AKTIVITAS ENZIM SELULASE ISOLAT ASAL INDONESIA PADA

BERBAGAI SUBSTRAT LIMBAH PERTANIAN

BESTY MARANATHA































DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
ABSTRAK

BESTY MARANATHA. Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia pada Berbagai Substrat
Limbah Pertanian. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan TITI CANDRA SUNARTI.
Kemampuan kompleks enzim selulase dari bakteri selulolitik dalam mendegradasi
substrat selulosa sangat beragam. Di alam bakteri selulolitik menghadapi polimer-polimer yang
tidak berupa selulosa saja namun juga hemiselulosa dan lignin. Penelitian ini menguji kemampuan
enzim selulase bakteri Gram positif isolat C4-4, C11-1, C5-1, C5-3 dan kelompok aktinomiset
isolat KBM-2 dan KBM- 4 pada substrat limbah pertanian seperti jerami padi, tongkol jagung dan
kulit pisang. Pengukuran aktivitas enzim selulase ekstrak kasar dilakukan pada hari optimum
produksi enzim selulase tiap isolat dengan modifikasi metode Miller (1959) pada substrat selulosa
murni seperti CMC (Carboxymethyl cellulose) Sigma dan CMC Daisel, Avicel dan Kertas saring
Whatman No. 1 serta substrat selulosa kompleks seperti jerami padi, tongkol jagung dan kulit
pisang.
Isolat C11-1 dan KBM-2 memiliki aktivitas enzim selulase yang relatif tinggi
dibandingkan isolat lain pada substrat selulosa CMC Sigma, Avicel dan Kertas saring Whatman
no. 1. Hal ini menggambarkan enzim ekstrak kasarnya mengandung endo-1,4--glukanase dan
ekso-1,4--glukanase. Kemampuan enzim selulase isolat C11-1 dan KBM-2 dalam mendegradasi
substrat limbah pertanian juga tinggi. Isolat C11-1 memiliki aktivitas enzim selulase tertinggi pada
substrat jerami padi sebesar 179 x 10
-3
nkat/ml, sedangkan KBM-2 memiliki aktivitas enzim
selulase tertinggi pada substrat kulit pisang sebesar 118 x 10
-3
nkat/ml. Isolat C4-4 memiliki
aktivitas selulase tertinggi pada substrat kulit pisang sebesar 180 x 10
-3
nkat/ml.
Isolat C5-1 dan C5-3 memiliki aktivitas enzim selulase yang relatif kecil pada substrat
CMC, Avicel dan kertas saring sehingga kemampuan enzim selulase isolat tersebut juga relatif
kecil dalam mendegradasi substrat limbah pertanian. Namun isolat C5-1 dan C5-3 berturut-turut
memiliki aktivitas yang tinggi pada substrat kulit pisang yaitu 262 x 10
-3
nkat/ml dan 210 x 10
-3

nkat/ml.

ABSTRACT

BESTY MARANATHA. The Cellulose Activities of Isolates from Indonesia on Agricultural
Waste. Under the direction of ANJA MERYANDINI and TITI CANDRA SUNARTI.
The abilities of cellulose enzymes of cellulolytic bacteria to degrade cellulose substrates
vary. In nature, cellulolytic bacteria face a huge polymer not only cellulose but also hemicelluloses
and lignin. The objective of this research was to investigate the ability of cellulase enzymes of
Gram positive bacteria isolates of C4-4, C11-1, C5-1, C5-3 and actinomycetes isolates of KBM-2
and KBM-4 to degrade agriculture waste such as rice straw, corn cob and banana peel. The
determination of cellulase activity was conducted at the highest production time, using crude
enzymes with the modification of Miller methods (1959) on pure cellulose substrates such as CMC
(Carboxymethyl cellulose) Sigma and CMC Daisel, Avicel and Filter paper Whatman No. 1, as
well as complex cellulose substrates such as rice straw, corn cob and banana peel.
Isolates of C11-1 and KBM-2 have higher cellulase activity than others in degrading
CMC Sigma, Avicel, and Filter paper. These show that they have endo-1,4--glucanase and exo-
1,4--glucanase in its crude enzymes. The ability of cellulase enzymes isolates C11-1 and KBM-2
are also high in degrading substrates of agriculture waste. Isolate C11-1 has the highest cellulase
enzyme activity on rice straw substrate of 179 x 10
-3
nkat/ml, however, isolate KBM-2 has the
highest cellulose enzyme activity on banana peel substrates of 118 x 10
-3
nkat/ml. Isolate C4-4 has
the highest cellulose enzyme activity on banana peel substrates of 180 x 10
-3
nkat/ml.
Isolates of C5-1 and C5-3 have relatively low cellulase activities in CMC Sigma, Avicel,
and Filter paper as they have also small enzymes activities in degrading substrates of agriculture
waste. However, isolates of C5-1 and C5-3 have high cellulose enzymes activities on banana peel
substrates of 262 x 10
-3
nkat/ml and 210 x 10
-3
nkat/ml, respectively.





