Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

www.nature.com/scientificreports

MEMBUKA
Mendeteksi Metode Penghitungan Molekul
Tunggal yang Cepat, Akurat
Clostridium difficileToksin B dalam
Sampel Tinja
Diterima: 2 Februari 2018
Diterima: 10 Mei 2018
Diterbitkan: xx xx xxxx
Sadanand Gite1, Destiny Archambault1, Michael P. Cappillino1, David Cunha1, Victoria Dorich1,
Tatyana Shatova1, AndrewTempesta1, Bruce Walsh1, Jessica A. Walsh1, AdamWilliams1, James E.
Kirby2, Jayson Bowers1&Dan Straus1

Kami menjelaskan teknologi baru berbasis immunoassay yang cepat dan akurat yang mampu menghitung target tunggal
molekul menggunakan pencitraan digital tanpa pembesaran. Menggunakan teknologi, kami mengembangkan cepat tes
untukClostridium difficiletoksin B, yang bertanggung jawab atas patologi yang mendasari berpotensi fatal
C.sulitinfeksi (CDI). Saat ini tidak ada tes untuk CDI yang cepat, sensitif, dan spesifik. MultiPathC.sulit
gambar uji toksin B dan menghitung kompleks partikel magnetik dan fluoresen spesifik target yang
telah ditambatkan bersama oleh molekul toksin B dalam sampel tinja yang diproses secara minimal.
Karakteristik kinerja tes 30 menit meliputi batas deteksi 45 pg/mL, rentang dinamis yang mencakup
4-5 kali lipat, dan koefisien variasi kurang dari 10%. Tes MultiPath mendeteksi semua toxinotypes dan
ribotypes yang diuji, termasuk yang paling sering terjadi di AS dan UE; tidak menunjukkan reaktivitas
silang dengan spesies bakteri yang relevan; dan kuat terhadap gangguan potensial yang biasanya ada
dalam sampel tinja. Pada set pelatihan 320 klinis sampel tinja, MultiPathC.sulituji toksin B
menunjukkan sensitivitas 97,0% (95% CI, 91,4–99,4%); spesifisitas 98,3% (95% CI, 96,8–99,2%); dan
akurasi 98,2% (95% CI, 96,7–99,0%) dibandingkan dengan metode referensi uji netralisasi sitotoksisitas
seluler (CCNA). Berdasarkan karakteristik performa yang menarik ini, kami yakin teknologi MultiPath
dapat mengatasi kekurangan yang cepat, tes diagnostik yang sensitif, spesifik, dan mudah digunakan
untukC.sulit.

Kemampuan untuk mendeteksi dan mengukur protein yang penting secara biologis sangat penting untuk diagnosa
medis. Dalam kasus diagnosa penyakit menular, deteksi protein spesifik patogen adalah metode yang umum digunakan
untuk mengidentifikasi penyakit. Contohnya termasuk tes untuk influenza, hepatitis B, human immunodeficiency virus,
Legionella, Cryptococcus,Plasmodiumantigen, dan racun yang disekresikan terkait denganC.sulitradang usus besar.
Teknologi yang saat ini digunakan di laboratorium klinis meliputi uji imunosorben terkait-enzim otomatis (ELISA) dan uji
aliran lateral yang cepat. Namun, teknologi immunoassay saat ini memiliki beberapa keterbatasan sehubungan dengan
sensitivitas pengujian, kecepatan, kemampuan multipleks, dan/atau kemudahan penggunaan. Sensitivitas rendah dari
teknologi immunoassay standar telah membatasi penggunaan dan kegunaannya dalam mendeteksi penyakit menular di
mana konsentrasi antigen rendah. Contohnya adalah sensitivitas yang tidak mencukupi (50-70%) dari tes deteksi antigen
influenza yang banyak digunakan di tempat perawatan.1. Demikian pula, sensitif saat iniC.sulittes toksin telah
menghalangi penggunaan yang dapat diandalkan dalam diagnosisC.sulitkolitis dan telah menyebabkan ketergantungan
klinis saat ini pada teknologi alternatif yang memiliki karakteristik kinerja yang kurang diinginkan.C.sulitkolitis menyerang
sekitar 453.000 pasien dan mengakibatkan sekitar 29.000 kematian setiap tahunnya di AS2. Ini disebabkan oleh aksi
sitotoksin yang diuraikan oleh anaerobikC.sulit pada epitel usus besar. Infeksi dapat mengubah hidup, berulang, dan
sering membutuhkan terapi berulang dan bahkan transplantasi tinja untuk penyembuhan. Sekitar 2% dari populasi
normal dijajah olehC.sulit. Namun, toksinlah, bukan sekadar keberadaan organisme, yang terkait dengan penyakit.

1BiosainsCahaya Pertama, 1 Oak Park Drive, Bedford, MA, 01730, AS.2Pusat Medis Deaconess Beth Israel, 330
Brookline Ave, Boston, MA, 02215, AS. Korespondensi dan permintaan materi harus dialamatkan ke SG (email:
sadanand@firstlightbio.com)

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 1
www.nature.com/scientificreports/

