Corticotropin-releasing hormone menyebabkan downregulasi produksi IL-10 melalui adaptive forkhead box protein 3-sel T regulator negatif pada

pasien dengan dermatitis atopik Latar Belakang: Corticotropin Releasing Hormone (CRH) adalah hormon utama pengatur sumbu hipotalamus-pituitary-adrenal. CRH juga memiliki beragam efek fungsional di perifer dan berhubungan dengan beberapa penyakit kulit, namun efek CRH pada sel T pasien dengan dermatitis atopik (AD) belum dievaluasi. Tujuan: Kami menyelidiki apakah CRH langsung mempengaruhi TH1, TH2 perifer, dan sel T regulator (Treg) pada pasien dengan AD. Metode: Kami menilai apakah sel T mengekspresikan protein reseptor CRH dan mRNA dengan menggunakan flow cytometry, Western blotting, imunofluoresensi, imunohistokimia, dan RTPCR. Kami mengevaluasi ekspresi sitokin menggunakan ELISA setelah memperlakukan sel T yang diekstrak dari pasien dengan AD dan subyek kontrol sehat (HC) dengan CRH. Sitometri kemudian digunakan untuk mengevaluasi efek langsung dari CRH pada sel TH1, TH2, dan Treg dari pasien dengan AD dan HC. Hasil: Sel T dari pasien dengan AD secara signifikan menurunkan kadar mRNA reseptor CRH dari sel T dari HC. Sel T dari HC bereaksi dengan sekresi IL-4 dan IFN-g berbeda terhadap pemberian CRH, sedangkan sel T dari pasien dengan AD tidak. Produksi IL-10 secara signifikan menurun dalam supernatan dari HC dan pasien dengan AD setelah pengobatan CRH. CRH menyebabkan upregulasi produksi IL-4 oleh sel TH2 dan menyebabkan downregulasi produksi IFN-g oleh sel TH1 pada HC. CRH juga menekan produksi IL-10 oleh forkhead box protein 3- negative sel Treg pada kedua kelompok, namun hanya signifikan pada pasien dengan AD. Kesimpulan: Penekanan sekresi IL-10 dari sel Treg yang dimediasi CRH mungkin dapat menjelaskan eksaserbasi yang terkait dengan stres pada pasien dengan AD. (J Clin Alergi Immunol 2012; 129:151-9.) Kata kunci: kortikotropin-releasing hormon, stres, dermatitis atopik, IL-10, forkhead box protein 3, sel T regulator Dermatitis atopik (AD), penyakit radang kulit yang sangat gatal, kronis, kambuh-kambuhan, disebabkan oleh interaksi yang kompleks dari kecenderungan genetik, faktor lingkungan, fungsi imunologi yang berubah dan disfungsi barier kulit. AD juga dipicu atau diperburuk oleh faktor psikologis, seperti stress. Meskipun mekanisme stres memperburuk gejala AD masih tidak

