BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental.

Uji antimikroba dilakukan secara in vitro dengan menggunakan tube dilution test untuk mengetahui aktivitas ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) sebagai antimikroba terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Tube dilution test meliputi dua tahap, yaitu tahap pengujian bahan pada medium broth untuk menetukan KHM (Kadar Hambat Minimal) dan tahap kultur pada media Blood Agar untuk mengetahui KBM (Kadar Bunuh Minimal).

4.2

Sampel dan Besar Sampel Sampel dalam penelitian ini adalah bakteri Staphylococcus aureus yang

didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Jumlah pengulangan yang digunakan dalam penelitian dihitung dengan rumus: P (n-1) 1524 6 (n-1) 15 6n 21 n 3,5 ~ 4 Keterangan : p = jumlah perlakuan ( konsentrasi 6 macam ) n = besar sampel yang diperlukan Jadi penelitian ini menggunakan 4 isolat Staphylococcus aureus.

27

28

4.3

Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

4.4 4.4.1

Variabel Penelitian Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak biji gambas (Luffa

acuntangula) dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25 dan 3,125%.

4.4.2

Variabel Terikat Penelitian Variabel terikat dalam penelitian ini adalah pertumbuhan bakteri

Staphylococcus aureus. Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah kekeruhan yang timbul pada media cair untuk menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan jumlah koloni yang tumbuh pada media agar padat untuk menentukan Kadar Bunuh Minimum (KBM).

4.5

Definisi Operasional Biji Gambas (Luffa acuntangula) didapat di Tapanuli Selatan, Sumatra

Utara. Bakteri Staphylococcus aureus didapat dari laboratorium mikrobiologi klinik FKUB. Ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) adalah sediaan yang diperoleh dengan cara menjemur biji gambas lalu menumbuk hasil penjemuran biji gambas (Luffa acuntangula), lalu sediaan yang diperoleh selanjutnya diekstraksi dengan menggunakan etanol 96%. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah kadar atau konsentrasi minimal larutan ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) yang mampu menghambat

29

pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, ditandai dengan tidak terdapatnya kekeruhan pada larutan ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) diberi bakteri tersebut dalam media Nutrient broth. Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah kadar atau konsentrasi minimal larutan ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) yang mampu membunuh bakteri Staphylococcus aureus, ditandai oleh jumlah koloni pada medium Nutrient Agar Plate (NAP) yang telah dilakukan streaking (penggoresan) dengan satu ose dengan bakteri tersebut, yang telah

campuran ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) dengan jumlah koloni kurang dari 0,1% inokulum asli.

4.6

Alat dan Bahan

4.6.1 Alat - Pisau - Kertas saring - Mikroskop - Colony counter - Obyek glass - Tabung reaksi - Blender - Alat inkubasi - Ose - Pipet ukur - Bunsen - Timbangan analitik - Evaporator set - Tabel NCCLS - Beaker glass - Vortex

4.6.2 Bahan - Biji gambas (Luffa acuntangula) - Biakan murni Staphylococcus aureus - Medium Blood Agar - Medium cair Nutrient Broth - Medium padat NAP

30

- H2O3 3% - Aquades steril - Ethanol 96%

4.7

Persiapan Ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula)

4.7.1 Proses Ekstraksi Gambas (Luffa acuntangula) dikeringkan di bawah sinar matahari. Kemudian ditumbuh sampai halus dan jika telah halus, dibungkus menggunakan kertas saring dan direndam dalam ethanol 96% selama semalam ( 12 jam). Ethanol 96% yang digunakan untuk merendam, diganti beberapa kali sampai air ekstrak jernih. Kemudian hasil ekstraksi dievaporasi.

4.7.2 Proses Evaporasi Evaporator set dipasang pada tiang permanen agar dapat digantung dengan kemiringan 30o 40o terhadap meja dengan susunan dari bawah ke atas alat pemanas air, labu penampung hasil evaporasi, rotary evaporator dan tabung pendingin. Kemudian tabung pendingin dihubungkan dengan pompa sirkulasi air dingin yang terhubung dengan bak penampung air dingin melalui pipa plastik. Tabung pendingin juga terhubung dengan pompa vakum dan penampung hasil penguapan. Hasil ekstraksi dimasukkan dalam labu penampung sedangkan rotart evaporator, alat pompa sirkulasi air dingin dan alat pompa vakum dinyalakan. Pemanas aquades juga dinyalakan sehingga hasil ekstraksi dalam tabung penampung evaporasi mendidih dengan suhu 80oC (sesuai titik didih ethanol) dan ethanol mulai menguap.

31

Hasil penguapan ethanol dikondensasikan menuju labu penampung ethanol sehingga tidak tercampur ahsil evaporasi dan uap lain tersedot pompa vakum. Proses evaporasi dilakukan hingga volume hasil berkuranng dan menjadi kental. Setelah kental evaporasi dihentikan dan hasil evaporasi diambil. Hasil evaporasi ditampung dalam cawan penguap kemudian di oven selama 2 jam pada suhu 80oC untuk menguapkan pelarut yang tersisa sehingga didapatkan hasil ekstrak 100%.

