Pertemuan ke-7

Amplifikasi DNA dan Materi

Kloning
Amplifikasi DNA

2
AMPLIFIKASI DNA
 Dapat dilakukan secara

1. In vivo → dengan teknik rekayasa

genetika/kloning dg sel hidup → transforman
2. In vitro → teknik kloning gen dalam tabung
reaksi → PCR

PCR (Polimerase Chain Reaction)

 Syarat dalam tabung reaksi terdapat :
 1. Template (DNA yang telah diketahui
urutannya)
 2. Primer (oligonukleotida, 15-20 pb)
 3. Enzim polimerase → termostabil
 4. Prekursor nukleotida
1.Templat
- suatu segmen pada molekul DNA (hasil isolasi dr suatu sumber
dan telah diketahui urutan basa nukleotidanya).
- Digunakan unt menempelkan primer
2. Primer
- suatu oligonukleotida (15 -20 pb)
- dapat disintesis dengan mesin
- sebagai pemicu dalam pembuatan rantai DNA
 primer ini diletakkan dengan posisi yg berlawanan
 terhadap rantai DNA yg akan diperbanyak

3. DNA polimerase
- enzim yg memiliki kemampuan menggabunggkan nukleotida
- mengkatalisis pembentukan DNA yang sedang tumbuh :
diawali dari primer yang berjalan dari ujung 5’ ke arah 3’
- dapat diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus
Kegunaan PCR
 selain untuk amplifikasi dapat
digunakan untuk menentukan apakah
urut-urutan nukleotida suatu DNA
mengalami mutasi
 untuk bidang kedokteran forensik

 untuk melacak asal usul seseorang

dengan
membandingkan “finger print”
Tahap-tahap PCR
 Denaturasi pada 94°C
selama denaturasi, untai ganda DNA terbuka menjadi untai
tunggal, semua reaksi enzimatik terhenti (contoh : reaksi
perpanjangan dari siklus sebelumnya).
 Annealing pada 54°C
ikatan ionik terbentuk secara konstran dan diputuskan antara
primer untai tunggal dan templat untai tunggal. Pada ikatan yang
telah stabil antara primer dan templat, polymerase dapat mencapai
dan memulai mengkopi templat. Setelah beberapa basa terbentuk,
ikatan ionik antara templat dan primer sangat kuat dan tidak
terbuka lagi
 Perpanjangan rantai (extension ) pada 72°C
temperatur ini merupakan termperatur ideal untuk polimerase.
Primer memiliki atraksi ionik yang lebih kuat pada templat
dibandingkan dengan daya untuk memutuskan atraksi ini. Primer
yang berada pada posisi yang tidak tepat terlepas (karena
temperatur yang lebih tinggi) dan tidak menghasilkan perpanjangan
fragmen.
Basa yang komplemen terhadap templat bergandengan dengan
primer pada posisi 3‘ (penambahan dNTP oleh berjalan dari 5' ke
3', pembacaan templat dari sisi 3' ke 5‘ , basa yang ditambahkan
kombases komplemen terhadap templat).
Tahap-tahap pada PCR.
Selama PCR, kedua untai DNA
dikopi, sehingga terjadi
peningkatan jumlah kopi gen
secara eksponensial. Jika
terdapat hanya satu kopi gen
yang diingikan sebelum siklus
dimulai, setelah satu siklus
akan diperoleh 2 kopi, setelah
dua siklus diperoleh 4 kopi,
tiga siklus menghasilkan 8 kopi
dan seterusnya
Amplifiaksi eksponensial gen pada proses
PCR.
Apakah terdapat gen yang dikopi selama PCR dan apakah
ukurannya telah benar?
Sebelum produk PCR digunakan lebih lanjut, harus dicek terlebih
dahulu:
Ada produk yang terbentuk
meskipun biokimia merupakan sains yang bersifat eksak, tidak
setiap PCR berhasil. Kegalalan PCR dapat karena kualitas DNA
yang rendah, penempelan primer tidak sempurna, atau karena
terlalu banyak DNA cetakan
Produk memiliki ukuran yang tepat
ada kemungkinan terbentuk suatu produk, misalna pita dengan
panjang 500 basa, tetapi gen yang seharusnya diperkirakan
berukuran 1800 basa. Pada kasus ini, salah satu primer
kemungkinan menempel pada tempat lain yang lebih dekat pada
primer berikutnya. Kemungkinan lain, kedua primer menempel pada
gen yang benar-benar berbeda.
Hanya satu pita yang terbentuk
ada kemungkinan primer menempel pada lokasi lain yang tidak
diharapkan. Hal ini menyebabkan diperoleh lebih dari satu pita
dalam satu lajur pada gel
 Verifikasi hasil PCR pada gel. DNA ladder adalah campuran fragmen DNA dengan
ukuran yang diketahui untuk dibandingkan dengan fragmen hasil PCR. Jarak antara
fragmen yang berbeda bersifat logaritmik. Lajur 1: fragmen PCR berukuran sekitar
1850 basa. lajur 2 dan 4 : fragmen yang berukuran sekitar 800 basa. Lajur 3: tidak
ada produk yang terbentuk, atau PCR gagal. Lajur 5: lebih dari satu pita terbentuk
akibat penempelan primer pada posisi yang berbeda
Real-time PCR system of the 2nd
generation.
 Real-time PCR system
 Tidak diperlukan untuk mengecek hasil PCR
pada gel agarosa lagi (gel pada
elektroforesis)
mesin PCR membaca reaksi secara
langsung dengan menggunakan fluorescent
probe.
 Reaktan, sangat kecil, sangat mahal