jelas, beberapa faktor telah diusulkan, termasuk pergeseran imunologi yang diinduksi stress terhadap sel TH2, gangguan aksis hipotalamus-hipofisis-adrenal (HPA) akibat respon terhadap stres, dan disfungsi barier kulit yang diperburuk stres. Baru-baru ini, neuropeptida, termasuk neuropeptida Y dan hormon pelepas kortikotropin (CRH), telah dilaporkan mempengaruhi respon stres dan perilaku kecemasan pada sistem saraf manusia. Karena pasien dengan AD juga memiliki tingkat kecemasan tinggi, yang berhubungan dengan pruritus, neuropeptida, seperti sebagai CRH, bisa memodulasi adaptasi terhadap stres pada pasien dengan AD. CRH adalah peptida dengan 41 asam amino yang mengaktifkan sumbu HPA, dan akhirnya menyebabkan sintesis glukokortikoid sebagai reaksi terhadap stress. CRH juga disekresikan dari situs perifer, termasuk sel endotel, sel otot polos vaskuler, dan melanosit, yang berfungsi sebagai regulator neurohormonal autokrin atau parakrin independen saraf pusat sistem. Oleh karena itu, CRH dapat mengatur interaksi neuroendokrin lokal], mendirikan sistem respon stres lokal yang independen, ekuivalen perifer dari axis HPA. Sel dendritik (DC) yang diturunkan dari monosit yang terapar CRH mengalami penurunan kadar IL-18 pada pasien dengan AD, yang menunjukkan aktivitas CRH langsung pada DC. CRH terikat pada reseptor permukaan sel spesifik, 2 subtipe yang telah ditandai pada subyek manusia: corticotropin-releasing hormone receptor (CRHR) 1 dan CRHR2. CRHR1 dan CRHR2 menunjukkan pola ekspresi dan karekteristik pengikatan yang berbeda. CRHR1, isoform paling umum, menengahi respon HPA terhadap stres dan mediasi ekstrahipotalamik terkait dengan penyakit stres diseases. CRHR2 tampaknya tidak memainkan peran penting dalam aktivasi dari sumbu HPA oleh stress. Selain otak manusia, daerah perifer, termasuk kulit, sel mast, dan DC, juga menunjukkan CRHR1/R2. Bukti kuat menunjukkan bahwa sel mast yang mengekspresikan CRHR1/CRHR2 berpartisipasi dalam peradangan kulit dengan modulasi respon stres oleh CRH melalui hubungan otak-kulit. Namun, ekspresi isoform CRHR pada sel T perifer masih kurang dipahami, dan tidak ada efek langsung dari CRH pada subtipe dari sel T CD4+yang telah dibuktikan pada pasien dengan AD, yang ditandai dengan ditandai infiltrasi sel T. Kami menyelidiki apakah sel-sel T memiliki CRHR dan apakah CRH langsung mempengaruhi sel TH1, TH2, dan T regulator (Treg) perifer pada pasien dengan subyek AD dan kontrol sehat (HC).

METODE Subjek Contoh darah diambil dari 15 nonatopik HC (9 laki-laki dan 6 perempuan, berusia 18-35 tahun)

dan 30 pasien dengan AD (16 laki-laki dan 14 perempuan, pasien berusia 18-43 tahun), seperti yang didefinisikan oleh kriteria Hanifin dan Rajka (lihat Tabel E1 pada Repositori online artikel ini di www.jacionline.org). Spesimen biopsi kulit diambil dari pasien dengan AD (n 55) dan beberapa HC (n 53). Keparahan klinis AD didokumentasikan secara independen oleh dokter menggunakan Eczema Area and Severity Index (EASI). Kami membagi pasien dengan AD menjadi 3 kelompok berdasarkan skor Easi: ringan: kurang dari 10; moderat: 10 sampai 20; dan parah: lebih besar dari 20. Kami juga mengevaluasi stres psikologis dengan menggunakan state-trait anxiety inventory, yang terdiri 40 pertanyaan: 20 pertanyaan tentang state anxiety dan 20 pertanyaan tentang trait anxiety. Para pasien tidak menerima pengobatan sistemik atau topikal dengan obat imunosupresif selama setidaknya 4 minggu sebelum pengumpulan sampel darah dan biopsi kulit. Semua subyek diberikan informasi persetujuan tertulis untuk berpartisipasi dalam penelitian, dan badan review institusional menyetujui penelitian ini.

Isolasi sel T dan sel T CD4+ PBMC dari pasien dengan AD dan HC diisolasi melalui sentrifugasi Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Swedia) dan dibiarkan melekat pada plastik piring selama 1 jam pada 37 oC. Sel T diisolasi dari sel terapung yang nonadheren melalui seleksi negatif dengan butir immunomagnetik CD14, CD19 dan CD56 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Jerman). Dua puluh mikroliter microbeads CD4 (Miltenyi Biotec) per 10 7 total sel nonadheren ditambahkan dan diinkubasi selama 15 menit pada 48oC untuk mengisolasi sel T CD41. Sebuah kolom LS ditempatkan dalam medan magnet dengan pemisah sel magnetik yang sesuai (Miltenyi Biotec) dan dibilas sekali dengan 3 mL larutan penyangga. Sel kemudian diresuspensi dalam hingga 500 mL buffer dan dimasukkan pada kolom. Kolom dicuci dengan 3 mL buffer 3 kali, dan sel-sel yang melewatinya telah dihapus. Kolom dipisahkan dari medan magnet dan dielusi dengan 5 ml penyangga. Sel yang berlabel magnet dikumpulkan dan dikultur pada 10% RPMI 1640 (Gibco laboratorium, Grand Island, NY). Kemurnian sel T atau sel T CD4+lebih besar dari 95% pada semua kasus. Sel T atau sel T CD4+yang dimurnikan distimulasi dengan menggunakan anti-CD3 dan anti-CD28 (BD Biosciences, San Jose, California) dengan atau tanpa CRH (Sigma, St Louis, Mo) untuk mengevaluasi ekspresi sitokin setelah pengobatan CRH.

