PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

METODE ISOLASI DNA

Heny Budi Utari

PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

Kimia Asam Nukleat

• DNA (deoxyribonucleic acid) dan

RNA (ribonucleic acid) memindah
informasi genetik dalam organisme
hidup.

• DNA:
– bahan utama dari inti sel/nucleus
– bersifat stabil representatif dari genetik
organisme
• RNA:
– Ditemukan di dalam inti sel dan sitoplasma
– Kunci pembawa alur informasi dalam sel
Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah suatu proses ekstraksi
DNA dari beberapa sumber.

Tujuan:
untuk memisahkan
DNA yang berada
dalam inti sel dari
komponen lain.
Metoda Isolasi DNA?
Pemilihan metode tergantung:

Asal DNA : darah, jaringan, bakteri, virus, dll

Aplikasi akhir: PCR, restriction, sequencing, fingerprinting, library
construction, dll.
Type DNA : genomik, plasmid
Metode Isolasi DNA

Pemilihan metode tergantung pada:

A. Jumlah dan berat molekul DNA

B. Kemurnian DNA yang diperlukan
untuk pengujian
C. Waktu dan biaya
Metode Isolasi DNA Khusus
Metode Ekstraksi DNA
Metode Isolasi DNA

A. Penghancuran dan lysis

B. Pembuangan protein-protein dan
kontaminan lain (RNA, enzyme)
C. Pemulihan DNA
Kimia Untuk Denaturasi

Purposes of the Extraction Buffer Detergents

Chaotropic salts
1. Dissolve cellular membranes CTAB

Detergents
Metal chelators
Reducing agents
2. Inactivation of DNase and Rnase

Salts
3. Assist in the removal of contaminants
CTAB
PVP
Lysis Buffer: 50 ml Lysis Buffer
5 mM EDTA pH 8.0 0.5 M EDTA = 500 ul
200 mM NaCL 5M NaCl = 4 mL
100 mM Tris pH 8.0 1 M Tris-HCL ph 8= 5 mL
0.2% SDS Sodium dodecyl Sulfate 10% SDS = 1 mL
Water MQ water = 39.5 mL

Add prior to 55C o/n icubation

0.4 mg/ml Proteinase K 20 mg/mL Prot K = 6 ul per 300ul of Lysis
Buffer
 Ekstraksi DNA
1. Lisis sel
2. Buang kontaminan:
 Proteins
 RNA
 Other
macromolecules
3. Konsentrasi DNA
purifikasi
 1. Lisis Cell

Menggunakan Detergen untuk melarutkan membran lipid.

2. Memisahkan DNA dari Cairan
Kasar (Crude Lysate)
 DNA harus dipisahkan dari protein dan kotoran sel

Metode Pemisahan
a) Ekstraksi Organik
b) Salting out
a) Pemisahan dengan Ekstraksi Organik
 Secara tradisional, phenol: chloroform
Phenol dan sel membentuk 2 fase: Bagian DNA (atas)
phase larutan/aqueous phase, protein terdenaturasi
(bagian bawah) phase organik.
 Phenol: Mendenaturasi protein dan melarutkan protein

yang telah terdenaturasi

Metode Organik
Genomic DNA isolation: phenol extraction

1:1 phenol : chloroform

or
25:24:1 phenol : chloroform : isoamyl alcohol

 Phenol: denatures proteins, precipitates form at interface

between aqueous and organic layer
 Chloroform: increases density of organic layer
 Isoamyl alcohol: prevents foaming

Genomic DNA is isolated as pieces up to 1 Mbp!

Genomic DNA isolation: phenol extraction
b) Pemisahan dengan Salting Out
 Pada konsentrasi garam tinggi, protein terdehidrasi,
kehilangan daya larut dan menggumpal.

 Garam: sodium chloride, potassium acetate atau

ammonium acetate
 Protein yang menggumpal dilepas dengan cara
sentrifugasi
 DNA tinggal dalam supernatant.
Pemisahan dengan Salting Out
Sel lisis
Protein dicerna dengan enzym proteinase.
Protein presipitasi dengan konsentrasi tinggi dari
garam.
Sentrifugasi akan melepas protein yang menggumpal.
Supernatant mengandungDNA
DNA lalu dipresipitasi dengan penambahan ethanol.
Presipitasi DNA lalu di resuspen dengan buffer
Presipitasi DNA
 Presipitasi dengan Ethanol :
-Presipitasi DNA: lapisan Ethanol berada di atas DNA yang telah
terkonsentrasi
- Serat DNA terbuang dengan pengaduk gelas
- Pencucian DNA
- Desalt DNA: Semua garam dapat larut dalam 70% ethanol
 Extraction/Precipitation Method

Use of Detergents to Lyse Cells:

