PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

TROUBLE SHOOTING
PENGUJIAN MOLEKULER

Heny Budi Utari

PT CENTRAL PROTEINA PRIMA, Tbk.

PCR
1. Harus memahami bekerja
dengan asam nukleat (DNA dan
RNA)
2. PCR adalah teknik
mengamplifikasi DNA/RNA dari
jumlah kecil menjadi berlipat
sehingga harus match dengan
target sekuen yang diinginkan
(generate spesifik fragment).
3. Bila tidak akurat/PCR gagal akan
banyak produk non-spesifik
dengan berbagai ukuran di
beberapa ruang
 Apa Yang Terjadi?

Ladder
A B C D E
Analysis of samples:

Barley (A): This sample is fine

Corn (B): This sample is fine

Oat (C) : This sample is fine

Rice (D) : This sample is fine

Wheat (E): This sample has severe

degradation, can work for PCR
but should re-extract
Apa Yang Terjadi?
 Problem shoot PCR
Pengamatan Penyebab
Sekuen salah Enzym kualitas rendah
Kondisi reaksi PCR tidak optimal
Konsentrasi Nukelotida tidak
seimbang
DNA template rusak
Sekuens toksik ke inang
Size product tidak tepat Annealing Temp tidak tepat
Mispriming
Solusi
Pilih kualitas enzyme
polymerase yang baru dan
bagus
-Kurangi siklus PCR
- Turunkan waktu ekstensi
- Kurangi kons. Mg+
Siapkan fresh
-Template harus baru
- Ekstraksi dengan benar
- Kurangi eksposes UV saat
load gel
-Clone ke vektor ekspression
-Gunakan copy number cloning
vektor (plasmid) rendah
- Cek Tm primer
-Cek apakah primer tidak
menggunakan tambahan
komplementer dengan template
DNA
 Problem
Problem shoot PCR
Pengamatan Penyebab
Size product tidak tepat Konsentrasi Mg+ tidak tepat
Kontaminasi nuclease
Tidak ada produk PCR Annealing Temp tidak tepat
Desain primer tidak tepat
Spesifisitas primer tidak bagus
Konsentrasi primer tidak cukup
Komponen reaksi kurang
Kondisi reaksi tidak optimal
Kualitas Template tidak bagus
Solusi
Atur kons Mg+ (0,2 – 1 mM)
- Ulangi reaksi dengan sample
fresh
- Cek Tm primer
- Test Ann Temp gradien mulai
5oC di bawah Tm pas primer
-Cek literatur untuk desain primer
- Pastikan primer tidak
komplementary internal
- Pastikan primer komplemen ke
target sikuen
- kons primer kisaran 0,05-1 uM,
cek spesifisiti
- Ulang reaksi
- optimisasi kons Mg+
- Opt annealing Temp
- Cek kualitas DNA dengan
running gel
- Cek kualitas dengan spect
260/280

Pengamatan
Tidak ada produk PCR
Multiple non spesifik produk
Problem
Problem shoot PCR
Penyebab
Ada inhibitor reaksi
Jumlah siklus tidak cukup
Tidak tepat program termosikler
mesin
Kontaminasi reaksi larutan dan
tube
Template terlalu komplek
Replikasi tidak bagus
Temp annealing terlalu rendah
Konsentrasi Mg tidak pas
Desain primer tidak pas
Solusi
- Murnikan lagi template
- Kurangi vol sample
- Re run dengan siklus lebih
- Pastikan program dengan waktu dan
suhu yang tepat
- Autoklaf tube kosong
- Pakai tube baru
- Siapkan reaksi baru
- Gunakan kualitas enzym polymerase
yang bagus
-
- Gunakan host start polymerase
- Gunakan reaksi selalu dalam keadaan
dingin
- Tinggikan Ann temp
- Optimisasi Kons Mg+
- Cek spesifik produk
- Cek primer
- Naiknya primer lebih panjang (nt)
- Hindari desain dengann GC rich 3’end
 Problem
Problem shoot PCR
Pengamatan Penyebab Solusi
Multiple non spesifik produk Primer kelebihan - Cek konsentrasi Primer

Kontaminasi dengan - Gunakan pipet terpisah (no aerosol)

endegenous DNA - Siapkan area kerja yang bersih dan
hygienes untuk reaksi PCR
- Gunakan sarung tangan selalu baru
Konsentrasi template tidak - Cek konsentrasi template
benar
 Problem
Problem shoot RT-PCR
Pengamatan Penyebab
Abnormal amplifikasi
Tidak berbentuk sigmoid
NTC teramplifikasi positip
Tidak ada produk amplifikasi
PCR amplifikasi kurang baik
Solusi
- cek kondisi reaksi
- Cek kualitas positip kontrol standar
- Cek pipet yang digunakan untuk NTC
- Cek bahan NTC
- Kontaminasi dengan pos kontrol
- Kontaminasi dengan sample positip
- Tutup dan mixing reaksi dengan baik
- Cek semua template sudah benar
- Cek kondisi reaksi
- Cek enzyme
- Cek fresh semua bahan
Questions?