Flow cytometry Untuk pewarnaan permukaan, sel diwarnai dengan fluorescein isothiocyanate (FITC)-antimanusia CD4 mAb, phycoerythrin (PE)-anti-CD25 manusia mAb, PE-anti-CD14 mAb manusia (eBioscience, San Diego, California), allophycocyanin (APC)-anti-manusia CCR4 mAb (R & D Systems, Minneapolis, Mirin), mouse anti-manusia CXCR3 mAb (BD PharMingen, San Diego, California), mouse anti-manusia CRHR1 mAb (R & D Systems), atau antibodi CRHR2 kambing antihuman (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) per standar protokol produsen. FITC-terkonjugasi anti-mouse IgG / APC-terkonjugasi anti-mouse (atau anti-kambing) IgG merupakan antibodi sekunder yang ditambahkan setelah mencuci. Untuk pewarnaan intraseluler, sel-sel difiksasi dan dipermeabilisasi dengan Cytofix / Cytoperm solusi (eBioscience) dan kemudian diwarnai dengan PE-anti-manusia IL-4, IFN-g (BD Biosciences), IL-10 mAbs (R & D Systems), atau APC anti-manusia forkhead box protein 3 (Foxp3) mAb (eBioscience). Flow cytometry dilakukan dengan LSRII (BD Biosciences) dan kemudian dikompensasi dan dianalisis dengan perangkat lunak WINMDI (Scripps Research Institute, San Diego, California).

Real-time RT-PCR dan analisis Western blot untuk CRHR PCR kuantitatif real-time dilakukan 3 kali untuk setiap sampel dengan menggunakan 2 mL cDNA dilengkapi dengan 0,3 mmol / L primer maju dan mundur khusus untuk CRHR1, CRHR2, dan gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH). Sebuah probe TaqMan dan qPCR Master Mix dalam 50 mL reaksi yang digunakan pada 7500 sistem PCR real-time (Terapan Biosystems, Foster City, Calif) dengan Blok Exicycler Kuantitatif Termal (Bioneer, Daejeon, Korea Selatan). Urutan primer dan probe adalah sebagai berikut: CRHR1 probe, 59GCCTCTGGACCTCGGTGATGCCTT-39; GCCTCTGACTCACCACGATG-39; TCTGATGATGACACCTGACTTCTG-39; CGCACTCCCACTCCCTCTCCGCAC-39; CRHR1 CRHR1 CRHR2 CRHR2 sense sense antisense primer, primer, probe, primer, 59595959-

TCCACTCCCTCGCAGTCAC-39; CRHR2 antisense primer, 59-GCAGTTGGCCTC Cagcag-39; GAPDH probe, 59-CCTCCGACGCCTGCTTCACCACCTT-39; GAPDH rasa primer, 59GGACCTGACCTGCCGTCTAG-39, TGTAGCCCAGGATGCCCTTG-39. dan GAPDH antisense primer, 59-

Rincian metode untuk analisis RT-PCR dijelaskan dalam bagian Metode dalam Repositori online artikel ini di www.jacionline.org. Western blotting dilakukan dengan 30 mg protein dari seluruh lisat sel T yang dimurnikan. Protein yang dielektroforesis dipindahkan ke membran polyvinylidene difluorida (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) dan dideteksi dengan ECL (Amersham Bioscience, Arlington Heights, III). Kambing anti-manusia CRHR1 dan anti-manusia CRHR2 antibodi (Santa Cruz Biotechnology) digunakan dengan pengenceran 1:500. Tikus anti-antibodi GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) digunakan sebagai kontrol loading pada 1:1000.