Dengan demikian, pasien dengan aktifC.sulitinfeksi dapat dibedakan dari kolonisasi dengan menguji produksi toksin. Namun,
platform pengujian toksin yang tersedia secara komersial saat ini seperti enzyme immunoassays (EIA) tidak sensitif3,4. Tes
alternatif, uji sitotoksisitas berbasis kultur jaringan sensitif, tetapi membutuhkan waktu 1-3 hari untuk dilakukan dan sangat
kompleks. Oleh karena itu sebagian besar digunakan hanya sebagai metode referensi. Tes lain dalam praktik klinis termasuk tes
amplifikasi asam nukleat (NAAT). Meskipun, NAAT sangat sensitif, mereka juga tidak spesifik, seperti yang mereka deteksiC.sulit
gen toksin terlepas dari produksi toksin. Penggunaannya menyebabkan kebingungan klinis, pengobatan berlebihan, dan potensi
keterlambatan dalam diagnosis penyakit alternatif5. Beberapa algoritme mengombinasikan uji sensitif, seperti NAAT atau uji
antigen untukC.sulitenzim glutamat dehidrogenase, dengan tes antigen yang lebih spesifik untuk toksin6. Namun, algoritme ini
tidak sepenuhnya mengatasi kekurangan komponen pengujian individu dan menciptakan kerumitan yang tidak diinginkan untuk
laboratorium diagnostik.
Oleh karena itu, tes diagnostik yang ideal untukC.sulitkolitis akan menjadi tes deteksi antigen toksin yang cepat dan
sangat sensitif, karena harus terbukti sensitif dan spesifik untukC.sulit-penyakit terkait3,7. Gagasan ini telah didukung oleh
pembaruan terkini pada pedoman praktik klinis untuk diagnosisC.sulitinfeksi8. Beberapa teknologi immunoassay yang
cepat dan sensitif sedang dikembangkan tetapi belum digunakan secara komersial7,9. Contohnya termasuk teknologi
immunoassay yang mendeteksi modulasi refleksi internal total, molekul tunggal dalam sumur femtoliter, dan molekul
tunggal yang mengalir melalui tabung kapiler.10–12. Selain itu, teknologi baru berdasarkan deteksi elektrokimia,
nanomekanis, atau piezoelektrik, atau deteksi optik supersensitif mungkin memiliki aplikasi potensial dalam
pengembangan immunoassay generasi mendatang.13,14. Terjemahan klinis dan adopsi luas dari teknologi yang muncul ini
bergantung pada kemampuannya untuk memberikan karakteristik kinerja yang optimal dalam platform yang cepat,
mudah digunakan, dan terjangkau.
Di sini, kami menyajikan data yang menunjukkan potensi teknologi immunoassay MultiPath baru untuk memberikan
tes yang sangat sensitifC.sulitantigen toksin B. Teknologi menghitung molekul target tunggal dengan peralatan optik
sederhana, persiapan sampel minimal, dan waktu penyelesaian yang cepat dalam format sampel-ke-jawaban. Kami
menunjukkan kesetaraan dalam kinerja dengan metode referensi uji sitotoksisitas toksin B yang sangat sensitif yang
digunakan untuk izin peraturanC.sulittes toksin.

Hasil
teknologi MultiPath.Teknologi pencitraan MultiPath mendeteksi molekul yang diberi label dengan nanopartikel yang diwarnai
dengan fluoresensi menggunakan pencitraan digital tanpa pembesaran (Gbr. 1).1a). Menerangi label nanopartikel fluoresen
menyebabkannya memancarkan foton yang dikumpulkan menggunakan lensa relai 1:1 f/4. Cahaya yang dipancarkan oleh sebuah
partikel menimpa sekelompok kecil piksel pada chip CMOS kamera digital yang membentuk bintik-bintik putih pada gambar yang
dihasilkan (Gbr. 1).1b). Pada konsentrasi analit rendah, penghitungan digital target berlabel individual menghasilkan rasio sinyal
terhadap noise yang lebih baik dibandingkan dengan hanya mengintegrasikan sinyal dari seluruh area deteksi. Pencitraan yang
tidak diperbesar memungkinkan bidang besar untuk dicitrakan, memungkinkan deteksi sejumlah kecil molekul target dalam
volume sampel yang besar dalam milidetik.
Angka1cmengilustrasikan bagaimana teknologi MultiPath dapat menghitung target tertentu dalam sampel tanpa memerlukan
langkah persiapan atau pencucian sampel. Sampel pertama-tama dicampur dengan pengencer dan imunoreagen spesifik target,
yang terdiri dari partikel fluoresen dan magnetik yang dilapisi dengan antibodi komplementer spesifik untuk target (C.sulittoksin B
dalam pekerjaan ini). Campuran uji kemudian ditambahkan ke sumur mikrotiter beralas bening, yang bagian bawahnya telah
dilapisi dengan reagen bantalan pewarna kering. Pereaksi bantalan pewarna adalah campuran pewarna yang menyerap cahaya
tampak (Direct Black 19 dalam percobaan ini) dan agen kepadatan, iodixanol (OptiPrep ™). Bantalan pewarna kering menyusun
kembali setelah penambahan campuran pengujian dan membentuk lapisan berair padat buram di bawah lapisan pengujian.
Cahaya tidak dapat menembus lapisan bantalan pewarna ke lapisan pengujian (Gbr.1d). Fitur ini secara optik memisahkan label
fluoresen yang tidak terikat dan matriks sampel dari permukaan pencitraan. Oleh karena itu, bantalan pewarna meniadakan
kebutuhan persiapan sampel yang melelahkan dan langkah pencucian yang diperlukan dalam format uji imuno lainnya untuk
menghilangkan sinyal latar belakang yang disebabkan oleh komponen label dan matriks sampel yang tidak terikat.

