Jasa Laboratorium Sucofindo

Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003

PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 1 dari 7


1.0. Tujuan

Menentukan tingkat kebusukan dan kemunduran kualitas produk laut.


2.0. Ruang Lingkup

Metode ini dapat digunakan untuk menentukan kadar histamin dalam produk
makanan laut.


3.0. Prinsip Analisa

Contoh di ekstrak dengan methanol 75 % (v/v). Hasil ekstraksinya dilewatkan
pada kolom penukar ion, larutan orto phthaldialdehida yang ditambahkan ke
eluat untuk menghasilkan turunan histamin yang dapat berfl uoresen. Intensitas
fluoresen dari derivatnya ditentukan dengan fluorometer dan histaminnya
ditentukan dengan menggunakan standar eksternal.


4.0. Referensi

AOAC Method 977.13.


5.0. Peringatan Keselamatan dan kesehatan Kerja

5.1. Asam Phosphat. H
3
PO
4

Bila bekerja dengan asam fospat cegah terbentuknya uap atau mist. Beri
cukup ventilasi. Jauhkan alat alat yang mudah terkorosi. Asam Fospat
harus disimpan dalam wadah gelas atau yang tahan korosi. Jaga jangan
sampai pecah atau bocor. Gudang harus berventilasi. Agar tidak
mengkristal, Asam Fospat 85 % larutannya disimpan dalam suhu minimal
21
o
C, dan untuk yang 80 % larutan disimpan dalam suhu minimal 40
o
C.
Gunakan respirator dengan udara tekan, SCBA untuk melindungi
pernafasan, kaca mata dan perisai muka untuk melindungi mata serta
sarung tangan (PVC, karet alam, neoprene) untuk melindungi kulit.

5.2. Asam Klorida, HCl
Jika bekerja dengan asam klorida harus dalam lemari asam, Simpan di
tempat dingin dan berventilasi. Lantai gedung harus tahan asam.
Jauhkan dari bahan oksidator dan bahan alkali, serta sianida, sulfida,
formaldehida, logam natrium, merkuri sulfat dan ammonium hidroksida.
Periksa kebocoran wadah asam.
Gunakan respirator kimia penyerap HCl atau respirator udara untuk
melindungi pernafasan. Gunakan kaca mata dan perisai muka untuk
melindungi mata dan muka dan gunakan sarung tangan (neoprene,
nitrile) untuk melindungi kulit.

5.3. Ortho - phthaldialdehyde, C
8
H
6
O
2

Jauhkan phthaldialdehyde dari cahaya. Simpan dalam wadah bertutup
rapat, kering dan dingin (dibawah + 15
o
C)
Jasa Laboratorium Sucofindo


Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003
PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 2 dari 7


Gunakan baju kerja pada daerah kerja, tergantung dari konsentrasi dan
jumlah isobutanol yang digunakan. Ketahanan baju kerja terhadap bahan
kimia harus diuji oleh supplier.
Gunakan respirator untuk melindungi pernafasan jika terbentuk uap atau
aerosol. Gunakan pelindung mata dan sarung tangan jika diperlukan.

5.4. Natrium Hidroksida, NaOH
Bila bekerja dengan NaOH cegah jangan sampai terbentuk kabut dan
debu. Jaga dari kontak dengan air atau uap air. Bila melarutkan,
tambahkan NaOH ke dalam air sedikit demi sedikit agar tidak memercik.
Simpan dalam wadah yang rapat, berlabel dan di tempat yang dingin.
Tempat penyimpanan harus tahan korosi. Pisahkan dari asam kuat,
senyawa organohalogen dan nitro. Inspeksi periodik terhadap kebocoran
wadah, sebab dapat merusak lantai.
Gunakan respirator (filter debu) untuk melindungi pernafasan (bila
terdapat debu). Gunakan kaca mata atau perisai muka untuk melindungi
mata dan muka. Dan untuk melindungi kulit gunakan sarung tangan
(karet, neoprene, PVC, PE) dan sediakan air pencuci tangan dan mata.