ELISA untuk produksi sitokin dalam sel T Sel T disebarkan dengan kepadatan 4 x 105 per sumur di piring dilapisi dengan 100 L dari 5 g / mL anti-CD3 ditambah 1 mg / mL anti-CD28 pada 37 oC selama 1 jam. Konsentrasi dan waktu inkubasi CRH yang optimal ditentukan secara empiris berkaitan dengan sekresi IL-4, IFN-g dan IL-10. Sel-sel diinkubasi selama 48 jam pada 37oC dengan atau tanpa 10 nmol / L CRH dalam suasana CO2 5%. Kadar IL-4, IFN-g, dan IL-10 dalam kultur supernatan secara kuantitatif dinilai dengan ELISA kit tersedia secara komersial (eBioscience), menurut instruksi pabrik.

Pewarnaan Immunofluorescence dan imunohistokimia Untuk informasi lebih lanjut tentang pewarnaan imunofluoresensi dan imunohistokimia, lihat bagian Metode dalam Repositori online artikel ini.

Uji 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-il) -2,5 - diphenyltetrazolium bromida Untuk informasi lebih lanjut tentang 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazolium bromida (MTT) assay, lihat bagian Metode dalam online Repositori artikel ini.

Uji proliferasi berbasis Carboxyfluorescein succinimidyl ester Untuk informasi lebih lanjut tentang uji proliferasi berbasis carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), lihat bagian Metode di Repositori Online artikel ini.

Analisis statistik

Semua analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak SPSS versi 12,0 (SPSS, Inc, Chicago, III). Data dianalisis dengan menggunakan Mann-Whitney U tes dan tes t independen 2 sampel. Korelasi ditentukan dengan menghitung koefisien korelasi Pearson. Nilai P kurang dari 05 dianggap signifikan secara statistik.

HASIL Ekspresi CRHR1/CRHR2 dalam sel T dari HC dan pasien dengan AD Untuk menguji apakah CRH langsung mempengaruhi sel T, pertama kita menunjukkan bahwa sel T menyatakan CRHR1 dan CRHR2 pada PBMC dari donor sehat (Gambar 1, A dan B). Kami juga meneliti kadar isoform mRNA CRHR pada sel T yang dimurnikan dari HC sebelum dan setelah pengobatan CRH. Sel T menunjukkan mRNA untuk CRHR1a, CRHR1b, dan CRHR2a, sedangkan mRNA untuk CRHR2b dan CRHR2g tidak terdeteksi. Menariknya, pengobatan CRH menurunkan ekspresi mRNA CRHR sel T yang distimulasi anti-CD3/antiCD28 dari HC (Gambar 1, C). Selanjutnya kita membandingkan ekspresi mRNA CRHR antara sel T dari HC dan pasien dengan AD. Ekspresi mRNA CRHR1 secara signifikan lebih besar dalam sel T dari HC (ratarata 6 SD, 0.114 0.116) dibandingkan dengan sel T dari pasien dengan AD (0,046 0,056, P <.05; Gambar 2, A). Demikian pula, sel T dari pasien dengan AD menunjukkan ekspresi mRNA CRHR2 yang secara signifikan kurang (0,037 0,029) daripada yang dari HC (0,160 6 0,165, P <.05; Gambar 2,B). Namun, bagaimanapun, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ekspresi mRNA CRHR1 / CRHR2 dalam korelasinya dengan derajat keparahan AD. Kami juga menegaskan ekspresi protein CRHR1/CRHR2 dalam sel T dari HC dan pasien dengan AD menggunakan Western blot analisis (Gambar 2, C). Sel T CD4+yang menginfiltrasi lesi kulit pasien dengan AD juga menunjukkan protein CRHR1 dan CRHR2 (Gambar 2, D). Data tersebut menunjukkan bahwa CRH, sebuah primer yang terkait dengan stres hormon, dapat menstimulasi sel T pada pasien dengan AD yang diperparah oleh stres.