Memperkirakan kinerja analitik MultiPathC.sulittes toksin B.Mengembangkan

uji MultiPath khusus untukC.sulit, kami mengkonjugasikan partikel magnetik dan fluoresen ke antibodi monoklonal
murine komplementer yang dinaikkanC.sulittoksin B. Ketika sampel tinja yang mengandung toksin B digabungkan
dengan reagen ini, molekul toksin B akan mengikat dan menambatkan partikel magnetik dan fluoresen, yang kemudian
dapat dihitung seperti dijelaskan di atas (Gbr.1). Untuk memperkirakan sensitivitas analitis MultiPath
C.sulittes toksin B dalam matriks feses, kami menggunakan sampel feses gabungan yang terdiri dari 14 sampel klinis yang dipilih
secara acak yang memberikan hasil negatif saat diuji dengan PCR waktu nyataC.sulituji. Kami menguji sampel gabungan yang
dibubuhiC.sulittoksin B dalam serangkaian pengenceran dua kali lipat. Angka2menunjukkan bahwa metode memberikan batas
deteksi 45 pg/mL untukC.sulittoksin B. Hasil serupa juga diamati ketika kami menggunakan kumpulan sampel tinja negatif PCR
yang berbeda (data tidak ditampilkan). Pada konsentrasi toksin B 45 pg/mL, reaksi mengandung sekitar 100 kali lipat kelebihan
partikel magnetik dibandingkan dengan jumlah molekul toksin B. Pada konsentrasi analit ini, partikel magnetik dan fluoresen, rata-
rata, harus ditambatkan bersama oleh molekul toksin B tunggal yang mengonfirmasi bahwa teknologi MultiPath mendeteksi
molekul tunggal dengan pencitraan tanpa menggunakan pembesaran. Selanjutnya, profil presisi pada Gambar.3menunjukkan
koefisien variasi (CV) di bawah 10% untuk data yang ditunjukkan pada Gambar.2, menunjukkan potensi metode untuk memberikan
hasil yang dapat direproduksi pada konsentrasi toksin B yang rendah.
Angka4menunjukkanC.sulitrespons dosis uji toksin B dalam sampel tinja yang dikumpulkan yang mengandung
berbagai konsentrasi yang ditambahkan secara eksogen yang dimurnikanC.sulittoksin B. Data pada dasarnya linier pada
rentang konsentrasi 4-5 orde magnitudo hingga sekitar 1 μg/mL, di atasnya respons stabil. Perhatikan bahwa mencakup
rentang ini melebihi tingkat tertinggiC.sulittoksin B dilaporkan secara klinis, sekitar 100 ng/mL15.

Kontrol pengujian mendeteksi dan mengurangi efek matriks.Kami merancang pengujian yang positif dan menetralkan
trols untuk memfasilitasi deteksi dan mitigasi selanjutnya dari efek matriks sampel. Assay mengontrol dan toksin

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 2
www.nature.com/scientificreports/

Gambar 1.(sebuah) Teknologi MultiPath menggunakan pencitraan digital yang tidak diperbesar untuk menghitung partikel
fluoresen mikroskopis yang terikat pada target molekuler. Cahaya dari partikel mikroskopis mengenai satu atau sekelompok kecil
piksel pada chip kamera menciptakan titik putih pada gambar. (b) Gambar yang tidak diperbesar dari
C.sulituji toksin B menunjukkan partikel fluoresen mikroskopis individu yang telah ditambatkan oleh molekul toksin B ke partikel
magnetik, ditarik melalui bantal pewarna, dan diendapkan pada permukaan pencitraan. (c) Molekul target menambatkan
partikel fluoresen dan magnetik spesifik target secara bersamaan. Partikel magnetik dan partikel fluoresen apa pun yang terikat
pada partikel magnetik ditarik melalui lapisan bantalan pewarna buram yang padat dan dicitrakan. Bantalan pewarna dalam
sumur pencitraan pengujian menghilangkan kebutuhan untuk langkah pencucian dan meminimalkan persiapan sampel. (d)
Gambar sumur yang mengandung partikel tidak terikat di atas lapisan bantal dengan atau tanpa pewarna menunjukkan
keefektifan bantalan pewarna untuk menghilangkan latar belakang dari partikel fluoresen yang tidak terikat.

Gambar 2.Sensitivitas analitis dariC.sulittes toksin B. Sumbu y mencerminkan sinyal. Sumbu x mencerminkan jumlah
toksin B yang dimurnikan yang dibubuhi sampel tinja yang terkumpul. Bilah kesalahan sesuai dengan standar deviasi
titik data yang tidak berduri (n=24) dan berduri (n=12). Batas deteksi ditunjukkan dalam inset.

Tes B dilakukan secara paralel menggunakan alikuot yang sama dari campuran yang mengandung sampel klinis dan reagen uji.
Kontrol positif mencakup sejumlah toksin berduri (100 pg). Penyimpangan sinyal kontrol positif yang lebih rendah dari tingkat
yang diharapkan menunjukkan gangguan pengujian negatif (inhibisi pengujian). Kontrol netralisasi mengandung antibodi
penawar toksin B yang secara kompetitif berikatan dengan toksin B dalam sampel klinis, pembuatan

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 3
www.nature.com/scientificreports/

Gambar 3.Profil presisi dariC.sulituji toksin B. CV dari pengukuran dari Gambar.2ditampilkan.