5.5. Methanol, CH3OH
Gunakan sedikit bahan. Hindari terbentuknya uap. Ruang kerja harus
berventilasi. Jauhkan nyala api dari sumber pemanas dari tempat
bekerja dengan methanol. Wadah-wadah perlu digrounding untuk
mencegah listrik statis pada waktu pengaliran bahan. Simpan dalam
wadah tertutup rapat dalam ruang yang dingin, kering , berventilasi,
bebas dari panas, loncatan api dan bara. Bahan inkompatibel : oksidator
kuat dan basa kuat.
Untuk melindungi pernafasan pergunakan respirator dengan penyerap
uap organik, respirator dengan suplai udara atau SCBA,. Untuk
melindungi kulit pergunakan sarung tangan (karet butil, karet alam dan
neoprene). Untuk melindungi muka / mata pergunakan kacamata
goggles dan perisai muka.


6.0. Kualifikasi Personil

Personil yang melakukan pengujian harus lulusan minimal Sekolah Menengah
Analis Kimia dan telah mendapatkan pelatihan mengenai prosedur ini.


7.0. Alat & Bahan Kimia

7.1. Alat
Cuci semua peralatan yang terbuat dari plastik dan gelas dengan HCl (1 +
3) dan H2O sebelum digunakan.
7.1.1. Kolom kromatografi ukuran diameter dalamnya 200 x 7 mm dan
terbuat dari polietilen dan dihubungkan dengan kontes No. K
422372 kel F Hubs dan tabung teflon 45 cm. Atur kecepatan
aliran sehingga lebih besar dari pada 3 mL/ menit dengan cara
mengatur ketinggian dari pada kolom terhadap tabung outlet.
Sebagai alternatif, dapat digunakan keran dua arah yang terdapat
dalam tabung.
Jasa Laboratorium Sucofindo


Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003
PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 3 dari 7


7.1.2. Flourometer
Dilengkapi dengan lampu Hg tekanan sedang dan dengan eksitasi
pada 350 nm dan pengukuran flouresen pada 444 nm
7.1.3. Pipet gondok 1 mL dan 5 mL.

7.2. Bahan Kimia
7.2.1. Resin penukar ion 50 100 mesh ( Biorad) atau biorad AG 1 x8
Atau Dowex 1 X8, mesh 50 100. Tambahkan 15 mL NaOH
untuk mengkonversikan ke bentuk OH. Aduk dengan
menggoyangkan secara memutar dan diamkan selama 30 menit.
Dekantir cairannya dan ulangi penambahan basa tersebut. Cuci
resin dengan H
2
O melalui kertas saring. Buat resin yang segar
setiap minggunya dan simpan dalam air.
Masukkan glass wool ke dalam dasar kolom dan tuangkan resin
sampai setinggi 8 cm. Jagalah volume air yang ada di atas resin
jangan sampai kering. Cuci kolom dengan 10 mL H2O sebelum
malakukan ekstraksi
7.2.2. Asam fosfat 3,57 N
Encerkan 121,8 mL 85% H3PO4 menjadi 1 L. Untuk H3PO4 yang
berbeda konsentrasinya, perhitungannya adalah :