Perubahan sitokin dalam supernatant sel T setelah pengobatan CRH Untuk menyelidiki peran langsung potensi CRH pada sel T pada pasien dengan AD, kita merangsang sel T yang dimurnikan dengan CRH dan menentukan kadar sitokin dengan ELISA kit. Untuk menentukan konsentrasi CRH dan waktu inkubasi, pertama kita mengukur sekresi IL4, IFN-g dan IL-10 setelah merangsang sel T dengan antibodi anti-CD3 dan anti-CD28 tanpa 1,

10 dan 50 nmol / L CRH dan setelah inkubasi selama 24, 48, dan 72 jam. Perbedaan dalam sekresi IL-4 dan IL-10 terbesar setelah inkubasi dengan 10 nmol / L CRH selama 48 jam (lihat Gambar E1 di Repositori online artikel ini di www.jacionline.org). Assay MTT juga dilakukan untuk menganalisis pengaruh CRH pada viabilitas sel T. Baik konsentrasi CRH (1, 10, 50, dan 100 nmol / L) atau waktu inkubasi (24, 48, dan 72 jam; lihat Gambar E2 Repositori online artikel ini di www.jacionline.org) mengubah aktivitas metabolik sel-sel T. Penelitian fungsional selanjutnya dilakukan dengan 10 nmol / L CRH dan inkubasi 48 jam. Sel T dari HC meningkatkan secara signifikan produksi IL-4 pada supernatan setelah perlakuan CRH (P <.05; Gambar 3, A), sedangkan produksi IFN-g dan IL-10 menurun secara signifikan setelah perlakuan CRH (P <.01 dan P <.05, masing-masing; Gambar 3, B dan C). Pada pasien dengan AD, hanya produksi IL-10 secara signifikan menurun setelah perlakuan CRH (P <.05; Gambar 3, F), sedangkan produksi IL-4 dan IFN-g tidak berbeda secara signifikan (Gambar 3, D dan E).

Pengaruh CRH terhadap produksi sitokin pada sel TH1 dan TH2 pasien dengan AD dan HC Kami mengamati respons berbeda terhadap CRH dalam supernatan dari sel T dari pasien dengan AD dan HC. Untuk mengkonfirmasi sekresi sitokin yang dijelaskan di atas, kami menyelidiki apakah CRH langsung mempengaruhi sel-sel TH1, TH2, dan Treg antara sel T CD4+ terisolasi dari pasien dengan AD dan HC menggunakan sitometri. Kita pertama menguji pengaruh CRH pada CD4+ sel T proliferasi dari HC. Sebuah uji proliferasi berbasis CFSE menunjukkan bahwa CRH tidak mempengaruhi proliferasi sel T CD4+ jika dirangsang dengan antibodi anti-CD3 (lihat Gambar E3, C, dalam Repositori online artikel ini di www.jacionline.org). Jumlah sel T CD4+ yang mengekspresikan CCR4 dan memproduksi IL-4 dari HC meningkat setelah pengobatan CRH, meskipun jumlah sel T CD4+ yang mengekspresikan CCR4 tidak berubah secara signifikan (Gambar 4, A). Populasi sel T CD4+ mengekspresikan CXCR3 dari HC tidak berubah secara signifikan setelah pengobatan CRH, tetapi jumlah sel T CD4+yang mengekspresikan CXCR3 dan mensekresi IFNg menurun (Gambar 4,C). Namun, CRH tidak memiliki dampak yang signifikan terhadap sekresi IL-4 dari sel T CD4+ mengekspresikan CCR4 atau sekresi IFN-g dari sel T CD4+ yang mengekspresikan CXCR3 dari pasien dengan AD (Gambar 4, B dan D). Secara kolektif, CRH menyebabkan upregulasi produksi IL-4 oleh sel TH2 dan menyebabkan downregulasi produksi IFN-g oleh sel TH1 pada HC, sedangkan sel TH1/TH2 pada pasien dengan AD tidak menanggapi pengobatan CRH dengan baik.