Gambar 4.Respon dosis dan rentang dinamis dariC.sulituji toksin B. Protein toksin B yang dimurnikan
dibubuhi campuran sampel tinja yang terkumpul pada konsentrasi yang ditunjukkan. Bilah kesalahan sesuai
dengan standar deviasi 6 ulangan.

itu tidak terdeteksi dalam pengujian. Dengan cara ini, kontrol netralisasi membedakan sinyal spesifik yang berasal dari toksin B
dalam sampel dari sinyal non-spesifik. Sinyal non-spesifik dapat dihasilkan dari pengendapan independen analit dari partikel
fluoresen atau komponen sampel fluoresen otomatis pada permukaan pencitraan. Dalam karya ini, kami menggunakan satu set
pelatihan sampel klinis untuk secara empiris menetapkan ambang batas sinyal, netralisasi, dan interferensi untuk
mengoptimalkan akurasi diagnostik relatif terhadap metode referensi uji sitotoksisitas.
Angka5agrafis menunjukkan matriks keputusan untuk panggilan positif dan negatif olehC.sulituji. Matriks
keputusan terdiri dari 2 ambang, ambang sinyal (pada sumbu x) dan ambang netralisasi (pada sumbu y). Hanya
sampel yang melebihi ambang sinyal dan jatuh di bawah ambang netralisasi yang disebut positif. Ini
divisualisasikan sebagai panggilan positif di kuadran kanan bawah pada Gambar.5a,bdan panggilan negatif
untuk tiga kuadran lainnya. Selain itu, jika interferensi terdeteksi pada kontrol positif (>75% perubahan
dibandingkan dengan sinyal yang diharapkan), sampel dinyatakan tidak valid (data tidak ditampilkan).

Akurasi MultiPathC.sulittes toksin B pada sampel klinis.Menggunakan MultiPathC. perbedaan

berubah-ubahuji toksin B yang dijelaskan di atas, kami menganalisis 320 sampel feses klinis dari pasien yang diduga
menderitaC.sulitinfeksi. Sampel diuji dalam rangkap dua. Hasil dari rangkaian pelatihan sampel ini dibandingkan dengan
hasil metode referensi uji sitotoksisitas toksin B. Kami menggunakan analisis Receiver Operator Curve untuk secara
empiris mengembangkan ambang pengujian untuk mengoptimalkan akurasi. Dari 320 sampel klinis, hanya satu sampel
(keduanya ulangan) yang ditolak dari analisis ini karena menunjukkan lebih dari 98% penghambatan kontrol positif.
Angka5bmemplot hasil set pelatihan. Data tersebut menggambarkan bahwa ambang batas yang dipilih secara efektif
membedakan sampel positif dan negatif. Sampel yang mendapat skor positif menggunakan uji sitotoksisitas (titik merah) hampir
seluruhnya berada dalam kuadran kanan bawah, mewakili sampel dengan sinyal yang dapat dinetralkan secara signifikan.
Sebaliknya, sampel yang mendapat skor negatif dengan uji referensi (titik biru) hampir seluruhnya berada di salah satu dari tiga
kuadran lain yang mewakili hasil yang memiliki sinyal rendah, sinyal tidak dapat dinetralkan, atau keduanya. Angka5c
membandingkan hasil MultiPathC.sulittes toksin B untuk uji sitotoksisitas referensi. Menggunakan ambang batas yang dipilih,
metode baru yang disajikan di sini mencapai sensitivitas 97,0% (95% CI, 91,4–99,4%); spesifisitas 98,3% (95% CI, 96,8–99,2%); dan
akurasi 98,2% (95% CI, 96,7–99,0%) bila dibandingkan dengan metode referensi uji sitotoksisitas.

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 4
www.nature.com/scientificreports/

Gambar 5.Hasil dariC.sulituji toksin B menggunakan sampel klinis. Sumbu x sesuai dengan sinyal MultiPath
untuk sampel klinis. Sumbu y mencerminkan fraksi dari sinyal yang tersisa di hadapan antibodi penawar
terhadap toksin B. (sebuah) adalah representasi grafis dari algoritma untuk memanggil positif dan (b)
menunjukkan data dari penelitian. Titik merah mewakili sampel yang disebut positif dengan metode referensi
(CCNA), dan titik biru adalah negatif dengan metode referensi. (c) menunjukkan sensitivitas, spesifisitas, dan
akurasi MultiPathC.sulittes toksin B relatif terhadap uji sitotoksisitas referensi.

Kami juga melakukan studi inklusivitas analitik, eksklusivitas, dan interferensi yang menunjukkan bahwa tes tersebut kuat
untuk variabel-variabel ini (lihat data dalam hasil tambahan).

