivitas proteolitik
oligopeptida menjadi asam amino (Sanzet al., 1999).
uji aktivitas antimikroba menggunakan metode disc difusi
Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini bertujuan agar terhadap enam bakteri indikator (Tabel 1). Sepuluh μL
untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi BAL yang biakan 24 jam diteteskan pada cakram kertas steril dan
menghasilkan zat mirip bakteriosin dan protease diletakkan di permukaan agar tryptone soya yang dilapisi
dari saluran pencernaan sebagai kandidat starter oleh bakteri indikator. Plate diinkubasi di 37HAIC selama 24
kultur untuk fermentasi produk perikanan. jam. Aktivitas antimikroba positif ditunjukkan dengan zona
bening yang dikelilingi paper disc yang mengandung isolat
Bahan dan metode bakteri asam laktat.
Kepiting bakau dibeli sebanyak 12 ekor dari nelayan Aktivitas zat seperti bakteriosin
kawasan mangrove Gunung Sari, Surabaya pada bulan
Desember 2014. Kepiting bakau diambil dengan cool box Isolat yang menunjukkan aktivitas antimikroba
berisi es (±5HAIC. ke laboratorium. dikultur dalam tabung mikro 1,5 mL selama 18 jam dan
sentrifus 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan
Pemisahan saluran pencernaan dipindahkan ke tabung mikro steril dan pH diatur menjadi
6,5 sebelum pemanasan 100HAIC selama 3 menit untuk
Saluran pencernaan diambil dari spesimen menonaktifkan enzim dan bakteri yang selanjutnya disebut
kepiting bakau menurut Talpuret al.(2012). Spesimen neutralized cell free supernatan (NCFS). Sepuluh mL NCFS
kepiting bakau disemprot dengan alkohol 70% sebelum dipindahkan ke dalam kertas cakram steril dan diletakkan
dilakukan segregasi. Pemisahan dilakukan dengan di atas permukaan MRS yang dilapis
pisau bedah dari bagian perut ke rongga bukal. Saluran L. plantarum. Aktivitas zat mirip bakteriosin yang positif
pencernaan kepiting bakau diambil langsung dengan ditunjukkan dengan zona bening yang dikelilingi paper disc
menggunakan pinset steril. yang mengandung NCFS isolat BAL.
Tabel 1.Bakteri indikator yang digunakan untuk antimikroba mampu tumbuh pada pH rendah karena tidak dapat
tes aktivitas mempertahankan kondisi homeostatis sel dan
mengakibatkan kematian sel. Kemampuan bakteri asam
Isolat Gram laktat yang diperoleh dari saluran pencernaan kepiting
Lactobacillus plantarum Positif bakau dalam menghambat pertumbuhan bakteri gram
Bacillus subtilis Positif positif dan gram negatif merupakan karakter penting
Staphylococcus aureus Positif dalam aplikasi bakteri sebagai agen biopreservatif.
Escherichia coli Negatif
Pseudomonassp. Negatif Empat isolat BAL mampu menghambat
Salmonella sp. Negatif pertumbuhan bakteri patogen yang biasa terdapat pada
produk pangan,S.aureusDanSalmonellasp. Hal ini sesuai
dengan yang diperoleh Hor dan Liong (2014) yang
diperoleh 21 isolat bakteri asam laktat pada saluran menunjukkan bahwa bakteri asam laktat dapat menghambat
pencernaan ikan kerapu macan berbentuk bulat dengan pertumbuhan bakteri asam laktat.S.aureus. Temaet al. (2014)
diameter 0,25-2 mm berwarna putih atau krem. Jokovic menyatakan bahwa bakteri asam laktat dihambat
et al. (2008) telah mencoba metode pengarahan dan E.coli, Salmonella paratyphii,DanListeria monocytogenes.
pengayaan untuk isolasi bakteri asam laktat pada Kemampuan BAL dalam menghambat bakteri patogen
produk tradisional Serbia yang terbuat dari susu menunjukkan bahwa keempat isolat BAL yang diperoleh
(kajmak). Jokovicet al.(2008) menunjukkan bahwa isolasi berpotensi untuk diaplikasikan sebagai biopreservasi.
bakteri asam laktat dengan metode pengayaan lebih Dilihat dari kemampuan keempat isolat tersebut dalam
efektif untuk mendapatkan hasil yang lebih baik karena menghasilkan protease, maka keempat isolat tersebut
bakteri asam laktat yang terkandung dalam produk dapat digunakan sebagai starter produk fermentasi ikan
dalam jumlah yang sedikit. yang mampu menjaga keamanan pangan fermentasi.
Hasil skrining produksi protease Supernatan bebas sel yang dinetralkan dari empat
Isolat BAL 96 menunjukkan bahwa 34 isolat (35,41%) isolat tersebut diuji aktivitasnya terhadap bakteri asam laktat
mampu menghasilkan protease. Hal ini ditunjukkan L. plantarumdiuji. Tes dilakukan menggunakan
dengan adanya zona bening pada medium kasein agar. LAB sepertiLactobacillus sakeisubsp sakiJCM 1157
Udomsilet al. (2010) telah mengisolasi 64 isolat asam (Hwanhlemet al., 2014). Penggunaan Lactobacillus
laktat penghasil protease dari kecap ikan. Protease brevisAP83,L.brevisH56,L. plantarumAP76,L.
bakteri umumnya digunakan untuk memecah plantarumH12 dilakukan oleh Ghanbari,et al.,
oligopeptida menjadi asam amino (Sanzet al., 1999). Hal (2013). Berdasarkan penelitian ini,
tersebut merupakan salah satu kriteria penting suatu L. plantarumdapat digunakan sebagai indikator untuk menguji
aktivitas bakteri dalam menghasilkan bakteriosin.
isolat BAL dapat digunakan sebagai starter dalam
produksi fermentasi ikan. Hal yang sama, Zhenget al.