AKTIVITAS ENZIM SELULASE ISOLAT ASAL INDONESIA PADA
BERBAGAI SUBSTRAT LIMBAH PERTANIAN










BESTY MARANATHA












Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi















DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
Judul Skripsi : Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia pada Berbagai Substrat Limbah
Pertanian
Nama : Besty Maranatha
NIM : G34103032






Menyetujui




Pembimbing I Pembimbing II





Dr. Anja Meryandini, MS Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si
NIP. 131 663 016 NIP. 131 956 683




Mengetahui

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor








Dr. Drh. Hasim, DEA
NIP. 131 578 806














Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala anugrah dan
kasihNya sehingga penulis berhasil menyelesaikan laporan skripsi ini. Penelitian yang
dilaksanakan pada bulan Februari hingga Oktober 2007 ini berjudul Aktivitas Enzim Selulase
Isolat Asal Indonesia pada Berbagai Substrat Limbah Pertanian di Laboratorium Mikrobiologi
FMIPA IPB dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB LPPM IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Anja Meryandini, MS dan Dr. Ir. Titi Candra
Sunarti, M.Si yang telah memberikan dana, ilmu, saran serta solusi selama penelitian. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik M.Si sebagai Kepala Bagian
Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB dan kepada Dr. Suharsono sebagai Kepala Pusat
Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan
Masyarakat Institut Pertanian Bogor serta kepada Dr. Ir. Lisdar A. Manaf sebagai Wakil Komisi
Pendidikan yang menguji dan turut menyempurnakan skripsi ini. Terima kasih juga penulis
ucapkan kepada staf Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB dan Laboratorium Bioteknologi
Hewan dan Biomedis PPSHB LPPM IPB; Mbak Heni, Mbak Dewi, Pak Mulya. Kepada teman-
teman yang terus memberikan semangat dan inspirasi kepada penulis; Mbak Niken, Mas Hasrul,
Bu It, Wahyu, Tri, Mega, Ocha dan Junika.
Terima kasih kepada orang tua dan seluruh keluarga penulis atas doa, kasih sayang dan
nasihat selama ini.
Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat.



Bogor, Desember 2007



Besty Maranatha














RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 12 Mei 1985. Penulis merupakan anak pertama
dari empat bersaudara dari Bapak Robiden Panjaitan dan Ibu Aslina Hutauruk. Tahun 2003 penulis
lulus dari SMU 89 Jakarta Timur dan pada tahun yang sama penulis diterima di Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur
USMI. Selama mengikuti kuliah penulis pernah menjadi asisten dosen untuk praktikum mata
ajaran Mikrobiologi Dasar (tahun ajaran 2005/2006) dan Fisiologi Prokariot (tahun ajaran
2007/2008). Penulis melaksanakan tugas praktik lapangan selama satu bulan di Laboratorium
Rumah Sakit Karya Bhakti Bogor. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi PMK (Persekutuan
Mahasiswa Kristen) IPB.

























DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL........................................................................................................................... i

DAFTAR GAMBAR...................................................................................................................... i

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................................... i

PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1
Latar Belakang................................................................................................................. 1
Tujuan.............................................................................................................................. 1

BAHAN DAN METODE.............................................................................................................. 1
Tempat dan Waktu Penelitian.......................................................................................... 1
Bahan dan Alat ................................................................................................................ 1
Metode Penelitian............................................................................................................ 1
Penetapan Waktu Optimum Produksi Enzim Selulase............................................... 1
Pembuatan kurva Pertumbuhan......................................................................... 2
Aktivitas Harian Enzim Selulase....................................................................... 2
Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase pada Berbagai Substrat.................................. 2
Produksi Enzim Ekstrak Kasar .......................................................................... 2
Persiapan Substrat ............................................................................................. 2
Uji Aktivitas Enzim pada Berbagai Subtrat....................................................... 2

HASIL PENELITIAN.................................................................................................................... 3

PEMBAHASAN ........................................................................................................................... 5

SIMPULAN. .......................................................................................................................... 6

SARAN.......................................................................................................................................... 6

DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................................... 7

LAMPIRAN................................................................................................................................... 8












DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1 Karakterisasi suhu dan pH optimum aktivitas selulase ..................................................... 3
Tabel 2 Nilai aktivitas enzim selulase tiap isolat terhadap berbagai substrat................................. 4




DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C4-4............................ 3
Gambar 2 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C11-1.......................... 3
Gambar 3 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C5-1............................ 3
Gambar 4 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian enzim selulase isolat C5-3............................ 4
Gambar 5 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM-2.............................................................. 4
Gambar 6 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM-4.............................................................. 4


DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Komposisi Bahan-Bahan yang Digunakan................................................................. 9
Lampiran 2 Kurva Standar Glukosa............................................................................................. 10
Lampiran 3 Metode Kerja Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase pada Berbagai Substrat ......... 11

1
PENDAHULUAN

Latar belakang
Enzim merupakan biokatalisator yang
mampu mempercepat reaksi biokimia yang
terjadi di dalam sel maupun di luar sel
(Poedjiadi 1994). Penggunaan enzim dalam
mendegradasi polimer di bidang industri
maupun pertanian telah banyak dilakukan
untuk efisiensi biaya produksi. Salah satu
enzim yang digunakan untuk mendegradasi
polimer karbohidrat adalah enzim selulase.
Enzim selulase sangat diandalkan dalam
degradasi bahan berserat selulosa dan
banyak digunakan pada industri detergent,
makanan ternak, tekstil, dan pabrik kertas
(Kirk 2002).
Sektor pertanian Indonesia yang terus
berkembang membutuhkan solusi dalam
penanganan limbah pertaniannya. Jerami,
tongkol jagung dan kulit pisang merupakan
limbah pertanian yang mengandung serat
terutama selulosa, yang penanganannya
masih dengan cara dibakar. Dengan bantuan
enzim selulase, limbah pertanian tersebut
dapat dimanfaatkan kembali sebagai pakan
ternak ataupun kompos.
Enzim selulase merupakan sistem enzim
yang terdiri atas endo-1,4--glukanase,
ekso-1,4--glukanase, dan -D-glukosidase.
Endo-1,4--glukanase memotong ikatan
rantai dalam selulosa menghasilkan molekul
selulosa yang lebih pendek, ekso-1,4--
glukanase memotong ujung rantai selulosa
menghasilkan molekul selobiosa, sedangkan
-D-glukosidase memotong molekul
selobiosa menjadi dua molekul glukosa
(Kim 1995). Setiap mikroorganisme
selulolitik memiliki komposisi enzim
selulase yang berbeda-beda, sehingga
penelitian mengenai kemampuan selulolitik
isolat baru perlu dilakukan.
Mikroorganisme selulolitik dari
kelompok bakteri memiliki tingkat
pertumbuhan yang cepat sehingga waktu
yang dibutuhkan untuk produksi enzim
menjadi lebih pendek. Selain itu, tingkat
variasi genetik kelompok bakteri sangat
beragam sehingga memungkinkan dilakukan
rekayasa genetika untuk optimasi produksi
maupun aktivitas enzim selulasenya (Alam
et al 2004).
Penelitian ini menggunakan bakteri
selulolitik yang telah berhasil diisolasi
dalam penelitian pendahuluan. Isolat
tersebut mampu mendegradasi selulosa pada
suhu 50 C dan dalam media agar-agar CMC
Sigma (Carboxymethyl cellulose)
membentuk zona bening.

Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah menguji
aktivitas enzim selulase dari empat isolat
bakteri selulolitik yang mampu tumbuh pada
suhu 50 C dan dua isolat aktinomiset pada
substrat selulosa sintetik seperti CMC,
avicel dan kertas saring serta substrat limbah
pertanian berupa jerami padi, tongkol
jagung, dan kulit pisang.


BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium
Mikrobiologi FMIPA IPB dan Laboratorium
Bioteknologi Hewan PPSHB PPM IPB pada
bulan Februari-Oktober 2007.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah bakteri
Gram positif isolat C11-1 berasal dari
pengomposan kulit pisang di Kec. Cikalong
Kulon, isolat C4-4, C5-1, C5-3 yang berasal
dari kompos pisang di Kec. Panyingkiran
dan aktinomiset isolat KBM-2 dan KBM-4
berasal dari tanah sawah di Kab. Kebumen
yang merupakan koleksi Dr. Anja
Meryandini. Substrat yang digunakan
adalah CMC (Carboxymethyl cellulose) dari
Sigma, CMC Daisel, Avicel, kertas saring
Whatman no.1 berukuran 1 x 6 cm
2
, kulit
pisang (Kepok mentah), tongkol jagung dan
jerami padi. Pereaksi yang digunakan antara
lain DNS (Asam Dinitrosalisilat), 0.2 M
bufer fosfat pH 7, 0.2 M bufer sitrat pH 5
dan 3.5 dan 0.2 M tris HCl pH 8.
Alat yang digunakan adalah inkubator
bergoyang, vorteks, penangas, pH meter,
sentrifus, pipet mikro, spektrofotometer,
saringan berpori 65 mesh.

Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri atas 2 tahap. Tahap
pertama adalah penetapan waktu optimum
aktivitas enzim selulase tiap isolat. Tahap
kedua adalah pengukuran aktivitas enzim
selulase pada berbagai substrat berdasarkan
data pada tahap pertama.

Penetapan Waktu Optimum Produksi
Enzim Selulase
Tahap pertama penelitian ini mengkaji
hubungan kurva pertumbuhan bakteri

2
dengan kurva aktivitas harian enzim
selulasenya.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan.
Peremajaan isolat dilakukan pada media
agar miring CMC Sigma 1% (b/v) pada suhu
ruang hingga berumur 24 jam dan disimpan
pada refrigerator pada suhu 4 C. Masing-
masing sebanyak satu lup isolat berumur 24
jam diinokulasikan ke dalam 100 ml media
cair CMC Sigma 1% (b/v) pada Erlenmeyer
500 ml yang juga mengandung glukosa
0.1% (b/v) dan ekstrak khamir 0.2% (b/v)
(Lampiran 1). Kultur diinkubasi pada
inkubator bergoyang dengan kecepatan 120
rpm pada 29 C. Setiap 24 jam densitas
kultur sel diukur menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang
620 nm. Nilai absorbansi tersebut
dikorelasikan dengan kurva standar sel.
Penetapan kurva standar sel dilakukan pada
hari ke-2 atau ke-3 yaitu pada saat sel
mencapai fase eksponensial.

Aktivitas Harian Enzim Selulase.
Sebanyak 1 lup isolat C4-4, C11-1, C5-1,
C5-3 yang berumur 24 jam dan sebanyak 5
potong koloni isolat KBM-2 dan KBM-4
yang berdiameter 1 cm berumur 4 hari
masing-masing diinokulasi ke dalam media
cair CMC Sigma 1% (b/v) pada Erlenmeyer
500 ml. Enzim ektrak kasar didapatkan
dengan mensentrifugasi kultur sel pada 8400
g, suhu 4 C selama 15 menit. Pengukuran
aktivitas enzim selulase dilakukan dengan
modifikasi metode Miller (1959) dengan
menggunakan enzim ekstrak kasar dan
glukosa sebagai standar pada konsentrasi
0.02 mg/ml 0.2 mg/ml (Lampiran 2).
Aktivitas enzim selulase diuji terhadap
substrat CMC Sigma 1 % (b/v) yang
dilarutkan dalam bufer fosfat pH 7 pada
suhu 50 C selama 60 menit. Oleh karena
proses pengomposan dapat mencapai suhu
50 C maka aktivitas enzim selulase bakteri
selulolitik yang digunakan dalam penelitian
ini dilakukan pada suhu 50 C. Sampel
merupakan reaksi substrat dan enzim yang
diinkubasi pada suhu 50 C kemudian
dicampur dengan DNS, kontrol merupakan
campuran antara substrat dan enzim tanpa
diinkubasi pada suhu 50 C yang kemudian
dicampur DNS, blanko merupakan
campuran antara substrat, DNS dan akuades.
Perhitungan aktivitas enzim selulase
dinyatakan dengan nkat/ml, yang diacu
berdasarkan Dybkaer (2001). Satu unit
aktivitas enzim selulase adalah jumlah
enzim yang dibutuhkan untuk melepas 1
mol gula pereduksi per menit dan satu unit
aktivitas enzim setara dengan 16.67 nkat/ml.
Aktivitas enzim selulase dinyatakan dengan
rumus di bawah ini:

(X
s
X
k
) x 1000 x fp
nkat/ml = x 16.67
BM glukosa x t
Keterangan :
X
s
: Kadar gula sampel (mg/ml)
X
k
: Kadar gula kontrol (mg/ml)
t : Waktu inkubasi (menit)
fp : Faktor pengenceran

Pengukuran aktivitas enzim selulase pada
berbagai substrat
Produksi Enzim Ekstrak Kasar. Isolat
ditumbuhkan terlebih dahulu pada media
cair CMC Sigma 1 % (b/v) di Erlenmeyer
500 ml pada suhu 29 C dan digoyang pada
120 rpm selama waktu optimum panennya
berdasarkan data pengamatan pada tahap
pertama. Setelah waktu yang ditetapkan,
kultur sel disentrifugasi pada 8400 g, suhu 4
C selama 15 menit untuk memisahkan
biomassa. Supernatan merupakan enzim
ekstrak kasar.
Persiapan Substrat. Jerami padi,
tongkol jagung dan kulit pisang dikeringkan
terlebih dahulu pada suhu 70 C dalam oven
selama 3 hari. Kemudian masing-masing
substrat dihaluskan menggunakan alat
blender dan diayak dengan saringan 65
mesh. Substrat disterilisasi untuk mencegah
kontaminasi.

Uji Aktivitas Enzim pada Berbagai
Substrat. Sebanyak 5 ml substrat CMC
Sigma, CMC Daisel dan avicel ditambahkan
5 ml enzim ekstrak kasar. Untuk substrat
Kertas saring, sebanyak 2.5 potong Kertas
saring 1 x 6 cm
2
ditambahkan 2.5 ml bufer
dan 5 ml enzim ekstrak kasar. Sebanyak
0.05 g substrat jerami padi, tongkol jagung
dan kulit pisang ditambahkan 5 ml bufer dan
5 ml enzim ekstrak kasar. Reaksi antara
substrat dan enzim ekstrak kasar dilakukan
di dalam Erlenmeyer 100 ml selama 60
menit pada suhu optimum. Setelah itu reaksi
dihentikan dengan menambahkan 50 l
NaOH 0.2 M atau dengan menginkubasinya
pada suhu 100 C. Untuk substrat CMC
Sigma dan Daisel, campuran substrat-enzim
dipindahkan sebanyak 2 ml ke dalam tabung
reaksi kemudian ditambahkan 2 ml DNS dan
segera diinkubasi pada suhu 100 C.
Sebanyak 1 lembar kertas saring 1 x 6 cm
2

dan 3 ml larutannya (enzim ekstrak kasar

3
dan bufer) dipindahkan ke dalam tabung
reaksi dan ditambahkan 2 ml DNS kemudian
segera diinkubasi pada suhu 100 C. Setelah
inkubasi campuran substrat avicel, jerami
padi, tongkol jagung dan kulit pisang dengan
enzim selesai segera ditambahkan 50 l
NaOH 0.2 M. Lalu suspensi tersebut
disentrifus pada kecepatan 2500 rpm selama
25 menit. Sebanyak 2 ml supernatannya
diambil dan ditambahkan 2 ml DNS lalu
diinkubasi pada suhu 100 C. Seluruh
sampel diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 540 nm. Perlakuan
pada substrat CMC Sigma dan Daisel,
avicel, kertas saring, dan substrat limbah
pertanian berbeda karena tidak semua
substrat tersebut larut dalam bufer.
Konsentrasi substrat tiap Erlenmeyer adalah
1% (b/v) kecuali avicel 2% (b/v). Suhu
inkubasi substrat-enzim serta pH larutan
bufer disesuaikan dengan jenis isolat yang
digunakan. Hal tersebut dapat diketahui dari
penelitian sebelumnya yang telah
mengkarakterisasi suhu dan pH optimum
aktivitas enzim selulase setiap isolat
(Tabel 1). Uji aktivitas enzim selulase pada
berbagai substrat setiap isolat dilakukan
secara duplo dan dua ulangan dengan
menggunakan metode Miller (1959) yang
telah dimodifikasi (Lampiran 3).

Tabel 1 Karakterisasi suhu dan pH optimum
aktivitas selulase pada substrat CMC Sigma
(Sari 2007)
Nama
Isolat
Suhu
optimum
pH optimum
C4-4 70 C 5.0 (bufer sitrat)
C5-3 80 C 5.0 (bufer sitrat)
C5-1 90 C 3.5 (bufer sitrat)
C11-1 70 C 8.0 (tris HCl)
KBM-2 50 C 7.0 (bufer fosfat)
KBM-4 50 C 7.0 (bufer fosfat)

HASIL PENELITIAN
Hubungan antara kurva pertumbuhan
dan kurva aktivitas harian enzim selulase

Kurva pertumbuhan isolat C4-4, C11-1,
C5-1, C5-3 disajikan bersama dengan kurva
aktivitas harian enzim selulasenya pada
Gambar 1-4.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6
Waktu (hari)
A
k
t
i
v
i
t
a
s

s
e
l
u
l
a
s
e
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
L
o
g

s
e
l
aktivitas selulase (nkat/ml)
kurva pertumbuhan (log sel)

Gambar 1 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian
enzim selulase isolat C4-4. Aktivitas enzim
selulase diuji terhadap substrat CMC
(Sigma) pada suhu 50 C, pH 7 (bufer
fosfat 0.2 M).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (hari)
A
k
t
i
v
i
t
a
s

s
e
l
u
l
a
s
e
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
L
o
g

S
e
l
aktivitas selulase (nkat/ml)
kurva pertumbuhan (log sel)

Gambar 2 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian
enzim selulase isolat C11-1. Aktivitas
enzim selulase diuji terhadap substrat
CMC (Sigma) pada suhu 50 C, pH 7
(bufer fosfat 0.2 M).


