Prosedur Universal dan Improvisasi

untuk Whole-mount
Imunolokalisasi pada Tanaman
Protocol : an improved and universal procedure for whole-mount
immunolocalization in plants

Kelompok 5 Mikrotek-A:

Iva Himmatul Aliyah (175090100111038)

Ayu Puspitaning D.H. (175090100111041)
Abdul Mutholib Shahroni (175090101111001)
Cicilia Putri Ramadhani (175090101111004)
Dewi Triska (175090101111007)
 LATAR BELAKANG
Kemajuan pesat dalam mikroskop telah
mendorong penelitian tentang biologi sel.

Protokol untuk imunolokasi

protein secara keseluruhan yang berlaku
untuk berbagai spesies tanaman. Protokol
ditingkatkan dan kuat untuk fiksasi sampel
yang optimal, pembersihan jaringan dan
prosedur pewarnaan multi-protein dan
dapat digunakan dalam kombinasi dengan
deteksi simultan urutan spesifik asam
nukleat. 2
METODE
 Step 1. Fiksasi
Reagent & solution :
○ 1,5 ml formaldehyde 2%
○ buffer MTSB dilengkapi dengan 0,1% Triton pH 7
○ Air suling

Equipment :
○ Shaker
○ Inkubator
4
 Step 2. Hidrofilisasi

Reagent & solution :

○ Methanol
○ Air suling

Equipment :
○ Slide mikroskop

5
 Step 3. Cell Wall Digestion

Reagent & solution :

○ 0,2% Driselase dan 0,15% Macerozyme
○ MTSB pH 7.0

Equiment :
○ Slide agilent

6
 Step 4. Membrane
Permeabilization

Reagent & solution :

○ Buffer MTSB

Equipment :
○ Inkubator

7
 Step 5. Blocking

Reagent & solution :

○ blocking buffer

Equipment :
○ Inkubator

8
 Step 6. Inkubasi Antibodi
Primer

Reagent & solution :

○ Larutan antibodi primer

Equipment :
○ Inkubator

9
 Step 7. Inkubasi Antibodi
Sekunder

Reagent & solution :

○ Larutan antibodi sekunder
○ Buffer MTSB

Equipment :
○ inkubator

10
 Step 8. Co-Pewarnaan
Nukelus

Reagent & solution :

○ Larutan yang mengandung DAPI (0,2 mg)
○ Air suling

Equipment :
○ Inkubator

11
 Step 8 (alternatif). Pewarnaan
Nukleus dan Dinding Sel

Reagent & solution :

○ Tris-HCL
○ Larutan RNAse
○ Larutan propidium iodine
○ Air suling
○ Larutan kalsofluor putih

Equipment :
○ Inkubator
12
 Step 9. Mounting

Reagent & solution :

○ Fluoromount G

Equipment :
○ Mikroskop stereo
○ Ruang pendingin / lemari es

13
 Step 1 : Fiksasi
Fiksasi A (Formaldehyde)
○ Eksplan ditempatkan pada 1,5 ml
formaldehida 2% dalam buffer 1 ×
MTSB yang dilengkapi dengan 0,1%
Triton, pH ~ 7, (rasio fixative / eksplan
10: 1)
○ Infiltrasi vakum digunakan selama 2-3
menit, kemudian vakum dilepas
perlahan, diulangi sekali lagi.
○ Fiksasi dimulai hanya setelah fiksatif
menembus (atau udara akan kembali
ke desikator).
14
○ Eksplan diperiksa telah
tenggelam di bagian bawah
atau belum, jika sudah
dilanjutkan fiksasi selama 40
menit dengan dishake perlahan
pada suhu 37 ° C.
○ Sampel dicuci dalam 2 ml air
suling ~ 10 menit.
50 – 60’
 Prosedur Alternative
Fiksasi B (metanol)
○ Eksplan ditempatkan dalam
1,5 ml 100% metanol selama
20 menit dan diinkubasi
pada suhu 37 ° C.
○ Larutan diganti dengan 0,8
ml 100% metanol (60 ° C),
tabung diinkubasi selama 3
menit secara bertahap.
15
○ Ditambahkan air sampai
konsentrasi akhir metanol
mencapai 20% (sekitar 3,2
ml air).
○ Eksplan / tanaman
dipindahkan ke vial baru
dengan air.
 Step 2 : Pelarutan Kutikula
dan Pembersihan Jaringan 50-
— Hidrofilisasi 60’
○ Air (dari fiksasi A) diganti dengan ~
0,8 ml 100% metanol (60°C) dan ○ Masing-masing dicuci dua
diinkubasi selama ~ 5-10 menit atau, kali selama 5 menit dalam
dari fiksasi B, langsung dilanjutkan ke air.
langkah berikut. ○ Tanaman dipindahkan ke
○ Konsentrasi alkohol diturunkan secara slide agilen yang diisi
bertahap dengan menambahkan setiap sebelumnya dengan 60 μl air.
2 menit 100–200 μl air hingga
konsentrasi alkohol akhir mencapai ~
20% (ini sesuai dengan penambahan
3,2 ml air) 16
 Step 3 : Pencernaan
dinding sel
45’
○ Larutan pencernaan dinding
sel diambil 60 μl, ○ Diinkubasi selama 30-40
ditambahkan ke dalam setiap menit pada 37 ° C.
lubang / kerangka (0,2%
○ Dicuci 1 × 4 menit dengan
Driselase dan 0,15%
100 μl 1 × MTSB pH 7.0
Macerozyme dalam 2 mM
MES, pH 5,0).

17
 Step 4 : Membrane
Permeabilisation
30’

○ Ditambahkan 60 μl larutan
permeabilisasi membran (3% ○ Pada step ini menciptakan
IGEPAL C630, 10% DMSO pori-pori di membran, yang
dalam 1 × MTSB) dan memungkinkan antibodi
diinkubasi selama 15-20 untuk menembus
menit pada suhu 37 ° C.
○ Dicuci 4 kali dengan 1x
MTSB masing-masing
selama 3 menit.
18
 Step 5 : Blocking
30’

○ Ditambahkan 60 μl buffer ○ Tujuan dari step ini

blocking ke setiap frame adalah untuk
dan diinkubasi selama 20 meminimalkan
menit. pengikatan antibodi non-
spesifik.

19
 Step 6 : Inkubasi antibodi
primer
90-120’

○ Larutan buffer blocking ○ Dicuci 2 × 5 menit dengan

diganti dengan 60 μl 100 μl 1 × MTSB.
larutan antibodi primer
dan diinkubasi selama 1-2
jam pada suhu 37 ° C

20
 Kesimpulan
Protokol imunolokalisasi yang diterbitkan sebelumnya membutuhkan setidaknya
dua hari kerja dan tidak dapat diterapkan pada jaringan yang tidak transparan.
Protokol-protokol ini telah diterapkan untuk analisis meristem akar Arabidopsis
thaliana.

Medicago dapat mengalami imunolokalisasi menyeluruh pada organ apa pun

dengan rekonstruksi 3D lebih lanjut. Protokol lengkap keseluruhan kami berlaku
untuk analisis semua spesies dan organ tanaman termasuk jaringan yang tidak
transparan.

Melalui pembersihan jaringan yang ditingkatkan dikombinasikan dengan

kombinasi spesifik jaringan dari enzim pendegradasi dinding sel, protein dapat
dideteksi

21
 “
Terimakasih 

22