Pengaruh CRH pada Treg sel pada pasien dengan AD dan HC Kami memeriksa ekspresi IL-10 pada sel Treg menggunakan penanda sel spesifik Treg alami, Foxp3. Paparan CRH menurunkan sekresi IL-10 pada FoxP3-CD4+ sel T dari pasien dengan AD tetapi tidak berpengaruh nyata terhadap produksi IL-10 pada FoxP3-CD4+ sel T (Gambar 5, B). Penurunan sekresi IL-10 setelah pengobatan CRH juga diamati pada FoxP3-CD4+ sel T dari HC tetapi tidak signifikan dibandingkan dengan yang terlihat pada pasien dengan AD (Gambar 5, A). Persentase IL-10+ FoxP3-CD4+ sel T dari pasien dengan AD menurun secara bermakna setelah pengobatan CRH (5,70 1,49 vs 3,29 1,30, P <.05), tetapi jumlah IL-10+ FoxP3-CD4+ T sel dari HC (2,57 1,37 vs 1,61 0,87) dan IL-10+ FoxP3-CD4+ sel T dari HC (0,39 0,18 vs 0,25 0,12) dan pasien dengan AD (0,84 0,32 vs 0,62 0,34) tidak menurun secara signifikan setelah pengobatan CRH (Gambar 5, C dan D). Selanjutnya, persentase FoxP3-CD4+CD25+ T sel dari HC (2,19 0,29 vs 2,03 0,22) dan pasien dengan AD (3,19 1,32 vs 2,98 1,40) juga sedikit menurun setelah pengobatan CRH, yang secara statistik tidak berbeda (Gambar 5, E). Data tersebut menunjukkan bahwa CRH secara signifikan dapat mempengaruhi FoxP3-Treg sel indusibel atau adaptif pada pasien dengan AD.

PEMBAHASAN Aktivasi akut dari sumbu HPA diperlukan untuk adaptasi memadai terhadap stres, tetapi paparan kronis terhadap hormon stres, termasuk CRH dan glukokortikoid, dapat menimbulkan gangguan psikologis, metabolik, dan kekebalan tubuh, yang menyebabkan penurunan proliferasi sel T atau insensitivitas glukokortikoid. Baru-baru ini, pasien dengan gangguan stres pasca trauma dan subyek sehat di bawah tekanan mental telah menunjukkan penurunan kadar sel T naif dan sel Treg menunjukkan eksaserbasi inflamasi diperantarai sel T, termasuk AD. Juga terdapat beberapa bukti bahwa stres psikologis mengubah kadar sitokin dan molekul membran dalam sel T perifer, serta himpunan limfosit dan eosinofil pada pasien dengan AD. CRH, mediator pusat sistem hormon stres, memiliki peran perifer tambahan dalam saluran pencernaan, sistem kardiovaskuler, dan kulit. CRH juga memiliki immunoreaktivitas dan fungsi lain dalam sel T pada subyek manusia, tetapi belum secara langsung membuktikan bahwa sel T manusia mengekspresikan CRHR. Demikian pertama-tama kita menegaskan bahwa sel T yang beredar menunjukkan protein CRHR1 / CRHR2 dan mRNA dan bahwa sel-sel T yang masuk ke kulit AD menunjukkan protein CRHR1/CRHR2. Selanjutnya, kami menemukan bahwa sel T

