BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1

Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental. Uji

antimikroba dilakukan secara in vitro dengan menggunakan tube dilution test untuk mengetahui aktivitas ekstrak gambas Luffa Acuntangula sebagai antimikroba terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Tube dilution test meliputi dua tahap, yaitu tahap pengujian bahan pada medium broth untuk menetukan KHM (Kadar Hambat Minimal) dan tahap kultur pada media Blood Agar untuk mengetahui KBM (Kadar Bunuh Minimal).

4.2

Sampel dan Besar Sampel Sampel dalam penelitian ini adalah bakteri Staphylococcus aureus yang

didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Jumlah pengulangan yang digunakan dalam penelitian dihitung dengan rumus: P (n-1) 1524 6 (n-1) 15 6n 21 n 3,5 ~ 4 Keterangan : p = jumlah perlakuan ( konsentrasi 6 macam ) n = besar sampel yang diperlukan Jadi penelitian ini menggunakan 4 isolat Staphylococcus aureus. 4.3 Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. 4.4 4.4.1 Variabel Penelitian Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah gambas Luffa Acuntangula dengan konsentrasi 25 gr, 50 gr,75 gr, 100 gr, dan 125 gr.

4.4.2

Variabel Terikat Penelitian Variabel terikat dalam penelitian ini adalah pertumbuhan bakteri

Staphylococcus aureus. Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah kekeruhan yang timbul pada media cair untuk menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan jumlah koloni yang tumbuh pada media agar padat untuk menentukan Kadar Bunuh Minimum (KBM).

4.5

Definisi Operasional Gambas Luffa Acuntangula didapat di Kebun yang ada di Medan. Bakteri

Staphylococcus aureus didapat dari laboratorium klinik mikrobiologi FKUB. Bubuk biji gambas Luffa Acuntangula adalah sediaan yang diperoleh dengan cara menjemur biji gambas lalu menumbuk hasil penjemuran biji gambas Luffa Acuntangula. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah banyak pemberian bubuk biji gambas Luffa Acuntangula yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri

Staphylococcus aureus, ditandai dengan tidak terdapatnya kekeruhan pada bubuk biji gambas Luffa Acuntangula yang telah diberi bakteri tersebut dalam media Nutrient Broth. Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah kadar atau konsentrasi minimal bubuk biji gambas Luffa Acuntangula yang mampu membunuh bakteri Staphylococcus aureus, ditandai oleh jumlah koloni pada medium Blood Agar yang telah dilakukan streaking (penggoresan) dengan satu ose campuran ekstrak gambas Luffa Acuntangula dengan bakteri tersebut, dengan jumlah koloni kurang dari 0,1% inokulum asli. 4.6 Alat dan Bahan

4.6.1 Alat - Pisau - Mikroskop - Colony counter - Obyek glass - Timbangan analitik - Ose - Pipet ukur - Bunsen - Alat inkubasi - Tabel NCCLS - Beaker glass - Vortex

- Tabung reaksi

4.6.2 Bahan - Gambas Luffa Acuntangula - Biakan murni Staphylococcus aureus - Medium Blood Agar - Medium cair Nutrient Broth - Medium padat NAP - H2O3 3% - Aquades steril

4.7

Persiapan Bubuk Biji Gambas Luffa Acuntangula

4.7.1 Proses Pembubukan Gambas Luffa Acuntangula dikeringkan di bawah sinar matahari. Kemudian ditumbuh sampai halus dan jika telah halus.

4.8

Identifikasi Ulang Bakteri Staphylococcus aureus Sebelum digunakan untuk penelitian, isolat Staphylococcus aureus yang

diperoleh diidentifikasi ulang dengan pewarnaan Gram (didapatkan bentuk batang Gram negatif), inokulasi pada Blood Agar (black jet colony), dan inokulasi pada TSI agar.