Puncak aktivitas dan waktu optimum
untuk produksi enzim selulase isolat C4-4
adalah hari ke-2 (Gambar 1), dan hari ke-3
untuk isolat C11-1 (Gambar 2).

0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (hari)
A
k
t
i
v
i
t
a
s

s
e
l
u
l
a
s
e
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
L
o
g

s
e
l
aktivitas selulase (nkat/ml)
kurva pertumbuhan (log sel)

Gambar 3 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian
enzim selulase isolat C5-1. Aktivitas enzim
selulase diuji terhadap substrat CMC
(Sigma) pada suhu 50 C, pH 7 (bufer
fosfat 0.2 M).

4
Puncak aktivitas dan waktu optimum
untuk produksi enzim selulase isolat C5-1
adalah hari ke-3 (Gambar 3) dan hari ke-2
untuk isolat C5-3 (Gambar 4). Kurva
pertumbuhan isolat C5-3 mengalami
penurunan jumlah sel setelah inkubasi 24
jam.
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0 1 2 3 4 5
Waktu (har i)
A
k
t
i
v
i
t
a
s

s
e
l
u
l
a
s
e
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
L
o
g

s
e
l
aktivitas selulase(nkat/ml)
kurva pertumbuhan (log sel)

Gambar 4 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian
enzim selulase isolat C5-3,. Aktivitas
enzim selulase diuji terhadap substrat
CMC (Sigma) pada suhu 50 C, pH 7
(bufer fosfat 0.2 M).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (hari)
A
k
t
i
v
i
t
a
s

s
e
l
u
l
a
s
e
aktivitas selulase (nkat/ml)

Gambar 5 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM-
2. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap
substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 C, pH
7 (bufer fosfat 0.2 M).

0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (hari)
A
k
t
i
v
i
t
a
s

s
e
l
u
l
a
s
e

Aktivitas selulase (nkat/ml)

Gambar 6 Aktivitas harian enzim selulase isolat KBM-
4. Aktivitas enzim selulase diuji terhadap
substrat CMC (Sigma) pada suhu 50 C, pH
7 (bufer fosfat 0.2 M).

Waktu optimum isolat KBM-2 dan
KBM-4 untuk produksi enzim selulase
adalah hari ke-4 (Gambar 5 dan 6).


Aktivitas enzim selulase pada
berbagai substrat

Hasil uji aktivitas enzim selulase
menunjukkan tidak semua isolat memiliki
enzim ekstrak kasar yang mampu
mendegradasi substrat limbah pertanian
(Tabel 2).










Tabel 2 Nilai aktivitas enzim selulase tiap isolat terhadap berbagai substrat








Aktivitas Enzim (nkat/ml) x 10
-3
No Isolat
CMC
Sigma
CMC
Daisel
Avicel Kertas
Saring
Jerami
padi
Tongkol
Jagung
Kulit
pisang
1 C4-4 112 95 31 74 88 81 180
2 C5-1 42 28 8 0 94 80 262
3 C5-3 20 20 0 70 90 40 210
4 C11-1 193 267 17 82 179 128 147
5 KBM-2 483 529 75 73 107 112 118
6 KBM-4 479 566 71 192 90 99 16

5
PEMBAHASAN

Hubungan Kurva Tumbuh dan Produksi
Enzim Selulase
Setiap bakteri selulolitik menghasilkan
kompleks enzim selulase yang berbeda-
beda, tergantung dari gen yang dimiliki dan
sumber karbon yang digunakan. Dalam
penelitian ini, semua isolat tumbuh pada
media cair CMC Sigma yang mengandung
CMC Sigma 1% (b/v) sebagai komponen
indusernya. Glukosa 0.1% (b/v) dan ekstrak
khamir 0.2% (b/v) juga ditambahkan pada
media sebagai pemacu tumbuh sel di fase
awal (White 1995). Setelah glukosa pada
medium tumbuhnya habis maka bakteri akan
memanfaatkan sumber karbon selulosa
dengan mensintesis enzim selulase. Pada
Gambar 1, 2, 3 terlihat bahwa aktivitas
enzim selulase meningkat seiring dengan
pertumbuhan selnya. Namun ketika sel
mencapai fase stasioner, aktivitas enzim
selulase menurun. Pada fase stasioner
kecepatan pembelahan sel sama dengan
kecepatan kematian sel dan lisis sel sehingga
pada fase ini selain enzim selulase, enzim
protease juga dihasilkan (Martina et al.
2002). Hal ini menyebabkan turunnya
aktivitas enzim selulase. Turunnya jumlah
sel pada isolat C5-3 disertai dengan
munculnya komponen mengapung berwarna
putih pada kaldu kultur isolat ini pada hari
ke-2 inkubasi. Partikel ini bukanlah
kontaminan karena tidak terdapat koloni
berbeda pada goresan kuadrannya. Namun
komponen tersebut tidak diidentifikasi lebih
lanjut.
Pada saat puncak aktivitas enzim
selulase, bakteri mengeluarkan enzim
selulase secara maksimal ke lingkungan
luarnya. Namun terjadi feed back inhibition
sehingga dapat menghambat aktivitas pada
enzim selulase. Molekul glukosa sebagai
produk akhir dari enzim selulase menempel
pada sisi alosterik enzim sehingga sisi aktif
enzim selulase tidak dapat lagi ditempati
oleh substrat selulosa. Selain itu terjadi
represi sintesis enzim selulosa oleh karena
kehadiran glukosa yang berlimpah. Glukosa
merupakan sumber karbon sederhana yang
dapat merepresi sintesis enzim selulase
(Abalos et al. 1997). Karena masing-masing
isolat memiliki waktu optimum untuk
produksi enzim yang berbeda, maka untuk
mendegradasi substrat limbah pertanian
seperti jerami padi, tongkol jagung dan kulit
pisang digunakan enzim ekstrak kasar yang
diproduksi pada waktu puncak aktivitas enzim
selulase tiap isolat.