Diskusi
Teknologi MultiPath menawarkan metode baru untuk deteksi penanda diagnostik yang cepat dan sensitif secara langsung dalam
sampel pasien yang kompleks. Kami mendemonstrasikan potensi teknologi MultiPath dengan merancang tes yang cepat dan
akurat untuk infeksi gastrointestinal yang mengancam jiwa yang disebabkan olehC.sulit, yang menyebabkan lebih banyak infeksi
terkait perawatan kesehatan daripada patogen mikroba lainnya16. Sensitivitas analitik 30 menitC.sulittes toksin B dalam sampel
feses adalah 45 pg/ml, yang lebih dari 15 kali lebih sensitif daripada EIA terkemuka17,18. Kami juga menunjukkan bahwa keakuratan
hasil sampel klinis lebih tinggi jika dibandingkan dengan CCNA, metode rujukan yang sensitif dengan sensitivitas analitis hingga
sekitar 1,5 pg/ml tanpa adanya matriks sampel.19. Format bantal pewarna yang unik memungkinkan pendeteksian dengan
pemrosesan sampel minimal karena secara optikal memisahkan sampel dan label yang tidak terikat dari permukaan pencitraan.
Kotoran hanya diencerkan dan melewati saringan jaring nilon untuk menghilangkan partikel besar sebelum menambahkan
imunoreagen. Persiapan sampel yang sederhana dan kurangnya langkah pencucian menawarkan potensi untuk menghilangkan
waktu praktik yang signifikan, biaya yang lebih rendah, dan menyederhanakan instrumentasi jika dibandingkan dengan AMDAL
lainnya.
Keterbatasan penelitian mencakup fakta bahwa kami hanya mengujinyaC.sulittoksin B dan bukan toksin A. Sementara ada data yang
bertentangan tentang peran relatif toksin A dan B padaC.sulitinfeksi, bukti saat ini berimplikasiC.sulittoksin B sebagai yang bertanggung
jawab untuk gejala yang paling parahC.sulitinfeksi20,21. Selain itu, tampaknya sedikit, jika ada, galur toksin A+/B− telah diisolasi dari pasien
dengan CDI, sedangkan galur toksin A−/B+ telah diisolasi dari pasien dengan CDI.22,23. Dalam penelitian ini, kami hanya menggunakan sampel
tinja yang tidak berbentuk. Meskipun pedoman yang diterbitkan merekomendasikan bahwa pengujian dibatasi pada sampel tinja yang tidak
berbentuk4, dalam praktiknya sampel feses yang terbentuk terkadang diuji. Kami menguji sejumlah kecil sampel tinja yang terbentuk dan
semi terbentuk dan menemukan bahwa metode kami menghasilkan hasil yang sebanding dengan metode referensi CCNA (data tidak
ditampilkan). Penelitian ini juga dibatasi oleh penggunaan sampel pasien yang tidak teridentifikasi. Dengan demikian, kami tidak dapat
melakukan sub-analisis berdasarkan informasi pasien (misalnya., usia, jenis kelamin, riwayat medis, data klinis, penggunaan pencahar, atau
penggunaan antibiotik). Studi ini juga tidak menggunakan sampel baru, dan oleh karena itu sampel baru perlu diperiksa dalam studi
selanjutnya untuk menyingkirkan potensi gangguan labil dalam matriks sampel. Terakhir, penelitian ini menggunakan sampel klinis sebagai
rangkaian pelatihan untuk menetapkan ambang batas yang mengoptimalkan korelasi dengan metode referensi CCNA. Dengan demikian,
hasil dari set pelatihan mungkin tidak dapat diperluas ke sampel baru. Karena ini bukan studi buta, ini berpotensi bias. Keterbatasan terakhir
ini harus diatasi dengan studi buta di masa depan menggunakan parameter ambang batas yang telah ditetapkan sebelumnya.

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 5
www.nature.com/scientificreports/

MultiPathC.sulittes toksin B memiliki potensi untuk mengatasi kesenjanganC.sulitdiagnostik infeksi3,4. Karena secara
langsung mendeteksi racun yang hanya dihasilkan oleh pertumbuhan vegetatifC.sulitsel – dan bukan spora dorman yang
tidak menyebabkan penyakit – dapat menghilangkan positif palsu yang menurunkan spesifisitas dan nilai prediktif positif
dari tes amplifikasi asam nukleat. Karena Batas Deteksi tes baru secara signifikan lebih rendah daripada AMDAL di pasar,
ini juga memiliki potensi untuk meningkatkan sensitivitas klinis tes berdasarkan teknologi tersebut.

Bahan dan metode

Reagen.Mikropartikel fluoresen (500 nm), 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) dan N-
hydroxysuccinimide (NHS) dibeli dari Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Partikel magnetik polistiren
karboksilat (292 nm) dibeli dari Ademtech (Pessac, Prancis). Magnet untuk menangkap partikel magnetik
berasal dari Dexter Magnetic Technologies (Elk Grove, IL). Plat mikrotiter (96 well clear bottom, setengah
area black plate) berasal dari Greiner Bio-One (Monroe, NC). Standar Native Toxin B dimurnikan dari
C.sulit(ribotype 087) dibeli dari List Laboratories (Campbell, CA). Antibodi monoklonal tikus dinaikkan melawan
C.sulittoksin B berasal dari BBI Solutions (Cardiff, UK) dan Fitzgerald (Acton, MA). Bovine serum albumin (BSA),
® ®
Casein, Trizma dasar, Trizma -HCl, Triton X-100 dan OptiPrep berasal dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Direct Black 19 berasal dari Orient Corporation (Cranford, NJ). Koktail penghambat protease berasal dari Takara
Bio (Mountain View, CA).

Sampel klinis.Sampel feses buangan yang tidak teridentifikasi diperoleh dari Beth Israel Deaconess Medical Center (Boston, MA)
dan Discovery Life Sciences (Los Osos, CA). Sampel dikumpulkan selama 12 bulan. Kami mengecualikan sampel tinja yang
terbentuk (baik semi-terjual atau padat) dan sampel dari anak-anak di bawah usia 2 tahun. Sampel disimpan pada suhu 4 ° C
selama 3-7 hari di laboratorium mikrobiologi klinis dan kemudian dipindahkan ke laboratorium kami dalam pendingin dengan es
atau kompres es untuk mempertahankan > 4 °C. Setelah menerima sampel, mereka diencerkan hingga 40% dengan air dan alikuot
sekali pakai dibuat dan disimpan pada suhu -80 °C sampai digunakan. Sampel feses negatif yang terkumpul dibuat dari 14 sampel
feses individu yang telah dinilai sebagaiC.sulitnegatif dengan PCR real-time. Pengencer feses (buffer Tris, kasein, reagen
pemblokiran heterofilik, dan koktail protease inhibitor) ditambahkan ke sampel dan sampel feses yang diencerkan disaring melalui
filter jaring nilon 10 mikron (PluriSelect, San Diego, AS) sebelum pengujian untuk menghilangkan partikulat .

