FREE TRIIODOTHYRONINE (F-T3)

ELISA KIT

PENDAHULUA
N
Triiodothyronine (T3), adalah sebuah hormone tiroid, yang bersirkulasi dalam darah dan hampir berikatan
seluruhnya dengan protein karier (pembawa) (>99.5%). P r e t o r i n t r a n s p o r t y a n g u t a m a a d a l a h
thyroxine-binding globulin (TBG). Namun, hanya bagian yang bebas / free dari triiodotironin yang dipercaya
bertanggung jawab dalam fungsi biologis. Lebih jauh, konsentrasi protein karier yang tidak dalam keadaan normal
dapat mengindikasikan adanya kondisi klinis tertentu, misalnya kehamilan. Dalam keadaan normal, fungsi tiroid apabila
konsentrasi protein karier berubah, maka akan diikuti juga dengan perubahan kadar triiodotironin sehingga menyebabkan kadar
triiodotironin bebas/free tetap stabil/konstan. Dengan demikian, pengukuran konsentrasi triiodotironin bebas/free lebih
berhubungan dengan status klinis dibandingkan dengan kadar triiodotironin total. Sebagai contoh, peningkatan pada kadar
triiodotironin total berkaitan dengan kehamilan, kontrasepsi oral dan terapi estrogen dapat meningkatkan kadar total T3 sedangkan
kadar T3 bebas/free realtif tidak berubah. Pemeriksaan Elisa ini menyiapkan kondisi optimum dengan menggunakan
manipulasi teknis tertentu untuk dapat menentukan kadar T3 bebas/free secara langsung.

PRINSIP
PEMERIKSAAN
Pada freeT3 EIA, T3 analog dalam jumlah tertentu dilapisi pada well microtiter.serum pasien dalam jumlah tertentu dan anti-T3
antibody d al am ju m la h k o n st an d ik o n ju g asi k an d en g an horseradish peroxidase kemudian ditambahkan pada microtiter
wells. Selama masa inkubasi T3 analog pada microtiter wells dan free T3 yang ada pada sampel dan standar akan berkompetisi
untuk berikatan dengan anti-T3 monoclonal antibody-horseradish peroxidase conjugate. Setelah inkubasi selama 60 menit
pada 37℃, kemudian wells akan dicuci dengan wash solution/larutan pencuci. Substrate solution dan chromogen solution
selanjutnya ditambahkan dan diinkubasi selama 20 menit, akan menghasilkan pembentukan warna biru. Pembentukan warna akan
dihentikan dengan penambahan stop solution, kemudian warna akan berubah menjadi warna kuning dan selanjutnya akan diukur
secara spektrofotometri pada 450 nm. Intensitas warna akan berbanding terbalik dengan konsentrasi triiodotironin bebas/free pada sampel.

ALAT DAN BAHAN

1. FT3 Coated Microwell: Microplate with T3 analog coated wells (1 plate, 96 wells)
2. Enzyme Conjugate Reagent: Horseradish peroxidase (HRP) labeled antibodies to T3 (anti-T3) in
Stabilizing Buffer (1 vial, 11ml)
3. Reference Standards: 0, 2, 5, 10, 25, 50pmol/l free T3 in human plasma with preservatives. (6 vials,
1ml/ea)
4. Wash Solution Concentrate: PBS-Tween (1 bottle, 25ml, 40X)
5. Substrate Solution: Hydrogen Peroxide (1 vial, 7.5 ml)
6. Chromogen Solution: Tetramethylbenzidine (TMB) (1 vial, 7.5 ml)
7. Stop Solution: 1.0 M H2SO4 (1 vial, 7.5 ml)

ALAT DAN BAHAN

1. Aquades
2. Micropipet 20-200μl, 100-1000μl
3. Microplate ELISA reader
4. Magnetic stirrer
5. Washer for microplates
6. Quality control specimens
7. Incubator
8. Absorbent paper

PENGAMBILAN SAMPEL DAN PERSIAPAN

 1. Serum merupakan jenis sampel yang direkomendasikan untuk pemeriksaan
ini.
2. Lakukan pengambilan darah dengan memperhatikan unsur kehati-hatian saat
melakukan pengambilan darah vena.
3. Biarkan sampel membeku selama 1 jam sebelum disentrifus
4. Hindarkan hemolitik, lipemik atau sampel yang keruh.

PERSIAPAN REAGEN
1. Sebelum digunakan semua reagen harus dibiarkan dalam suhu ruangan sebelum digunakan
2. Siapkan indicator pada suhu 37℃.
3. Siapkan Wash Solution: tambahkan 25ml Wash Solution Concentrate dengan 1000ml
aquades, dan campurkan dengan baik menggunakan magnetic stirrer. Wash solution dapat
bertahan selama 2 bulan pada temperature ruangan.

PROSEDUR PEMERIKSAAN
1. Letakkan wells pada holder. Buatlah lembaran data untuk identifikasi sampel
2. Tuangkan 50 μl standards, specimens, dan controls pada well yang sesuai.
3. Tuangkan 100 μl reagen Enzyme Conjugate pada setiap well.
4. Campurkan secara merata selama 30 detik. Sangat penting untuk melakukan pencampuran
yang merata.
5. Inkubasi selama 60 menit pada suhu 37℃.
6. Buang larutan yang telah diinkubasi dengan membalikkan plate kedalam container limbah
atau bak pencuci
7. Cuci dan balikkan well microtiter sebanyak 5 kali dengan wash solution.
8. Pukulkan well dalam posisi terbalik pada tissue untuk megnhilangkan droplet air yang masih
tersimpan.
9. Tuangkan 50 μl Chromogen Solution pada setiap well.
10. Tuangkan 50 μl Substrate Solution pada setiap well. Campurkan perlahan selama 15 detik.
11. Inkubasi pada suhu ruangan dalam keadaan gelap selam 20 menit tanpa digoyangkan.
12. Hentikan reaksi dengan menambahkan 50 μl Stop Solution pada tiap well.
13. Campurkan perlahan selama 15 detik. Sangat penting untuk memastikan warna biru telah
berubah menjadi warna hijau seluruhnya.
14. Baca absorbansi pada 450nm menggunakan Microplate ELISA reader selama15 menit.
PERHITUNGAN HASIL
1. Hitunglah nilai rata-rata dari sampel ataupun standar yang dikerjakan secara duplo.
2. buatlah kurva regresi linier dengan menghubungkan antara konsentrasi (sumbu x) dan absorbansi (sumbu y) untuk mendapatkan
rumus regresi linier tersebut.
3. bacalah absorbansi sampel kemudian lakukan perhitungan

CONTOH KURVA KALIBRASI

Free T3 (pmol/l) Absorbance (450nm)

0 3.05
2 2.18
5 1.49
10 0.82
25 0.37
50 0.24

3.5
3
2.5
2
Absorbance

1.5
(450nm)

1
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60
f-T3 Conc.
(pmol/l)