Aktivitas Enzim Selulase pada Substrat
Selulosa Murni
Pada pH dan suhu optimumnya, tiap isolat
memiliki aktivitas optimum enzim selulase pada
substrat yang berbeda. Hal ini menunjukkan
tiap isolat memiliki kompleks enzim selulase
yang berbeda. Isolat, C5-1, C11-1, C4-4, KBM-
2 dan KBM-4 memiliki aktivitas selulase
optimum pada substrat CMC Sigma berturut-
turut sebesar 0.042 nkat/ml, 0.267 nkat/ml,
0.112 nkat/ml, 0.483 nkat/ml dan 0.566 nkat/ml.
Hal ini menggambarkan bahwa isolat C11-1,
C5-1, C4-4, KBM-2 dan KBM-4 memiliki
sejumlah besar endo-1,4--glukanase. Substrat
CMC Sigma (Carboxymethyl cellulose)
merupakan substrat selulosa murni yang
berbentuk amorphous sehingga aktivitas enzim
selulase pada substrat CMC Sigma merupakan
aktivitas enzim endo-1,4--glukanase (Lynd et
al. 2002). Endo-1,4--glukanase bekerja pada
rantai dalam CMC Sigma menghasilkan oligo-
sakarida atau rantai selulosa yang lebih pendek.
Di antara keempat isolat tersebut, KBM-2
memiliki aktivitas enzim selulase yang paling
tinggi terhadap substrat CMC Sigma. Aktivitas
enzim selulase pada substrat Avicel yaitu
substrat selulosa yang berbentuk kristalin (Kim
H 1995), menunjukkan adanya aktivitas enzim
ekso-1,4--glukanase, yang memotong ujung
rantai oligo-sakarida menjadi selobiosa, yaitu
dua molekul glukosa yang berikatan secara -
1,4-glikosidik. Semua isolat yang digunakan
pada penelitian ini memiliki aktivitas enzim
selulase pada substrat Avicel yang relatif
rendah.
Isolat C4-4, C11-1, C5-3, KBM-2 dan
KBM-4 memiliki aktivitas enzim selulase pada
substrat kertas saring, yaitu selulosa sintetik
campuran antara selulosa amorphous dan
kristalin. Hal ini menunjukkan isolat tersebut
memiliki sinergisme antara enzim endo-1,4--
glukanase dan ekso-1,4--glukanase. Dalam
mendegradasi selulosa menjadi glukosa, enzim
endo-1,4--glukanase, ekso-1,4--glukanase,
dan -glukosidase bekerja secara sinergis (Lynd
et al. 2002). Setelah enzim endo-1,4--
glukanase memotong bagian amorphous, ekso-
1,4--glukanase memotong bagian ujung rantai
selulosa kristalin menjadi gula pereduksi.
Kemudian gula pereduksi tersebut diikat oleh
larutan DNS (asam dinitrosalisilat) yang
menghasilkan warna jingga. Semakin besar
jumlah gula pereduksi yang dihasilkan semakin
pekat warna pereaksinya. Tidak ditemukannya
aktivitas enzim selulase isolat C5-1 pada

6
substrat kertas saring kemungkinan karena
sangat kecilnya aktivitas enzim ekso- 1,4--
glukanase pada isolat tersebut.

Aktivitas Enzim Selulase pada Substrat
Limbah Pertanian
Substrat jerami padi, tongkol jagung
dan kulit pisang merupakan substrat selulosa
yang tidak murni. Menurut Davendra (1982)
yang diacu dalam Husnadjat (1998), jerami
padi terdiri atas 33% selulosa, 26 %
hemiselulosa, 7% lignin serta 13% silika.
Komposisi serat tongkol jagung adalah
23.74% lignin, 65.96% selulosa, dan 10.82%
hemiselulosa (Pratiwi 2006). Robetson
(1993) menganalisis komposisi kulit pisang
mentah berdasarkan analisis dinding sel (%
Berat kering) yaitu: 37.52 % hemiselulosa,
12.06 % selulosa, 7.04 % lignin dan 0.36 %
silika.
Selulosa terbungkus dan terikat secara
ikatan kovalen maupun non-kovalen pada
lignin dan hemiselulosa (Perez et al. 2002).
Hemiselulosa maupun lignin akan
mengganggu aktivitas enzim selulase yang
hanya spesifik memotong ikatan -1,4-
glikosidik pada selulosa. Oleh sebab itu
untuk meningkatkan luas permukaan
substrat maka jerami padi, tongkol jagung
dan kulit pisang diperkecil ukurannya
sampai 65 mesh. Pengocokan pada saat
inkubasi substrat-enzim juga memperbesar
kontak antara enzim selulase dan komponen
selulosa sehingga dapat meningkatkan
aktivitas enzim selulase.
Isolat C11-1 dan KBM-2 relatif mampu
mendegradasi jerami padi, tongkol jagung
dan kulit pisang (Tabel 2). Isolat tersebut
juga memiliki aktivitas yang tinggi pada
selulosa murni (CMC Sigma, CMC Daisel
dan Avicel). Hal ini menunjukkan bahwa
isolat C11-1 dan KBM-2 memiliki enzim
selulase yang potensial.
Isolat C5-3, C5-1, C4-4 dan KBM-4
relatif kurang mampu mendegradasi jerami
padi, tongkol jagung dan kulit pisang.
Aktivitas selulase yang rendah pada substrat
sintetik (CMC Sigma, CMC Daisel dan
Avicel) dan limbah jerami padi, tongkol
jagung dan kulit pisang menunjukkan bahwa
isolat C5-1 dan C5-3 memiliki enzim
selulase yang kurang potensial. Hal yang
menghambat aktivitas selulase pada substrat
jerami padi, tongkol jagung, dan kulit pisang
adalah komponen lignin. Lignin
membungkus dan mengikat selulosa secara
fisik sehingga menghalangi enzim selulase
bekerja maksimal pada substrat.
Sekalipun memiliki aktivitas selulase yang
relatif kecil terhadap substrat jerami padi dan
tongkol jagung, isolat C5-1, C4-4 dan C5-3
memiliki aktivitas yang tinggi terhadap limbah
kulit pisang yaitu 0.262 nkat/ml, 0.180 nkat/ml
dan 0.21 nkat/ml. Hal ini mungkin disebabkan
oleh kadar lignin yang terdapat pada kulit
pisang lebih sedikit daripada tongkol jagung.
Kadar silika pada kulit pisang juga lebih sedikit
dibandingkan pada jerami padi.
Secara umum aktivitas enzim selulase tiap
isolat lebih tinggi pada substrat limbah
pertanian dibandingkan pada substrat selulosa
murni. Kemungkinan hal ini disebabkan oleh
adanya enzim hemiselulolitik pada enzim
ekstrak kasar yang diproduksi oleh bakteri.
Bakteri Clostridium cellulovorans mensintesis
enzim hemiselulolitik (xylA) saat tumbuh pada
substrat selulosa seperti selobiosa (Han et al.
2003). Han et al. (2003) juga menyatakan
ekspresi enzim selulase berhubungan dengan
ekspresi enzim hemiselulase. Kemungkinan hal
ini juga dapat terjadi pada isolat yang
digunakan pada penelitian ini.