Sistem pencitraan.Sistem pencitraan laboratorium MultiPath adalah instrumen dan perangkat lunak yang dibuat khusus yang
mampu menangkap data gambar secara otomatis dari sumur yang dipilih dari pelat mikrotiter. Ini menggunakan tahap linier
presisi tinggi dari Prior Scientific (Rockland, MA) untuk memposisikan masing-masing sumur di atas subsistem akuisisi gambar
berbasis fluoresensi. Instrumen dapat mengambil gambar dalam 4 saluran warna terpisah dan menggunakan lensa objektif, LED
iluminasi, set filter fluoresen, dan kamera. Lensa objektif memiliki bidang pandang yang dirancang untuk menangkap gambar
seluruh pelat mikrotiter dengan baik. Sumber cahaya modul iluminasi terdiri dari 2 LED daya tinggi per saluran warna. Serangkaian
bingkai gambar berpendar ditangkap dengan kamera menggunakan sensor monokrom Sony IMX265 3,1MP dengan kuantisasi 12-
bit per piksel. Gambar akhir untuk setiap sumur kemudian dibentuk dengan menjumlahkan beberapa frame. UntukC.sulittes
toksin B, kami menggunakan eksitasi 470/40 nm dan filter emisi 515/30 nm dan menangkap 2 frame pada paparan 20 msec.

Persiapan pelat mikrotiter yang berisi bantal pewarna.Bantal pewarna disiapkan dengan menambahkan 50μL
larutan yang mengandung 0,25 mg Direct Black 19, 10% (v/v) OptiPrep dalam 50mM Tris-HCl, pH 7,5 ke setiap sumur dari pelat
mikrotiter 96 sumur yang diolah dengan plasma dan dikeringkan pada 60 °C selama 3 jam . Piring kering disimpan dalam keadaan
kering hingga 1 bulan.

Persiapan partikel magnetik dan fluoresen terkonjugasi antibodi.Anti-toksin B mon-

antibodi oklonal dikonjugasikan ke partikel magnetik dan fluoresen melalui ikatan karboksil (kimia EDC/NHS)
menggunakan metode konjugasi standar yang direkomendasikan oleh produsen partikel (Ademtech, PESSAC,
Prancis dan Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Partikel magnetik terkonjugasi dikuantifikasi dengan
penyerapan cahaya tampak dan partikel fluoresen terkonjugasi dikuantifikasi menggunakan flow cytometry
untuk keperluan formulasi pengujian selanjutnya.

MultiPathC.sulittes toksin B.Untuk menyiapkan campuran uji, feses diencerkan hingga 8% dengan campuran pengencer
feses, 7e8 partikel/mL partikel magnetik terkonjugasi antibodi, 1,1e7 partikel/mL partikel fluoresen terkonjugasi antibodi, dan
jumlah toksin B yang ditunjukkan (diencerkan dalam 50 mM Tris-HCl, buffer pH 7,8 yang mengandung 2 mg/mL BSA, 0,05% w/v
Tween-20 dan 0,05% v/v Proclin-300) atau hanya buffer untuk blanko. 100μL dari campuran uji dipipet ke dalam masing-masing
sumur yang mengandung bantal pewarna kering. Setelah inkubasi 30 menit pada suhu 35 °C, partikel magnetik ditarik ke bawah
dengan menempatkan pelat uji pada magnet Dexter selama 3 menit. Pelat tersebut kemudian dicitrakan menggunakan sistem
pencitraan MultiPath, dan sinyalnya dikuantifikasi seperti yang dijelaskan di bawah ini.

Analisis gambar.Jumlah partikel fluoresen dihitung untuk setiap gambar yang diperoleh menggunakan algoritma
analisis MultiPath sebagai berikut. Gambar disamarkan dengan ambang batas piksel tetap membuat citra biner di mana
semua piksel dengan intensitas di atas ambang batas ditetapkan ke 1. Piksel dari gambar dikelompokkan menggunakan
analisis konektivitas sehingga setiap piksel aktif dikelompokkan dengan semua piksel aktif yang berdekatan dalam arah
gambar x atau y. Grup piksel, atau blob, kemudian diproses untuk menentukan sekumpulan parameter
seperti area (jumlah piksel), intensitas gumpalan (intensitas total semua piksel dalam gumpalan) dan kekompakanperimeter2 )
4πarea
.
Daftar gumpalan kemudian disaring untuk menghilangkan sinyal non-spesifik yang mungkin disebabkan oleh matriks sampel. Ini dilakukan dengan
menghilangkan gumpalan berdasarkan ukuran, intensitas, dan/atau bentuknya yang tidak beraturan. Setelah daftar blob disaring, file

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 6
www.nature.com/scientificreports/

intensitas gumpalan total dihitung dengan menjumlahkan intensitas setiap gumpalan. Jumlah partikel fluoresen yang
terdeteksi kemudian dihitung dengan membagi intensitas gumpalan total dengan intensitas referensi partikel fluoresen
tunggal.

Batas deteksi, batas kosong, rentang dinamis, dan profil presisi.Pengukuran ini adalah
dilakukan dengan menggunakan sampel tinja negatif yang dikumpulkan. Batas deteksi untukC.sulitUji toksin B
MultiPath ditentukan dengan menjalankan 24 ulangan sampel tanpa analit dan 12 ulangan masing-masing dari 7
konsentrasi toksin B. Batas blanko, batas deteksi, dan profil presisi ditentukan berdasarkan pedoman Clinical &
Laboratory Standards Institute (CLSI)24.