4.8

Identifikasi Ulang Bakteri Staphylococcus aureus Sebelum digunakan untuk penelitian, isolat Staphylococcus aureus yang

diperoleh diidentifikasi ulang dengan pewarnaan Gram (didapatkan bentuk kokus gram positif ), inokulasi pada Blood Agar, mannitol salt agar plate. 4.8.1 Pewarnaan Gram Bersihkan gelas obyek dengan kertas tissue dan lewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak. Kemudian biarkan sampai dingin. Buat sediaan bakteri di atas gelas obyek dengan ketebalan yang cukup dan dibiarkan kering di udara. Kemudian difiksasi di atas api bunsen. Sediaan dituangi dengan Kristal Violet. Setelah 1 menit, sediaan dibilas dengan air. Kemudian sediaan dituangi dengan lugol. Setelah 1 menit, sediaan dibilas dengan air.

32

Sediaan dituangi dengan alkohol 96%. Setelah 5-10 detik, sediaan dibilas dengan air. Sediaan dituangi dengan safranin. Setelah 30 detik, sediaan dibilas dengan air. Sediaan dikeringkan dengan kertas penghisap, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop dengan obyektif perbesaran 100x. 4.8.2 Uji Koagulase Uji koagulase dilakukan dengan menanam koloni Staphylococcus ke dalam tabung yang telah berisi plasma darah kelinci. Koloni bakteri dan plasma darah dicampur hingga rata dan diinkubasikan selama 4 hingga 24 jam. Hasil koagulase positif ditunjukkan dengan terbentuknya gumpalan. 4.8.3 Uji katalase Uji katalase dilakukan dengan menanam koloni Staphylococcus aureus pada media perbenihan padat, kemudian ditetesi H2O2 3% sebanyak 1-2 tetes. Bakteri dengan koagulase positif akan menunjukkan adanya gelembung, sedangkan bakteri dengan koagulase negatif tidak akan tampak adanya gelembung. 4.8.4 Penanaman pada Blood Agar Plate Penanaman bakteri pada Blood Agar Plate .merupakan media selektif terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus. Penanaman bakteri pada media tersebut diduga terdapat adanya gambaran hemolisis yang merupakan gambaran khas dari bakteri Staphylococcus aureus.

33

Ambil satu koloni yang terpisah dengan ose lurus ditanam pada Blood Agar Plate dengan cara menusuk sampai dasar

tabung,kemudian menggoreskan ose tersebut pada permukaan media secara zig-zag . 4.9 Prosedur Penelitian Diinkubasi semalam pada suhu 37o C. Hasil yang didapatkan adalah : koloni kuning kecoklatan

4.9.1 Persiapan Suspensi Bakteri Uji Pada metode ini digunakan standar yang setara dengan Mc Farland 0,5. Pembuatan biakan materi dengan standar yang setara dengan Mc Farland 0,5 dimulai dengan diambilnya bakteri pada kultur kuman sebanyak satu ose dan dicampur dengan broth dengan volume 10 ml dan dikocok sampai diperoleh kepadatan yang sama dengan standar Mc Farland 0,5 (1-1,5 x 108 kuman/ml). Dari larutan bakteri tersebut diambil sebanyak 1 ml dan dicampur dengan broth sebanyak 9 ml sehingga diperoleh kepadatan 107 bakteri/ml, setelah itu diambil lagi sebanyak 1 ml dan dicampur dengan broth sebanyak 9 ml sehingga diperoleh kepadatan 106 bakteri/ml. 4.9.2 Uji Kepekaan Antimikroba Ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) Siapkan suspensi bakteri Staphylococcus aureus dengan konsentrasi sebesar 106 kuman/ml. Disediakan 7 tabung reaksi masing-masing dibuat kadar ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25 dan 3,125%

34

menggunakan metode serial dilution dan disediakan 1 tabung kontrol yaitu kontrol bakteri. Tabung reaksi 1 diisi dengan 0,02 ml ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) + 1,98 ml aquades steril, sehingga konsentrasi ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) adalah 100%. Tabung reaksi 2 diisi dengan 1 ml suspensi dari tabung reaksi 1 + 1 ml aquades steril, sehingga konsentrasi ekstrak biji gambas (Luffa

acuntangula) adalah 50%. Tabung reaksi 3 diisi dengan 1 ml suspensi dari tabung reaksi 2 + 1 ml aquades steril, sehingga konsentrasi ekstrak biji gambas (Luffa

acuntangula) adalah 25%. Tabung reaksi 4 diisi dengan 1 ml suspensi dari tabung reaksi 3 + 1 ml aquades steril, sehingga konsentrasi ekstrak biji gambas (Luffa

acuntangula) adalah 12,5%. Tabung reaksi 5 diisi dengan 1 ml suspensi dari tabung reaksi 4 + 1 ml aquades steril, sehingga konsentrasi ekstrak biji gambas (Luffa

acuntangula) adalah 6,25%. Tabung reaksi 6 diisi dengan 1 ml suspensi dari tabung reaksi 5 + 1 ml aquades steril, sehingga konsentrasi ekstrak biji gambas (Luffa

acuntangula) adalah 3,125%. Kemudian 1 ml suspensi dari tabung 6 dibuang. Tabung reaksi 7 diisi dengan 1 ml bakteri Staphylococcus aureus dengan konsentrasi 106 ditambah dengan 1ml nutrient broth sebagai kontrol bakteri.