4.8.1 Pewarnaan Gram Bersihkan gelas obyek dengan kertas tissue dan lewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak. Kemudian biarkan sampai dingin. Buat sediaan bakteri di atas gelas obyek dengan ketebalan yang cukup dan dibiarkan kering di udara. Kemudian difiksasi di atas api bunsen. Sediaan dituangi dengan Kristal Violet. Setelah 1 menit, sediaan dibilas dengan air. Kemudian sediaan dituangi dengan lugol. Setelah 1 menit, sediaan dibilas dengan air. Sediaan dituangi dengan alkohol 96%. Setelah 5-10 detik, sediaan dibilas dengan air.

Sediaan dituangi dengan safranin. Setelah 30 detik, sediaan dibilas dengan air. Sediaan dikeringkan dengan kertas penghisap, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop dengan obyektif perbesaran 100x.

4.8.2 Penanaman pada Blood Agar Plate Penanaman bakteri pada Blood Agar Plate .merupakan media selektif terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus. Penanaman bakteri pada media tersebut diduga terdapat adanya gambaran hemolisis yang merupakan gambaran khas dari bakteri Staphylococcus aureus.

4.8.3 Penanaman pada TSI Agar Ambil satu koloni yang terpisah dengan ose lurus ditanam pada TSI agar dengan cara menusuk sampai dasar tabung,kemudian menggoreskan ose tersebut pada permukaan mediasecarazig-zag Diinkubasi semalam pada suhu 37o C. Hasil yang didapatkan adalah : Alkali/asam dan terdapat has H 2S yang berwarna hitam pada tempat tusukan.

4.8.4 Prosedur Identifikasi dengan Microbact 12E Satu koloni bakteri yang telah diinkubasi selama 18-24 jam diambil dengan menggunakan ose kemudian dilarutkan ke dalam 3-6 ml garam fisiologis pada tabung reaksi steril hingga homogen. Larutan bakteri yang telah homogen diteteskan ke dalam sumur Microbact sebanyak 100 UI (4 tetes), untuk sumurLysin, Omitin, dan H2S ditambah dengan tetesan mineral oil sebanyak 1-2 tetes. Setelah itu Microbact diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Microbact yang telah diinkubasi diambil kemudian diteteskan reagen pada sumur nomor 8 dengan Indol Kovact sebanyak 2 tetes, sumur nomor 10 dengan VP I dan VP II masing-masing satu tetes, dan sumur 12 dengan TDA sebanyak satu tetes. Evaluasi hasil dilihat melalui sumur-sumur microbact apakah positif atau negatif dengan cara membandingkan dengan tabel warna dan hasilnya ditulis pada formulir Patient Record.

Angka-angka oktal didapat dari penjumlahan reaksi positif saja, dari tiap-tiap kelompok (3 sumur didapatkan 1 angka oktal). Nama bakteri dilihat dengan komputer berdasarkan angkar oktal yang didapat.

4.9

Prosedur Penelitian

4.9.1 Persiapan Suspensi Bakteri Uji Pada metode ini digunakan standar yang setara dengan Mc Farland 0,5. Pembuatan biakan materi dengan standar yang setara dengan Mc Farland 0,5 dimulai dengan diambilnya bakteri pada kultur kuman sebanyak satu ose dan dicampur dengan broth dengan volume 10 ml dan dikocok sampai diperoleh kepadatan yang sama dengan standar Mc Farland 0,5 (1-1,5 x 108 kuman/ml). Dari larutan bakteri tersebut diambil sebanyak 1 ml dan dicampur dengan broth sebanyak 9 ml sehingga diperoleh kepadatan 10 7 bakteri/ml, setelah itu diambil lagi sebanyak 1 ml dan dicampur dengan broth sebanyak 9 ml sehingga diperoleh kepadatan 106 bakteri/ml. 4.9.2 Uji Kepekaan Antimikroba Ekstrak Gambas Luffa Acuntangula Siapkan suspensi bakteri
6