PengujianC.sulitsampel klinis.320 sampel klinis diuji seperti dijelaskan di atas menggunakan uji 3 sumur (tes,
kontrol positif, dan kontrol netralisasi untuk setiap sampel). Setiap sampel yang diperiksa diuji secara independen oleh
dua operator. Untuk kontrol positif, campuran uji termasuk sampel pasien dibubuhi 100 pg/mLC.sulittoksin B untuk
mendeteksi efek penghambatan matriks. Untuk kontrol netralisasi, pengujian dibubuhi dengan 2.5μg/mLC.sulitantibodi
anti-toksin B untuk memastikan bahwa setiap sinyal dalam sampel yang tidak dinetralkan adalah hasil dari deteksi toksin
B.

Uji netralisasi sitotoksisitas sel (CCNA).Sebuah alikuot dari setiap sampel yang telah digunakan untuk
Tes MultiPath dikirim beku di atas es kering ke Microbiology Specialists Inc. (Houston, TX) untuk CCNA. Saat
diterima, integritas sampel diperiksa dan CCNA dilakukan menggunakan sel fibroblas MRC-5 dan reagen
sitotoksisitas Quidel (Quidel, Nomor katalog: 03-05000). Sampel diencerkan 5 kali lipat menggunakan pengencer
spesimen dan disentrifugasi pada 2000 hingga 6000xg selama 10 menit untuk membentuk bahan padat.
Supernatan disaring melalui filter membran 0,45 mikron steril dan filtrat digunakan untuk menginokulasi pelat
kultur jaringan dengan kontrol yang sesuai. Pelat diinkubasi pada suhu 35 ° C selama 24-48 jam dan
perkembangan efek sitopatik spesifik diamati selama inkubasi.

Analisis data.Data dianalisis menggunakan perangkat lunak JMP dan GraphPad Prism. Interval kepercayaan ditentukan
menggunakan analisis Clopper-Pearson.

Referensi
1. Pollock, NRet al. Mengesampingkan infeksi virus influenza H1N1 baru dengan pengujian antigen fluoresen langsung.Klinik Menginfeksi Dis49, e66–68,
https://doi.org/10.1086/644502(2009).
2. Lessa, FCet al. Beban dariClostridium difficileinfeksi di Amerika Serikat.N Engl J Med372, 825–834,https://doi.org/10.1056/
NEJMoa1408913(2015).
3. Burnham, CA, Dubberke, ER, Kociolek, LK, Polage, CR & Riley, TVClostridium difficile-Tantangan Diagnostik dan Klinis. Klinik
Kimia62, 310–314,https://doi.org/10.1373/clinchem.2015.243717(2016).
4. Cohen, SHet al. Pedoman praktik klinis untukClostridium difficileinfeksi pada orang dewasa: pembaruan 2010 oleh masyarakat untuk
epidemiologi kesehatan Amerika (SHEA) dan masyarakat penyakit menular Amerika (IDSA).Kontrol Infeksi Hosp Epidemiol31, 431–455,
https://doi.org/10.1086/651706(2010).
5. Polage, CRet al. Overdiagnosis dariClostridium difficileInfeksi di Era Uji Molekuler.Dokter Magang JAMA175, 1792–1801, https://
doi.org/10.1001/jamainternmed.2015.4114(2015).
6.Crobach, MJet al. Masyarakat Mikrobiologi Klinis dan Penyakit Menular Eropa: pembaruan dokumen panduan diagnostik untukClostridium
difficileinfeksi.Mikrobiol Klinik Menginfeksi22(Sup 4), S63–81,https://doi.org/10.1016/j.cmi.2016.03.010(2016).
7. Lagu, L.et al. Pengembangan dan Validasi Uji Imunosorben Terkait Enzim Digital untuk Deteksi Ultrasensitif dan Kuantifikasi
Clostridium difficileRacun dalam Tinja.Mikrobiol J Clinic53, 3204–3212,https://doi.org/10.1128/JCM.01334-15(2015).
8.McDonald, LCet al. Pedoman Praktek Klinis untukClostridium difficileInfeksi pada Orang Dewasa dan Anak-Anak: Pembaruan 2017 oleh
Infectious Diseases Society of America (IDSA) dan Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA).Klinik Menginfeksi Dis66, e1–
e48,https://doi.org/10.1093/cid/cix1085(2018).
9. Pollock, Deteksi Ultrasensitif NR dan Kuantifikasi Racun untuk Diagnosis yang DioptimalkanClostridium difficileInfeksi.Mikrobiol
J Clinic54, 259–264,https://doi.org/10.1128/JCM.02419-15(2016).
10. Jarrige, V., Nieuwenhuis, JH, van Son, JP, Martens, MF & Vissers, JL Pengujian point-of-care PTH intraoperatif yang cepat pada sistem
magnotech genggam Philips.Langenbecks Arch Surg396, 337–343,https://doi.org/10.1007/s00423-010-0733-z(2011).
11.Todd,J.et al. Immunoassay berbasis aliran ultrasensitif menggunakan penghitungan molekul tunggal.Klinik Kimia53, 1990–1995,https://doi.
org/10.1373/clinchem.2007.091181(2007).
12.Wilson, DHet al. The Simoa HD-1 Analyzer: Analisis Immunoassay Digital Otomatis Penuh Baru dengan Sensitivitas Molekul
Tunggal dan Multiplexing.J Lab Autom21, 533–547,https://doi.org/10.1177/2211068215589580(2016).
13. Sang, S.et al. Kemajuan teknik bebas label baru untuk biosensor: ulasan.Crit Rev Biotechnol36, 465–481,https://doi.org/10.310
9/07388551.2014.991270(2016).
14. Dinarelli, S., Girasole, M., Kasas, S. & Longo, G. Nanotools dan teknik molekuler untuk mengidentifikasi dan melawan infeksi bakteri
dengan cepat.Metode J Mikrobiol138, 72–81,https://doi.org/10.1016/j.mimet.2016.01.005(2017).
15. Ryder, ABet al. Penilaian dariClostridium difficileinfeksi dengan deteksi kuantitatif toksin tcdB dengan menggunakan sistem analisis sel
waktu nyata.Mikrobiol J Clinic48, 4129–4134,https://doi.org/10.1128/JCM.01104-10(2010).
16. Magil, SSet al. Survei prevalensi titik multistat tentang infeksi terkait perawatan kesehatan.N Engl J Med370, 1198–1208,https://doi. org/
10.1056/NEJMoa1306801(2014).
17. Eastwood, K., Else, P., Charlett, A. & Wilcox, M. Perbandingan sembilan tersedia secara komersialClostridium difficiletes deteksi
racun, tes PCR real-time untukC.sulittcdB, dan uji deteksi glutamat dehidrogenase untuk pengujian sitotoksin dan metode
kultur sitotoksigenik.Mikrobiol J Clinic47, 3211–3217,https://doi.org/10.1128/JCM.01082-09(2009).
18. Pollock, NRet al. Deteksi imun diferensial toksin B dari yang sangat virulenClostridium difficileBI/NAP-1/027.Mikrobiol J Clinic53,
1705–1708,https://doi.org/10.1128/JCM.03419-14(2015).
19.Kelly, CPet al. Anti-Clostridium difficilekonsentrat imunoglobulin sapi menghambat sitotoksisitas dan enterotoksisitasC.sulit
racun.Kemoterapi Agen Antimikroba40, 373–379 (1996).
20. Karter, GPet al. Mendefinisikan Peran TcdA dan TcdB dalam Penyakit Gastrointestinal Lokal, Kerusakan Organ Sistemik, dan
Respon Host selamaClostridium difficileInfeksi.MBio6, e00551,https://doi.org/10.1128/mBio.00551-15(2015).
21. Tao, L.et al. Protein frizzled adalah reseptor epitel kolon untukC.sulittoksin B.Alam538, 350–355,https://doi.org/10.1038/
nature19799(2016).

