PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

DETEKSI SAMPLE DENGAN

BIOLOGI MOLEKULER

KONVENSIONAL
DAN REAL-TIME
PCR

Disampaikan pada acara Bimbingan Teknis Deteksi AHPND pada Komoditi Udang, 3 Juli 2019
PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

OUTLINE
• Metoda Uji
AHPND
• Mengapa biologi
molekuler
• Uji PCR
• PCR konvensional
• Real-time PCR
PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

LATAR BELAKANG
• Infeksi AHPND mulai terjadi di benua Asia
pada 2009, yang menyebabkan kerugian luar
biasa pada budidaya udang
• Agen penyebab AHPND adalah V.
parahaemolyticus, dan pada 2015 diketahui
bahwa penyebab AHPND adalah V.
parahaemolyticus yang memiliki plasmid Pir
A dan Pir B (Binh, 2019)
• Negara terinfeksi adalah Cina, Vietnam,
Malaysia, Thailand, Filipina, dan Meksiko
(Zooriehzahra & Banaederakhshan, 2015),
dengan kerugian total USD 1 M (FAO, 2013)
 Tingkatan dignosa penyakit
• Level 1 (Level lapangan, pengamatan gejala klinis)
– Pengamatan udang, lingkungan, gejala klinis, patologi umum
– Dibutuhkan hanya perlengkapan sederhana
– Nilai diagnosa terbatas
• Level 2 (Teknik laboratorium dasar)
– Parasitologi, mikrobiologi, bakteriologi, histopathologi
– Peralatan laboratorium dasar
– Nilai diagnosa cukup-baik
• Level 3 (Teknik laboratorium advans)
– Virologi, mikroskop elektron, kultur jaringan, immunologi
– Dibutuhkan peralatan yang lebih advans
– Nilai diagnosa baik
Tingkatan diagnosa (cont.)
PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

METODE UJI AHPND

Morphological/Traditional methods- culture and histology - microscopic

Immunological Methods

Molecular Methods
METODE UJI AHPND DENGAN PCR

• PCR :
– Nested PCR : sampel asal
tambak, lingkungan
– RT-PCR : sampel asal
hatchery
PERBANDINGAN Nested – RT PCR
 PERBANDINGAN Nested – RT PCR
1. Hasil berdasarkan end- point reaksi.
2. Time consuming
3. Resolusi agarose gel sangat terbatas
(kurang lebih 10 kali)
- Kurang presisi
3. Sensitifitas rendah
4. Range dinamika pendek < 2 log
5. Resolusi rendah
6. Tidak otomatis
7. Size-based discrimination only, tidak
mempunyai kapasitas mengatasi
perubahan varian sample
8. Hasil tidak menunjukkan angka
1. Tidak memerlukan agarose gel
2. Waktu relatif lebih pendek
3. Sangat presisi
4. Sensitifitas tinggi
5. Range dinamika panjang mengatasi
perubahan varian sample
6. Otomatis
7. Mengatasi perubahan varian sample
8. Hasil menunjukkan angka copy
number
PERBANDINGAN Nested – RT PCR
Figure 2: Agarose Gel
Sample mengandung 10 copies
dan 50 copies. Sangat sulit membedakan
kedua sample bila menggunakan agarose
gel.
 Proses PCR Konventional
Tiga ulangan
sample yang
sama dengan
jumlah DNA yang
sama

Pada waktu reaksi berjalan:

1. Fase eksponensial
Produk mengalami doubling di setiap siklus, semua reagen tersedia dan kondisi fresh, kinetik reaksi
berjalan mendorong reaksi agar terjadi doubling reaksi.
2. Fase Linier
Semua reagen digunakan, reaksi mulai menurun, PCR produk tidak mengalami doubling per siklus, tiga
sample mengalami diversifikasi.
3. Fase Plateu
PCR produk mengalami perbedaan hasil, karena raksi kinetik amplifikasi berbeda disetiap sample,
padahal pada fase ini konvensional PCR terbaca hasilnya.
PERBANDINGAN Nested – RT PCR

End-point
reaction
Proses Realtime PCR
 Pengaktifan Nuklease Realtime PCR
• Dengan Taq Man Probe

Di desain untuk meningkatkan energy tinggi dari warna setelah probe memisah
menyebabkan aktivitas enzym lebih tinggi diantara Reporter dan Quencher. Flouresen
emisi dari Reporter lebih tinggi hasil emisi copy lebih tinggi
 Pengaktifan Nuklease Realtime PCR

Saat sign fluresen reporter meningkat level deteksi dapat ditangkap sebagai plot
amplikon
Kurva amplifikasi
 Pengaktifan Nuklease Realtime PCR
• SYBR Green

Mengikat minor groove double strand DNA, sehingga intensitas emisi fluoresen
meningkat

Uji kurva realtime PCR:

1. Effisiensi : 90 – 110%
2. Intercept : 3,10 – 3,50
3. R2 = 0,99 – 1,00
IQ real = > 0,95
Realtime PCR
 Detection limit
First batch
DNA Concentration Real Time Result AP4 KIT CPF nested KIT
100 ng Positive 78239.2 Positive Positive
10 ng Positive 6184.9 Positive Positive
1 ng Positive 742.99 Positive Positive
100 pg Positive 70.01 Positive Positive
10 pg Positive 8.97 Negative Negative
1 pg Negative Undetect Negative Negative

Second batch
DNA Concentration Real Time Result AP4 KIT CPF nested KIT
100 ng Positive 152482.13 Positive Positive
10 ng Positive 13637.32 Positive Positive
1 ng Positive 1426.52 Positive Positive
100 pg Positive 177.99 Negative Positive
10 pg Positive 11.61 Negative Negative
1 pg Positive 3.39 Negative Negative

1. RT CPF has detection limit until 1 copy number

2. CPF nested has detection limit 100 copy number
3. AP4 method has detection limit 100 copy number
 Keunggulan PCR Realtime atas
Convensional PCR
• Convensional PCR mengukur end-point (fase plateu), sedangkan realtime
PCR mengukur fase eksponensial.

• Fluorensen reporter akan meningkatkan signal langsung ke jumlah

amplicon, sehingga meningkatkan keterukuran copy number.

• Probe juga meningkatkan amplifikasi amplicon secara permanen sehingga

meningkatkan signal

• Meningkatkan range dinamik dari deteksi

• Tanpa post PCR prosessing
• Deteksi mampu menurunkan range 2 kali lipat
TERIMA KASIH