Nitrofurantoin (AHD)

Reagen : Biooscientific
Persiapan sampel
1. Timbang 1 gram sampel, tambahkan 4 mL UPW. Vortex selama 1 menit
2. Tambahkan 500 L HCl 1 N dan 2-nitrobenzaldehyde. Vortex selama 1 menit
3. Inkubasi pada suhu 50
o
C salama 3 jam
4. Tambahkan 5 mL K
2
HPO
4
, 400 L NaOH dan 6 mL ethyl acetate. Vortex selama 1
menit
5. Sentrifuge pada 4000 rpm selama 10 menit
6. Pindahkan 3 mL supernatan athyl acetate (lapisan paling atas) ke dalam tabung
7. Lakukan evaporasi dengan nitrogen evaporator sampai hanya tertinggal residu pada
tabung
8. Larutkan residu dengan 1 mL n-hexane
9. Tambahkan 1 mL buffer. Vortex selama 2 menit
Persiapan reagen
Sebelum digunakan semua reagen harus dalam temperatur suhu ruang. Semua reagen harus
dicampur secara pelan-pelan. Persiapkan volume reagen yang dibutuhkan untuk pemeriksaan.
Gunakan peralatan disposibel ketika menggunakan reagen dapat meminimalisir kontaminasi
Persiapan larutan pencuci
Campurkan 1 bagian volume dari 20X wash buffer concentration dengan 19 bagian volume
UPW.
Prosedur AHD ELISA
1. Masukkan 100 L masing-masing standart AHD secara duplo pada well yang berbeda
(masukkan standart pada plate dari konsentrasi yang paling rendah ke konsentrasi
yang paling tinggi)
2. Masukkan 100 L masing-masing sampel secara duplo pada well
3. Tambahkan 50 L AHD-HRP konjugat pada setiap well dan homogenkan pelan-
pelan selama 1 menit
4. Inkubasi plate selama 30 menit pada suhu ruang (20-25
o
C)
5. Cuci plate dengan 250 L larutan pencuci sebanyak 3 kali. Setelah pencucian yang
terakhir, balik plate dan tekan plate pelan-pelan pada tissue (segera lanjutkan pada
langkah berikutnya, jangan sampai plate kering selama langkah pengerjaan)
6. Tambahkan 100 L TMB substrate pada setiap well. Campur larutan dengan
menggoyangkan plate secara perlahan selama 1 menit
7. Inkubasi selam 20 menit pada suhu ruang (20-25
o
C)
8. Tambahkan 100 L stop buffer pada setiap well untuk menghentikan reaksi enzim
9. Baca absorbansi dengan panjang gelombang 450 nm