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 7
www.nature.com/scientificreports/

22. Kuehne, SAet al. Peran toksin A dan toksin B dalamClostridium difficile iinfeksi.Alam467, 711–713,https://doi.org/10.1038/
nature09397(2010).
23. Lyras, D.et al. Toksin B sangat penting untuk virulensiClostridium difficile.Alam458, 1176–1179,https://doi.org/10.1038/nature07822
(2009).
24. CLSI.Evaluasi Kemampuan Deteksi Prosedur Pengukuran Laboratorium Klinik; Pedoman yang Disetujui. Dokumen CLSI EP17-A2
. Edisi ke-2, (Lembaga Standar Klinik dan Laboratorium, 2012).

Terima kasih
Kami ingin berterima kasih kepada Jennifer Mathney, John Kepler, Dr. Sean Dineen, dan Geoff McKinley atas
diskusi yang bermanfaat dan anggota tim First Light lainnya untuk saran tentang manuskrip. Kami berterima
kasih kepada anggota Laboratorium Mikrobiologi Klinis Pusat Medis Beth Israel Deaconess atas bantuan
pengambilan sampel.

Kontribusi Penulis
SG, DS dan JB merancang studi dan menulis naskahnya. DA, AW, DC, AT dan VD melakukan percobaan. BW dan
JAW bertanggung jawab atas pengembangan instrumen dan perangkat lunak. DA, TS dan MC mengembangkan
alat analisis data dan bertanggung jawab atas analisis data. DA, DC, dan AW bertanggung jawab atas desain,
pelaksanaan, dan analisis studi inklusivitas analitik tambahan, eksklusivitas, dan interferensi. JEK bertanggung
jawab untuk menulis naskah serta menyediakan sampel klinis.

informasi tambahan
Informasi tambahanmenyertai makalah ini dihttps://doi.org/10.1038/s41598-018-26353-0.
Minat Bersaing:DS, SG, JB, DA, AW, DC, VD, BW, JAW, TS, AT dan MPC adalah karyawan First Light
Biosciences. JEK adalah konsultan untuk First Light Biosciences.
Catatan penerbit:Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan
afiliasi kelembagaan.

Akses terbukaArtikel ini dilisensikan di bawah Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0,
yang mengizinkan penggunaan, berbagi, adaptasi, distribusi, dan reproduksi dalam media apa pun atau
format, asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai untuk penulis asli dan sumbernya, sertakan tautan ke lisensi
Creative Commons, dan tunjukkan jika ada perubahan. Gambar atau materi pihak ketiga lainnya dalam artikel ini
termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel, kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit materi. Jika materi tidak
termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel dan tujuan penggunaan Anda tidak diizinkan oleh peraturan undang-
undang atau melebihi penggunaan yang diizinkan, Anda harus mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta.
Untuk melihat salinan lisensi ini, kunjungihttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

© Penulis 2018

IlmiahLAPORAN|(2018) 8:8364|DOI:10.1038/s41598-018-26353-0 8