SIMPULAN

Aktivitas tertinggi enzim selulase isolat
C5-1, C5-3, C4-4 dan KBM-2 terhadap substrat
limbah pertanian adalah pada limbah kulit
pisang yaitu berturut-turut sebesar 262 x 10
-3

nkat/ml, 210 x 10
-3
nkat/ml, 180 x 10
-3
nkat/ml
dan 118 x 10
-3
nkat/ml. Isolat C11-1 dan
KBM-4 memiliki aktivitas tertinggi berturut-
turut pada limbah jerami padi (179 x 10
-3

nkat/ml) dan tongkol jagung (99 x 10
-3
nkat/ml).
Isolat C5-3 dan C5-1 relatif kurang mampu
mendegradasi jerami padi dan tongkol jagung
yaitu dengan aktivitas sebesar 90 x 10
-3
nkat/ml
dan 40 x 10
-3
nkat/ml untuk C5-3 serta 94 x 10
-3

nkat/ml dan 80 x 10
-3
nkat/ml untuk C5-1.



SARAN

Karena tingginya aktivitas enzim selulase
isolat-isolat yang digunakan pada penelitian ini
pada substrat limbah pertanian maka perlu
dilakukan pengujian enzim ekstrak kasar dari
isolat C4-4, C5-1, C5-3, C11-1, KBM-2 dan
KBM-4 terhadap substrat xilan maupun lignin
untuk melihat kemampuan enzim terhadap
substrat tersebut.




7
DAFTAR PUSTAKA

Abalos J. M. F., Arribas A. R., Garda A. L.,
Santamaria R. I. 1997. Effect of
carbon source on the expression of
celA1, a cellulase-encoding gene
from Streptomyces halstedii JM8.
FEMS Microbiol Letters 153: 97-
103.
Alam M. Z., Manchur M. A., Anwar M. N.
2004. Isolation, purification,
characterization of cellulolytic
enzymes produced by the isolate
Streptomyces omiyaensis. Pakist J
Biol Sci 7(10): 1647-1653.
Dybkaer R. 2001. Unit katal for catalytic
activity. Pure Appl Chem 73: 927-
931.
Husnadjat. 1998. Peningkatan daya cerna
isolat bakteri selulolitik rumen
kerbau pada dinding sel jerami pada
dengan dipacu faktor pertumbuhan
[skripsi].Bogor: Fakultas Peternakan,
Institut Pertanian Bogor.
Han S O., Yukawa H., Inui M., Doi R H.
2003. Regulation of expression of
cellulosomal cellulase and
hemicellulase genes in Clostridium
cellulovorans. J Bacteriol 185(20):
6067-6075.
Kim H. 1995. Characterization and substrate
specivicity of an endo--1,4-D-
glukanase I (Avicelase I) from an
extracellular multienzyme complex
of Bacillus circulans. Appl
Environ Microbiol 61: 959-965.
Kirk O. 2002. Industrial Enzyme
Applications. Bagsvaerd, Denmark:
Elsevier Science Ltd.
Lynd L R., Weimer P. J., Zyl W. H.,
Pretorius I S. 2002. Microbial
cellulose utilization: fundamental
and biotechnology. Microbiol
Molecul Bio Reviews 66: 506-577.
Martina A., Yuli N., Sutisna M. 2002.
Optimasi beberapa faktor fisik
terhadap laju degradasi selulosa kayu
albasia Paraserianthes falcataria (L)
Nielsen dan karboksimetilselulosa
(CMC) secara enzimatik oleh jamur.
J Natur 4:156-163.
Miller G L. 1959. Use of dinitrosalicylic
acid reagent for determination of
reducing sugar. Anal Chem 31: 426-
428.
Perez J., Munoz-Dorado J, Rubia T.,
Martinez J. 2002. Biodegradation
and biological treatment of cellulose,
hemicellulose and lignin: an over view.
J Int Microbiol 5: 53-63.
Poedjiadi A. 1994. Dasar-DasarBiokimia.
Jakarta: UI Press.
Pratiwi F M R. 2006. Produksi xilanase dari
Streptomyces sp. pada substrat xilan
tongkol jagung [skripsi]. Bogor:
Fakultas Teknologi Pertanian, Institut
Pertanian Bogor.
Robetson E. 1993. Evaluasi nutrisi, korelasi
vegetatif dan kemungkinan kulit pisang
sebagai makanan ternak ruminansia
menggunakan teknik in vitro dan in situ
[Karya Ilmiah]. Bogor: Fakultas
Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Sari W. W. 2007. Karakterisasi selulase bakteri
asal tanah pertanian Jawa Tengah dan
Jawa Barat [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
White D. 1995. The Physiology and
Biochemistry of Prokaryotes. New
York: Oxford University Pres.