35

Tabung reaksi 1-6 ditambahkan dengan bakteri Staphylococcus aureus dengan konsentrasi 106 bakteri/ml dalam tabung, masing-masing sebanyak 1 ml.

Konsentrasi akhir dari campuran ekstrak dan bakteri yang diperoleh ialah sebagai berikut: o o o o o o Konsentrasi campuran ekstrak dan bakteri pada tabung 1 ialah 100% Konsentrasi campuran ekstrak dan bakteri pada tabung 2 ialah 50% Konsentrasi campuran ekstrak dan bakteri pada tabung 3 ialah 25% Konsentrasi campuran ekstrak dan bakteri pada tabung 4 ialah 12,5% Konsentrasi campuran ekstrak dan bakteri pada tabung 5 ialah 6,25% Konsentrasi campuran ekstrak dan bakteri pada tabung 6 ialah 3,125% Tabung reaksi 1-7 kemudian diinkubasi pada suhu 37oC 37,5oC selama 18-24 jam. Untuk mengetahui Kadar Bunuh Minimal, maka dilakukan streaking (penggoresan) pada media agar padat NAP yang dimulai dari tabung yang tidak menampakkan kekeruhan. Setelah itu diinkubasi lagi pada suhu 37oC 37,5oC selama 18-24 jam. Keesokan harinya dilakukan perhitungan jumlah koloni, ditentukan nilai Kadar Bunuh Minimal dari ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) terhadap Staphylococcus aureus.

36

Tabel 4.1 Persiapan Konsentrasi ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula)

No. Tabung 1 Konsentrasi 100% Tabung 2 50% Tabung 3 25% Tabung 4 12,5% Tabung 5 6,25% Tabung 6 3,125% Tabung 7 Kontrol bakteri Volume bahan (ml) Volume aquades (ml) Perbenihan bakteri (ml) 0 1 1 1 1 1 1 1 0,5 0,75 0,875 0,9375 0,96875 1 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0

Untuk mengetahui Kadar Bunuh Minimal, maka dilakukan streaking (penggoresan) pada media agar padat Nutrient Agar Plate (NAP) yang dimulai dari tabung yang tidak menampakkan kekeruhan. Setelah itu diinkubasi lagi pada suhu 37oC 37,5oC selama 18-24 jam.

Keesokan harinya dilakukan perhitungan jumlah koloni, ditentukan nilai Kadar Bunuh Minimal dari ekstrak biji gambas (Luffa acuntangula) terhadap Staphylococcus aureus.

Secara sistematis, alur kerja dapat dilihat pada gambar 4.1 halaman berikut

37

Identifikasi Staphylococcus aureus Pembuatanekstrak bubuk biji gambas Luffa acuntangula

Ditumbuhkan pada Nutrient Broth Diencerkan hingga Konsentrasi kuman 106 bakteri/ml

Dilusi Tabung

Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5 Tabung 6 Tabung 7

Ekstrak [100%] 2 cc

+ekstrak [50%] 1cc

+ekstrak [25%] 1cc

+ekstrak [12,5%] 1cc

+ekstrak [6,25%] 1cc

+ekstrak +ekstrak [3,125%] 1cc 1cc

Kontrol Bahan 100% (KB)

+bakteri 1cc 50 %

+bakteri 1cc 25%

+bakteri 1cc 12,5%

+bakteri 1cc 6,25 %

+bakteri 1cc 3,125%

+bakteri 1cc 0 % (KK)

Inkubasi 24 jam

Segera lakukan penggoresan satu ose pada Nutrient Agar Plate untuk mendapatkan Original inoculum Hitung jumlah koloni yang tumbuh (menentukan KBM) Analisa hasil

Dilihat tingkat kekeruhan (menentukan KHM)

Ditanam pada Nutrient Agar Plate

Inkubasi 24 jam Gambar 4.1 Skema Prosedur Penelitian

38

4.10

Analisa Data Dari data yang diperoleh, dibuat grafik yang akan menggambarkan

adanya hubungan antara bubuk biji gambas (Luffa acuntangula) dalam berbagai konsentrasi. Dengan adanya data jumlah koloni pada perlakuan berbagai konsentrasi bubuk biji gambas (Luffa acuntangula), maka penelitian ini dapat dibahas secara analitik dengan menggunakan uji ANOVA, analisa regresi, dan uji korelasi. Analisis tersebut menggunakan program SPSS for Windows 12.0, dengan derajat kepercayaan 95%, (=0,05). Bermakna bila p< 0,05.