manusia normal yang diobati dengan CRH telah menurunkan kadar mRNA CRHR1/CRHR2 dan sel T dari pasien dengan AD menunjukkan kadar mRNA CRHR1/CRHR2 lebih rendah dari HC. Pengamatan ini menunjukkan bahwa CRH sistemik yang meningkat akibat stres kronis dapat menyebabkan desensitisasi CRHR, sebuah fenomena yang umum pada G protein-coupled reseptor dan konsisten dengan studi sebelumnya. Lokalisasi CRHR1/CRHR2 untuk infiltrasi sel T CD4+ pada lesi kulit AD menunjukkan bahwa ekspresi CRH lokal dapat terjadi langsung pada sel T dan sebagian menjelaskan bagaimana AD diperparah oleh stres kronis. Kami menunjukkan bahwa sel T dari HC bereaksi secara berbeda terhadap sekresi IL-4 dan IFN-g pada terapi CRH, sedangkan sel T dari pasien dengan AD tidak. Produksi IL-10 secara signifikan menurun pada supernatan dari HC dan pasien dengan AD setelah pengobatan CRH, meskipun tidak ada perbedaan dalam downmodulasi efek CRH pada sekresi IL-10 di HC dibandingkan dengan yang terlihat pada pasien dengan AD. Namun, CRH secara signifikan menurunkan fungsi sekresi IL-10 dari sel T FoxP3-CD4+ pada pasien dengan AD dibandingkan dengan HC. Subset baru dari sel T CD4+, seperti sel Treg dan sel Th17, selain paradigma konvensional TH1/TH2 akan menyulitkan pathogenesis AD. Selain itu, beberapa subset sel T efektor bisa menunjukkan tingkat plastisitas fenotipik tinggi dalam kondisi tertentu. Laporan sebelumnya bahwa glukokortikoid, kelompok lain hormon stres, dapat menginduksi respon Th2 yang dominan pada PBMC normal mendukung hasil kami. Kenyataan bahwa sel T CD4+ hanya menurunkan fungsi produksi IL-10 sedangkan sel TH1 maupun TH2 tidak pada pasien dengan AD setelah pengobatan CRH, menunjukkan bahwa sel-sel T mungkin merespon secara berbeda terhadap CRH pada pasien dengan AD dan HC. Sel TH1 dan TH2 dari pasien dengan AD yang dipengaruhi oleh stimulasi hormon stres kronis dapat menjadi hiporesponsive terhadap CRH. Penelitian lebih lanjut mungkin dapat menjelaskan bagaimana hormon stress, termasuk CRH, dapat mempengaruhi fleksibilitas subset sel T CD4+ dalam kondisi inflamasi, seperti AD. Sel Treg memainkan peran penting dalam induksi toleransi perifer terhadap paparan alergen. Sel Treg CD4+CD25+ alami, yang khas mengekspresikan Foxp3, diperkirakan bertanggung jawab untuk menjaga toleransi diri, sedangkan sel Treg adaptif, yang mensekresi IL-10 di perifer, yang penting untuk mengontrol respon kekebalan terhadap alergen. Jumlah FoxP3CD4+CD25+ sel Treg meningkat, tetapi mereka memiliki cacat fungsi dalam darah perifer pasien dengan AD, sedangkan sel Treg yang memproduksi IL-10 tampak dalam lesi kulit dari pasien dengan AD dan juga dapat disebabkan oleh alergen spesifik imunoterapi, menyiratkan bahwa IL-10 memiliki peran sentral dalam toleransi alergen pada subjek manusia.