Staphylococcus

aureus

dengan

konsentrasi sebesar 10 kuman/ml. Disediakan 7 tabung reaksi masing-masing dibuat kadar ekstrak gambas Luffa Acuntangula 25 gr, 50 gr, 75 gr, 100 gr, dan 2 tabung kontrol yaitu 1 kontrol bakteri dan 1 kontrol bahan. Tabung reaksi 1 diisi dengan 25 gr bubuk biji gambas Luffa Acuntangula sehingga konsentrasi ekstrak batang gambas Luffa Acuntangula adalah 100%. Tabung reaksi 2 diisi dengan 50 gr bubuk biji gambas Luffa Acuntangula + 0,5 aquades steril, sehingga konsentrasi ekstrak batang gambas Luffa Acuntangula adalah 50%. Tabung reaksi 3 diisi dengan 75 gr bubuk biji gambas Luffa Acuntangula Tabung reaksi 4 diisi dengan 100 gr bubuk biji gambas Luffa Acuntangula

Tabung reaksi 5 diisi dengan 125 gr bubuk biji gambas Luffa Acuntangula Tabung reaksi 6 diisi dengan 1 ml bakteri Staphylococcus aureus dengan konsentrasi 106 ditambah dengan 1ml nutrient broth sebagai kontrol baktero.

Tabung reaksi 1-6 diinkubasi pada suhu 37oC 37,5oC selama 1824 jam. Tabung reaksi 2-5 ditambahkan dengan bakteri Staphylococcus aureus dengan konsentrasi 106 bakteri/ml dalam tabung, masingmasing sebanyak 1 ml, sehingga kadar ekstrak gambas Luffa Acuntangula dalam setiap tabung reaksi seperti pada tabel 4.1 berikut.

Untuk mengetahui Kadar Bunuh Minimal, maka dilakukan streaking (penggoresan) pada media agar padat Blood Agar Plate yang dimulai dari tabung yang tidak menampakkan kekeruhan. Setelah itu diinkubasi lagi pada suhu 37oC 37,5oC selama 18-24 jam.

Keesokan harinya dilakukan perhitungan jumlah koloni, ditentukan nilai Kadar Bunuh Minimal dari bubuk biji gambas Luffa Acuntangula terhadap Staphylococcus aureus.

Secara sistematis, alur kerja dapat dilihat pada gambar 4.1 halaman berikut

Pembuatan bubuk biji gambas Luffa Acuntangula

Identifikasi Staphylococcus aureus Ditumbuhkan pada Blood Agar Diencerkan hingga Konsentrasi kuman 106 bakteri/ml

Dilusi Tabung

Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5 Tabung 6

bubuk [25 gr] 1cc

bubuk [50 gr] 1cc

bubuk [75 gr] 1cc

bubuk

bubuk 1cc

[100 gr] [125 gr] 1cc 1cc

Kontrol

+bakteri

+bakteri

+bakteri

+bakteri

+bakteri

Inkubasi 24 jam

Segera lakukan penggoresan satu ose pada Blood Agar Plate untuk mendapatkan Original inoculum Hitung jumlah koloni yang tumbuh Analisa hasil

Dilihat tingkat kekeruhan (menentukan KHM)

Ditanam pada Blood Agar Plate

Inkubasi 24 jam

Gambar 4.1 Skema Prosedur Penelitian

4.10

Analisa Data Dari data yang diperoleh, dibuat grafik yang akan menggambarkan

adanya hubungan antara bubuk biji gambas Luffa Acuntangula dalam berbagai konsentrasi. Dengan adanya data jumlah koloni pada perlakuan berbagai konsentrasi bubuk biji gambas Luffa Acuntangula, maka penelitian ini dapat dibahas secara analitik dengan menggunakan uji ANOVA, analisa regresi, dan uji korelasi. Analisis tersebut menggunakan program SPSS for Windows 12.0, dengan derajat kepercayaan 95%, (=0,05). Bermakna bila p< 0,05.