Mixed micelle
Plasma membrane
(phospholipid bilayer) Detergent molecules

SDS
 Washing and Resuspension:
Washing:
The precipitated DNA is laden with acetate
salts. It is “washed” with a 70% ethanol
solution to remove salts and other water
soluble impurities but not resuspend the DNA.
Resuspension:
The clean DNA is now resuspended in a
buffer to ensure stability and long term
storage.
The most commonly used buffer for
resuspension is called 1xTE
Silica matrix based genomic DNA
isolation
 Kit Commercial DNA :

 Lysis buffer mengandung:

A. sodium chloride
B. Trimethamine (disebut juga tris ), buffer untuk menjaga pH
konstan
C. Ethylendiaminetetraacetic (EDTA), mengikat ion metal
D. Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) adalah detergent .
E. Protease menggunakan protienase K
3- Denaturasi Panas
Dilakukan dengan pemanasan 100oC.
DNA lepas ke larutan dan mengalami denaturasi
Kelemahan: ada inhibitor dalam bentuk protein
terdegradasi dan komponen organik yang lain atau ion
organik.
4- Magnetic beads dengan DNA binding
capacity

 Magnetic beads telah dilapisi with antibodi DNA atau silica

untuk mengikat DNA.
 Sample mengami lisis dan ditretment dengan proteinase K.
 Lisate kemudian dimasukkan ke dalam beads.
 Resin dicuci dan DNA lepas ke dalam pelarut pada suhu 65oC
 Magnetic beads lalu dipisahkan dari sample dalam magnetic stand.
Binding to a support material
Most modern DNA purification methods are based on
purification of DNA from crude cell lysates by selective
binding to a support material.
Support Materials
 Silica

 Anion-exchange resin

Advantages
 Speed and convenience

 No organic solvents

 Amenable to automation/miniaturization

Disadvantage
 DNA fragmentation
Presipitasi DNA
Overview of DNA Extraction

Break down Centrifuge to Precipitate

the cell wall separate the the DNA
and solids from using
membranes the dissolved isopropanol
DNA

Centrifuge to
separate the
DNA from
the dissolved
salts and
Dissolve Wash the sugars
DNA DNA pellet
with Ethanol
and dry the
pellet
 Summary Ekstraksi DNA

1. Lisis sel, to expose the DNA within.

2. Melepas membran lipid dengan penambahan detergents
atau surfactants.
3. Menghilangkan proteins dengan penambahan protease.
4. Menghilangkan RNA dengan penambahan Rnase.
5. Precipitasi DNA dengan alcohol- biasanya ice cold
ethanol. DNA strand akan mengalami aggregasi membentuk
pellet setelah proses sentrifugasi.
 Evaluasi Purifikasi DNA

 Konsentrasi DNA dapat diuji dengan mengukur intensitas absorbansi dengan

spectrophotometers dan membandingkan kurva standard dari konsentrasi
DNA yang diketahui.
 Pengukuran absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260nm & 280nm
digunakan untuk mengukur kemurnian DNA
 DNA purity: A260/A280 ratio: 1.7 – 1.9
 DNA concentration (μg/ml): A260 X 50
 DNA yield:
DNA conc. X Total volume of DNA solution
Pengukuran Kualitas DNA
Maksimum Panjang Gelombang
Absorban untuk DNA
Concentration measurement

Photometric measurement of DNA concentration

UV 260 nm
Conc=50xOD260
Spectrophotometers
Visualisasi DNA
Pemisahan Asam Nukleat
Visualisasi DNA
Measurement of DNA purity
Checking for Degradation DNA
 Running your sample through an agarose gel is a
common method for examining the extent of DNA
degradation. Good quality DNA should migrate as a
high molecular weight band, with little or no evidence of
smearing.
 DNA absorbs UV light at 260 &280 nm & aromatic
proteins absorb UV light at 280 nm Apure sample of
DNA has the 260/280 ratio at 1.8 & is relatively free
from protein contamination.
 A DNA preparation that is contaminated with protein
will have a 260/280 ratio lower than 1.8
Ferifikasi DNA - Agarose Gel
Ferifikasi DNA - Agarose Gel
Agarose gel
Gel elektroforesis
Gel elektroforesis
 Expected Results in a Research Lab
Below is an agarose gel that has 5 genomic DNA samples from various plants.
Note that the DNA runs at a very high molecular weight and as a clear, thick band.
This DNA was extracted in a research lab under optimal conditions

1 kbp and 100 bp Genomic DNA of 5

ladders species of cereals
 Analyzing DNA samples
in a Classroom Lab

Ladder
A B C D E
Analysis of samples:

Barley (A): This sample is fine

Corn (B): This sample is fine

Oat (C) : This sample is fine

Rice (D) : This sample is fine

Wheat (E): This sample has severe

degradation, can work for PCR
but should re-extract
Genomic DNA analysis
Isolasi DNA
Penyimpanan DNA
Alternative nucleic acids
purification protocol

 CsCl gradient centrifugation

 The best quality of RNA
 RNA and DNA isolated simultaneously
 has a 36h centrifugation step
Questions?