8













LAMPIRAN



















9
Lampiran 1. Komposisi Bahan-bahan yang Digunakan

a. Bufer Fosfat (pH 7.0, 0.2 M)
Larutan bufer fosfat pH 7.0 terdiri dari 39 ml NaHPO
4
.
H
2
O 0.2 M (27.8 g dalam 1000 ml
akuades) dan 61 ml Na
2
HPO
4
.
2H
2
O 0.2 M (35.6 g dalam 1000 ml akuades). Kemudian
bufer disimpan di dalam botol steril pada suhu ruang.
b. Bufer Sitrat (pH 3.5 dan pH 5.0, 0.2 M)
Bufer sitrat terdiri asam sitrat 0.2 M (19.21 g/l akuades) dan larutan Na
2
HPO
4
.
2H
2
O 0.2 M
(35.6 g/l akuades). Larutan buffer pH 5 mengandung 24.3 ml asam sitrat dan 25.7 ml
larutan Na
2
HPO
4
.
2H
2
O. Sedangkan buffer pH 3.5 mengandung 35.9 ml asam sitrat dan
14.1 ml larutan Na
2
HPO
4
.
2H
2
O.
c. Bufer Tris HCl (pH 8 0.2 M)
Larutan 0.2 M bufer tris HCl pH 8 mengandung larutan tris (larutan A) HCl 24.2 g/l
akuades dan (larutan B) larutan 0.2 M HCl. Perbandingan larutan A dan B adalah 3:1.
d. Pembuatan DNS
Dinitrosalisilat terdiri atas 10 g NaOH padat, 182 g KNa Tartrat, 0.5 g Na
2
SO
3
, 10 g DNS
dan dicampurkan dengan akuades steril, ditera sampai 1000 ml.
e. Pembuatan Media CMC Sigma (Carboxymethyl cellulose)
Media CMC Sigma mengandung 10 g carboxymethyl cellulose, 0.2 g MgSO
4
.
7 H
2
O, 0.75 g
KNO
3
, 0.5 g K
2
HPO
4
, 0.02 g FeSO
4
.
7 H
2
O, 0.04 g CaCl
2
, 2 g ekstrak khamir, dan 1 g
glukosa lalu dilarutkan dalam 1000 ml akuades.



















10
Lampiran 2 Kurva Standar Glukosa

Kurva Standar Glukosa
y =2.1742x +0.0115
R
2
=0.9887
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
konsentrasi gl ukosa (mg/ml )
A
b
s
o
r
b
a
n

















Contoh Perhitungan Aktivitas enzim
selulase :
Tanpa dilakukan pengenceran enzim
Absorban terkoreksi sampel : 0.5
Absorban terkoreksi kontrol : 0.1

Maka kadar glukosa :
Sampel : y = 2.1742x + 0.0115
0.5 = 2.1742x + 0.0115
X = 0.5 0.0115
2.1742

X = 1.062 mg/ml

Kontrol : y = 2.1742x + 0.0115
0.1 = 2.1742x + 0.0115
X = 0.1 0.0115
2.1742
X = 0.192 mg/ml

Aktivitas Selulase : (1.062 0.192) x 1000
180 x 60 menit
= 1.343 nkat/ml
Konsentrasi glukosa
(mg/ml)
Absorban pada
540 nm
0.02 0.001
0.04 0.017
0.06 0.067
0.08 0.114
0.10 0.168
0.12 0.222
0.14 0.283
0.16 0.333
0.18 0.391
0.20 0.437
X 16.67

11

Lampiran 3 Metode Kerja Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase pada Berbagai Substrat
5 ml Substrat
CMC
Sigma
CMC
Daisel
Avicel
Sebanyak
2.5 potong
Kertas
Saring
1x 6 cm
2

ditambah
2.5 ml
bufer
Jerami
padi
Kulit
Pisang
Tongkol
jagung
Substrat dicampurkan dengan 5 ml enzim ekstrak kasar dalam Erlenmeyer 100 ml
Inkubasi dalam inkubator bergoyang,
digoyang pada kecepatan 120 rpm
selama 60 menit pada suhu optimum
Sebanyak 2 ml
dipindahkan ke
dalam tabung
Ditambahkan 2 ml larutan DNS
CMC
Sigma
CMC
Daisel
Kertas
saring
Sebanyak 3 ml
larutan dan 1 lembar
kertas saring
(1 x 6 cm)
dipindahkan ke
dalam tabung
Avicel, Jerami padi, tongkol
jagung dan kulit pisang
Ditambah 50 L
NaOH 0.2 M dan
disentrifus, 2500 rpm
selama 20 menit
Sebanyak 2 ml
dipindahkan ke
dalam tabung
Sebanyak 0.05 g substrat
ditambahkan 5 ml bufer
Ukur Absorbansi pada 540 nm
Inkubasi 100 C, 15 menit