sekitar 200$ untuk 50ul ( microlitre ) enzim TAQ

polymerase, suatu polimerase khusus yang dapat
bekerja pada temperatur yang sangat tinggi (72oC) dan
memiliki ketahanan kerja pada kondisi yang diharapkan
(sekitar 38 siklus berkisar antara 95oc sampai 60oC. )
Tabung reaksi untuk
sekitar 20ul sampai
50ul campuran reaksi.
Elektroforesis
pada gel
agarosa
Elektroforesis
pada gel
agarosa
Bahan untuk Kloning :
 Molekul DNA yg akan dipelajari
 Vektor (pembawa DNA)
 Enzim restriksi
 Enzim ligase
 Sel inang
VEKTOR

 Merupakan wahana untuk memindahkan DNA

ke organisme inang baru yang dapat
diekspresikan/bereplikasi dalam sel inang tsb .
(E.coli yang paling banyak digunakan)
 Beberapa jenis vektor
1. Plasmid
2. Bakteriofaga : Lamda dan derivatnya
dan faga s.s)
3. Cosmid
4. Transfosom
PLASMID

 molekul DNA d.s sirkuler (ekstra kromosom),

terdapat luas pada sel prokariot (spt, sel bakteri)
 berisi I Kb sampai lebih dari 250 Kb
 memiliki paling sedikit satu sekuen/urutan DNA
sebagai titik asal replikasi → dpt memperbanyak
diri tanpa tergantung pd genom/ kromosom
 membawa satu/lebih gen misal sifat resisten
terhadap tetrasiklin dan ampisilin
 contoh: pBR 322, R-plasmid
PLASMID pBR322 dan PLASMID pUC19
Plasmid yang ideal untuk vektor

 ukurannya kecil
 memiliki sifat fenotip yang mudah untuk
diseleksi
 memiliki sisi pada gen fenotipnya untuk
beberapa enzim restriksi sehingga
mudah dipelajari
JENIS PLASMID
Berdasarkan jumlah kopi yang dimiliki plasmid
1. Low copy-number → 1 -2 kopi/sel
2. High copy-number → lebih dari 500 kopi/sel
Berdasarkan penghambatan replikasi
1. Relaxed plasmid *→ replikasi DNA plasmid tidak
dihambat
walaupun replikasi DNA kromosom sel inang
dihambat
2. Stringent plasmid → jika replikasi DNA sel inang
dihambat maka replikasi pada plasmidnya juga akan
dihambat
Berdasarkan bentukunya
1. Covalently closed circles (DNA ccc)*
bentuk sirkuler untai ganda utuh
2. Open circles (DNA oc)
DNA sirkuler untai ganda dengan satu rantai yang utuh
*) disukai karena mudah untuk diamplifikasi serta mudah
diisolasi dan manipulasi
ENZIM RESTRIKSI (endonuklease)
Merupakan suatu enzim endonuklease yg terdapat
dalam sebagian besar sel bakteri
Pertama kali ditemukan oleh WERNER ARBER &
HEMILTON SMITH
berfungsi untuk melindungi sel host terhadap invasi DNA
asing seperti faga-DNA (melalui proses metilasi)
dapat mengenali dan memotong urutan basa nukleotida
spesifik yg berisi 4-6 pb (pair base) → recognition
sequence
Enzim spesifik diberi nama dr bakteri yang
menghasilkannya Eco RI → pertama kali diisolasi dari
E.coli strain R
Hin dIII → enzim ke 3 yg diisolasi dr Haemophilus
influenza
Hasil pemotongan dapat membentuk fragmen dg ujung
yg menonjol→ ujung lengket/sticky end atau ujung yang
rata/ blunt end
Enzim Restriksi
Nama Sumber mikroorganisme Sisi
pengenalan

Bam HI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC

Eco RI Eschericia coli RY13 GAATTC
Hind III Haemophilus influenzaeRd AAGCTT
Not I Nocardia otitidis-caviarum GCGGGCGC
Pst I Providentia stuartii
CTGCAG
sma I Serratia marcescens
CCCGGG