Dimetridazole (DMZ)

Reagen : Biooscientific
Prinsip pemeriksaan
Dasar pemeriksaan adalah reaksi antigen-antibodi. Mikrotiter well berisi anti-dimetridazole
antibodi. Standart dimetridazole atau sampel bereaksi dengan enzim konjugat
hydroxydimetridazole . setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu -4
o
C. Mikrotiter well
dicuci untuk menghilangkan enzim konjugat yang tidak berikatan. Kemudian ditambahkan
substrat/kromogen pada well dan diinkubasi selama 30 menit dalam tempat gelap pada suhu
ruang. Penambahan stop reagen menyebabkan perubahan warna dari biru menjadi kuning.
Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 450 nm. Absorbansi setara dengan konsentrasi
dimetridazole pada standart atau sampel.
Persiapan sampel
a. Timbang 2 gram sampel
b. Tambahkan 8 mL acetonitrile. Vortex selama 1 menit
c. Up side down selama 10 menit
d. Letakkan tabung pada waterbath ultrasonik selama 5 menit
e. Sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 3500 rpm
f. Pisahkan 4 mL supernatan dan evaporasi dengan nitrogen evaporation sampai hanya
tertinggal residu pada tabung
g. Larutkan residu dengan 1 mL n-hexane dan 1 mL metanol/H
2
O (3:1). Vortex selama 1
menit
h. Inkubasi pada waterbath selama 5 menit dengan suhu 40
o
C
i. Sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 3500 rpm
j. Buang larutan n-hexane (lautan bagian atas) dan emulsi yang terbentuk.
k. Evaporasi larutan yang tersisa dengan nitrogen evaporation sampai hanya tertinggal
residu pada tabung
l. Larutkan residu dengan 50 L metanol dan 950 L larutan buffer. Campur baik-baik,
simpan pada suhu 2-8
o
C paling sedikit 1 jam sebelum dibaca pada ELISA. Sampel
harus dalam kondisi dingin sebelum pemeriksaan ELISA
Prosedur DMZ ELISA
a. Pipet 100 L standart zero secara duplo ke dalam well
b. Pipet 50 L standart zero secara duplo ke dalam well
c. Pipet 50 L secara duplo dari konsentrasi yang paling rendah ke konsentrasi yang
paling tinggi ke dalam well
d. Pipet 50 L sampel secara duplo ke dalam well
e. Tambahkan 50 L HRP konjugat pada setiap well, kecuali well yang berisi 100 L
standart zero
f. Tutup mikrotiter plate dan kocok secara pelan-pelan beberapa detik
g. Inkubasi selama 1 jam dalam tempat gelap pada suhu 2-8
o
C
h. Tuang seluruh larutan yang ada pada well, cuci plate dengan 250 L larutan pencuci
sebanyak 3 kali. Setelah pencucian yang terakhir, balik plate dan tekan plate pelan-
pelan pada tissue
i. Pipet 100 L substrat pada setiap well
j. Inkubasi selama 30 menit dalam ruang gelap pada suhu ruang (20-25
o
C)
k. Tambahkan 100 L stop buffer pada setiap well
l. Baca absorbansi pada panjang gelombang 450 nm