Data kami menunjukkan bahwa CRH menurunkan secara signifikan hanya sekresi IL-10 dari FoxP3-CD4+ sel Treg tetapi bukan dari FoxP3+CD4+ Treg sel, bersama dengan tidak adanya perubahan signifikan dalam FoxP3+CD4+CD25+ Treg sel setelah pengobatan CRH pada pasien dengan AD. Treg sel Foxp31 alami, yang berkembang di timus, secara ireversibel mempengaruhi garis keturunan sel Treg, tetapi sel Treg adaptif yang memproduksi IL-10 mungkin tidak stabil dan rentan terhadap stres lingkungan, seperti stimulasi CRH kronis. Hasil kami lebih lanjut didukung oleh pengamatan bahwa sengat lebah atau birch pollen imunoterapi meningkatkan jumlah sel Treg pensekresi IL-10 tetapi tidak mengubah jumlah FoxP3+CD4+CD25+ sel Treg. Kenyataan bahwa tikus dengan mutasi Foxp3 memiliki tingkat limfoproliferasi dan infiltrasi inflamasi yang hebat pada paru-paru dan hati, tetapi dengan banyak organ yang tersisa tidak terpengaruh juga menunjukkan peran tambahan sel Treg yang memproduksi IL-10 berbeda dari FoxP3+ sel Treg. Penelitian lebih lanjut harus menentukan apakah FoxP3+ sel Treg yang mensekresi IL-10 berasal dari sel T naif atau dari subset sel TH lainnya yang telah kehilangan ekspresi efektor sitokin mereka karena ada peningkatan bukti bahwa TH1, TH2, TH9, atau sel Th17 juga mengekspresikan IL-10. Meskipun peradangan alergi adaptif, termasuk sensitisasi IgE, telah lama dianggap sebagai target terapi, terutamapada pasien dengan AD alergi, kemanjuran klinis anti-IgE mAb pada pasien deengan AD masih controversial. Perlakuan pada pasien dengan AD nonalergik atau pasien dengan AD berat sering menantang, dan dengan demikian pendekatan imunologik baru, seperti kekebalan bawaan, digunakan untuk mengontrol gejala pada pasien. Respon kekebalan tubuh bawaan pada alergi, termasuk pembunuh alami invarian sel T atau sel mast yang diaktifkan thymus stroma lymphopoietin (TSLP), dianggap sebagai kekebalan tubuh bawaan utama pada pasien dengan AD. Penemuan kami bahwa CRH langsung menghambat produksi IL-10 oleh adaptif FoxP3-sel Treg pada pasien dengan AD menunjukkan bahwa CRH bisa memiliki peran lain terhadap reaksi kekebalan bawaan dalam patogenesis AD. Baru-baru ini, antagonis CRHR1 telah diusulkan sebagai agen terapi baru terkait dengan penyakit stres. Pasien kami dengan AD menunjukkan tingkat kecemasan tinggi dibandingkan dengan yang terlihat pasien HC, yang berkorelasi dengan keparahan AD tetapi tidak kadar serum IgE (lihat Gambar E4 di Online Repositori artikel ini di www.jacionline.org). Jadi kecemasan yang diinduksi stres dapat dikaitkan dengan peradangan alergi bawaan pada pasien dengan AD, dan obat yang menargetkan sumbu hormon stres, seperti CRHR1 antagonis, mungkin merupakan pilihan terapi dalam kecemasan tinggi pasien dengan AD. Penelitian selanjutnya juga

diperlukan untuk menyelidiki bagaimana CRH berinteraksi dengan TSLP untuk menjelaskan crosstalk kekebalan bawaan yang dimediasi stress pada pasien dengan AD. Klinisi telah lama menduga bahwa stres mengubah fungsi kekebalan, yang memperburuk gejala AD. Obat ansiolitik tandospirone secara klinis efektif dalam mengelola AD yang diinduksi stres, dan terapi relaksasi juga menurunkan secara signifikan EASI puluhan pasien dengan AD melalui pengurangan kecemasan. Penurunan produksi IL-10 dari sel-sel Treg sebagai respon terhadap pengobatan CRH dapat menjelaskan mekanisme terkait stres yang memperburuk AD. Percobaan terapi baru untuk mengembalikan atau memperluas sel Treg telah diperkenalkan dalam gangguan alergi, sehingga memungkinkan untuk menginduksi toleransi kekebalan tubuh terhadap alergen dan efektif mengontrol eksaserbasi AD akut, terutama pada pasien dengan AD kronis parah. Sampai saat ini, tidak ada penanda khusus untuk sel Treg manusia, selain Foxp3, yang telah divalidasi, dan dengan demikian marker untuk mengidentifikasi sel Treg yang mensekresi IL-10 bisa juga mengatasi batas dalam mengembangkan imunoterapi yang diperantarai sel Treg. Selanjutnya, penelitian untuk mengidentifikasi kelompok berisiko tinggi AD yang rentan terhadap stres dan komponen spesifik dari jalur sel CRH-Treg mungkin memfasilitasi pendekatan terapi baru pada pasien dengan gangguan alergi.

Implikasi klinis: Supresi sekresi IL-10 yang dimediasi CRH dari sel Treg adaptif dapat menjelaskan mekanisme yang mengarahkan eksaserbasi AD yang berkaitan dengan stres.