Meja 2. Aktivitas antimikroba lima isolat BAL
(2014) menyatakan bahwa bakteri asam laktat penghasil
terhadap bakteri indikator
protease merupakan salah satu kriteria penting untuk
menghasilkan aroma pada produksi fermentasi ikan. isolat LAB
Bakteri indikator
IKP29 IKP30 IKP53 IKP94
Aktivitas antimikroba Bacillus subtilis - - - -
Stafilokokus
+ + - -
Hasil tes menunjukkan bahwa mikroba aureus
aktivitas 34 isolat yang menghasilkan protease, terdapat Escherichia coli + - + +
24 isolat yang menunjukkan zona hambat terhadap Pseudomonassp. + + + +
bakteri indikator (Tabel 2). Diantara 24 isolat terdapat Salmonellasp. + + + +
empat isolat yang menunjukkan aktivitas antimikroba
yang tinggi terhadap beberapa bakteri indikator,yaitu Hal ini disebabkan BAL tidak dihambat oleh asam
IKP29, IKP30, IKP52, dan IKP94. Terdapat tiga pola organik dan H2HAI2tetapi dihambat oleh bakteriosin.
inhibisi diantara keempat isolat tersebut. NCSF Isolat IKP29, IKP30, IKP53 dan IKP94 menghambat
pertumbuhanL. plantarummulai dari 3 hingga 4 mm.
Bakteri asam laktat mampu menghasilkan
asam organik, H2HAI2, reuterin dan bakteriosin yang
menghambat pertumbuhan bakteri lain dalam Hasil penelitian menunjukkan bahwa penghambatan
ekosistem (Cotteret al., 2005). Asam organik yang bakteri oleh keempat isolat dilakukan oleh bakteriosin
dihasilkan oleh bakteri asam laktat menyebabkan sekaligus menghasilkan asam organik dan hidrogen peroksida.
lingkungan menjadi asam sehingga bakteri tidak Aslimet al. (2005) menyatakan bahwa penghambatan
Rurangwa, E., JL Laranja, R. Van Houdt, Y. Delaedt, zat antimikroba yang dihasilkan oleh
Z. Geraylou, & T. Van de Wiele. 2009. intervensi keamanan pangan Bakteri Asam
Karbohidrat dan prebiotik pilihan yang tidak Laktat komersial.Mikrobiol Pangan.
dapat dicerna mendukung pertumbuhan 38:192-200. doi:10.1016/j.fm.2013.09.006.
monokultur bakteri probiotik ikan secara in
vitro.J.Appl. Mikrobiol.106:932–940. Udomsil, N., S. Rodtong, S. Tanasupawat & J.
doi:10.1111/j.136 5-2672.2008.04034.x. Yongsawatdigul. 2010. Bakteri asam laktat
halofilik penghasil proteinase yang diisolasi dari
Sanz, Y., S.Fadda, G.Vignolo, M.Aristoy, G.Oliver, & fermentasi kecap ikan dan kemampuannya
F.Toldra. 1999. Hidrolisis protein miofibril menghasilkan senyawa volatil.Int. J. Mikrobiologi
otot olehLactobacillus curvatus dan Pangan141(3): 186-194. doi:10.1016/
Lactobacillus sakei.Int. J. Makanan Mikrobiol j.ijfoodmicro.2010.05.016.
. 53(2):115-125. doi:10.1016/S01681605
(99)00134-8. Zanirati,D,F.,M.Abatemarco Jr.,SH de Cicco-
Sandes, JR Nicoli, Á. C. Nunes & E.
Talpur, AD, AJ Memon, MI Khan, M.Ikhwanuddin, Neumann. 2015. Pemilihan bakteri asam
MMD Daniel. & AB Abol-Munafi. 2012. laktat dari biji kefir Brazil untuk
Isolasi dan skrining bakteri asam laktat dari penggunaan potensial sebagai kultur
usus rajungan,P.pelagicus, sebuahin vitrouji starter atau probiotik.
32:70-76.Anaerob
doi:10.1016/j.
penghambatan dan skala kecilin vivomodel anaerob.2014.12.007.
untuk validasi isolat sebagai probiotik.J.
Ikan. Aku. Sains.7(1):1- 28. doi:10.3923/ Zheng, X., W. Xia, J. Wang, Q. Jiang, Y. Xu, H.
jfas.2012.1.28. Wang.2014. Sifat teknologi dari Lactobacillus
plantarumgalur yang diisolasi dari ikan utuh
Thelma F., Cálix-Lara, M. Rajendran, ST Talcott, fermentasi garam rendah tradisional Cina.
SB Smith, RK Miller, A.Castillo, JM Sturino & Kontrol Makanan.40:351-358. doi:10. 1016/
TM Taylor.2014. Penghambatan Escherichia j.foodcont.2013.11.048.
coliO157:H7 dan Salmonella enterica pada
bayam dan identifikasi