) PO H % x PO H Density (
17493
N 57 , 3 PO H Liter 1
4 3 4 3
4 3
=
Standarisasi larutan ini dengan mengambil 5 mL dan titrasi dengan
NaOH 1,00 N indikator fenolftalein.
7.2.3. Larutan orto ftalatdikarboksilaldehida ( OPT ) 0,1 % (w/v)
Larutkan 100 mg OPT dalam 100 mL metanol. Simpan dalam botol
amber pada lemari pendingin, siapkan larutan segar setiap
minggu.
7.2.4. Larutan standar histamin (simpan larutan ini dalam lemari
pendingin).
7.2.4.1. Larutan stok 1 mg/ mL sebagai basa bebas
Timbang teliti 169,1 mg histamin. 2 HCl (98 %),
masukkan ke dalam labu takar 100 mL, larutkan dan
encerkan tepat 100 mL dengan larutan HCl 0,1 M.
Persiapkan larutan ini segar setiap minggu.
7.2.4.2. Larutan antara 10 g/ mL
Pipet 1 mL larutan stok ke dalam labu takar 100 mL dan
encerkan dengan HCl 0,1 M. Persiapkan larutan segar
setiap minggu.
7.2.4.3. Larutan kerja 0,5 ; 1,0 dan 1,5 g/ 5 mL
Pipet 1 , 2 dan 3 mL larutan antara ke dalam labu takar
100 mL dan encerkan dengan HCl 0,1 M. Persiapkan
larutan segar setiap hari.
7.2.5. Methanol 75 % (v/v)
Pipet 75 mL MeOH (yang didestilasi dalam gelas) ke dalam labu
100 mL. Larutkan dengan H
2
O sampai tanda batas. Goyang
goyangkan labu pada saat penambahan H2O



Jasa Laboratorium Sucofindo


Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003
PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 4 dari 7


8.0. Rincian Prosedur Operasional

8.1. Pembuatan kurva standar
8.1.1. Pipet 5 mL masing-masing duplo larutan kerja ke dalam labu
erlenmeyer gelas atau polipropilen 50 mL. Pipet 10 mL HCl 0,1 M
ke dalam labu-labu tersebut dan kocok. Pipet 3 mL NaOH 1 M
kocok. Dalam waktu 5 menit pipet 1 mL larutan OPT dan kocok.
Sesudah tepat 4 menit, pipet 3 mL larutan H
3
PO
4
3,57 N. pada
masing-masing penambahan sangat penting untuk mengocok
larutan tersebut.
8.1.2. Persiapkan larutan blanko dengan menggunakan larutan 5 mL HCl
0,1 M sebagai pengganti larutan histamin.
8.1.3. Dalam 1jam catat intensitas fluorosensi () dari larutan kerja
dengan menggunakan air dalam sel pembanding. Gunakan
panjang gelombang eksitasi 350 nm dan panjang gelombang emisi
444 nm. Plot (dikoreksi terhadap blanko) terhadap g histamin/ 5
mL larutan.

8.2. Penentuan
8.2.1. Timbang 10 gr contoh dan tambahkan 50 mL metanol, hancurkan
hingga homogen dengan blender. Pindahkan ke dalam labu takar
100 mL dan bersihkan blender dengan metanol dan tuangkan ke
dalam labu takar tersebut. Panaskan dalam waterbath pada suhu
60 C dan diamkan selama 15 menit .
8.2.2. Dinginkan pada suhu 25
o
C, encerkan dengan metanol dan saring
melalui kertas lipat. Filtrat ini tahan selama beberapa minggu.
8.2.3. Bilas 4 5 mL H
2
O ke dalam kolom kromatografi dan buang
eluatnya. Pipet 1 mL filtrat contoh di atas ke dalam kolom dan
tambahkan 4 5 mL H
2
O. Buka kran kolom dan alirkan eluatnya
ke dalam labu takar 50 mL yang berisi 5 mL larutan HCl 1,00 M.
Bila tinggi cairan di atas resin telah turun sampai ketinggian kira-
kira 2 mm, tambahkan lagi 5 mL H2O dan biarkan eluatnya terus
mengalir.
8.2.4. Lanjutkan penambahan H2O sampai didapat eluatnya sebanyak
35 mL. Hentikan aliran, encerkan eluat dalam labu takar sampai
batas volume dengan H2O, tutup dan kocok. Dinginkan eluat ini
dalam refrigerator.
8.2.5. Pipet 5 mL eluat ke dalam erlenmeyer 50 mL dan pipet 10 mL
larutan HCl 0,1 N. kerjakan dengan prosedur yang sama dengan
pembuatan kurva standar mulai dari kalimat "Pipet 3 mL larutan
NaOH 1 M"
8.2.6. Bila contoh mengandung lebih dari 15 mg histamin/ 100 gr ikan,
pipet 1 mL campuran contoh - OPT ke dalam gelas beaker 10 mL
yang mengandung tepat 2 mL campuran blanko - OPT dan kocok
kuat - kuat. Baca intensitas fluorosensi larutan. Bila perlu encerkan
larutan dengan campuran blanko - OPT sedemikian rupa agar
dicapai pembacaan yang dapat diukur. Pendekatan ini
menunjukkan bahwa pengenceran yang sesuai diperlukan sebelum
reaksi OPT kedua dibutuhkan untuk kuantitas contoh yang bisa
dipercaya.
8.2.7. Alternatif lain gunakan sensitivitas "range control" dari fluorometer
(bila tersedia pada instrumen) untuk memperkirakan
Jasa Laboratorium Sucofindo


Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003
PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 5 dari 7

pengencerannya. Bila pendekatan - pendekatan tersebut
digunakan, persiapkan pengenceran eluat dengan larutan 0,1 N
HCl dan kerjakan dengan prosedur yang sama dalam pembuatan
kurva standar dimulai dari kalimat "pipet 3 mL larutan NaOH 1
N..".


9.0. Pelaporan

Perhitungan :

Plot terhadap g histamin/ 5 mL. Kurva harus garis lurus dengan kemiringan :

mg Histamin/ 100 gr ikan = (10) (F) (1/ m) (s)

g histamin / gr Ikan = 10 x (mg histamin / 100 gr ikan)

Dimana :
s, a, b dan c = Fluoresensi dari contoh 1,5 ; 1,0 dan 0,5 g standar.
F = Faktor pengencer
m = Kemiringan

Jika kurva kalibrasi yang dihasilkan tidak linear, gunakan kurva standar yang
mendekati. Masing masing sub bagian

mg Histamin/ 100 gr Ikan = (10) (F)(W)

g histamin / gr Ikan = 10 x (mg histamin / 100 gr ikan)

W = g Histamin/ 5 mL larutan yang ditentukan dari kurva
standard.

10.0. Catatan Perubahan

Penarikan Penambahan
No. Tgl
Bab Hal Revisi Bab Hal Revisi
1. 29/09/03 Perubahan Total 00 Perubahan Total 01





( )
3
Ic 2 Ib
1,5
Ia
m)
+ +
= (
Jasa Laboratorium Sucofindo


Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003
PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 6 dari 7


11.0. Lampiran

11.1. Penentuan Kadar Histamin PO/MM/25-1
Jasa Laboratorium Sucofindo


Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003
PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 7 dari 7


Lampiran 11.1.


PENENTUAN KADAR HISTAMIN
PO/MM/25 1


Methode : AOAC Method 977.13.
No. Lab :
Nama contoh :
Tanggal masuk :
Tanggal selesai :
Kode alat yang digunakan :

Simplo Duplo
Fluoresensi contoh 1,5 g standar Ia
Fluoresensi contoh 1,0 g standar Ib
Fluoresensi contoh 0,5 g standar Ic
Faktor pengencer F
g Histamin / 5 mL larutan yang ditentukan dari kurva std W
Kadar Histamin
Rata - rata

Perhitungan :

Kemiringan/ m : [ (Ia/1,5) + Ib + 2 Ic] / 3

mg histamin/ 100 gr ikan = (10) (F) (1/m) (Is)

Atau jika tidak linear, digunakan rumus :

mg histamin/ 100 gr ikan = (10) (F) (W)



Analis : Diperiksa Oleh :
Disetujui Oleh :







Rev.01 Mulai berlaku : 29 September 2003


SUCOFINDO
Jasa Laboratorium Sucofindo


Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003
PO/MM/25 Revisi : 01
Halaman : 8 dari 7