Anda di halaman 1dari 15

Sterilisasi Alat dan Bahan

Teori Dasar
Sebelum melakukan percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi terlebih
dahulu untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus.
Dekontaminasi adalah proses menghilangkan atau membunuh mikroorganisme sehingga objek
aman untuk ditangani, tujuannya untuk melindungi praktikan yang melakukan percobaan
menggunakan bakteri atau semacamnya. Ada beberapa metode dekontaminasi, yaitu:
1. Sterilisasi : proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya.
2. Desinfeksi : metode untuk memusnahkan atau menghancurkan mikroorganisme patogen.
3. Sanitasi : metode untuk mengurangi tingkat organisme yang hidup.
Beberapa mikroorganisme memiliki resistensi terhadap dekontaminan kimia, seperti : bakteri
vegetatif, jamur, dan virus yang mengandung lipida relatif yang mudah didekontaminasi dengan
senyawa kimia. Virus yang tidak mengandung lipida dan bakteri berlapis lilin memiliki tingkat
resistensi tinggi. Resistensi terhadap dekontaminan kimia dipengaruhi beberapa faktor, seperti :
konsentrasi dari zat aktif, lamanya kontak, pH, suhu, kelembapan, dan kehadiran senyawa organik.
Inaktivasi mikroorganisme dengan dekontaminan kimia dapat melalui mekanisme sebagai
berikut :
Koagulasi dan denaturasi protein
Lisis
Ikatan dengan enzim atau destruksi substrat enzim
Oksidasi
Hal penting yang harus diperhatikan dalam melakukan dekontaminasi :
1. Target mikroorganisme.
2. Dekontaminan yang digunakan (bentuk dan target yang diinginkan).
3. Tingkat inaktivasi yang diperlukan.
4. Adanya substrat organik seperti darah, agar, dsb.
5. Tipe permukaan dari target seperti : padat, berpori atau mudah diterbangkan udara.
6. Konsentrasi tertinggi dari sel yang dapat ditanggulangi dengan inaktivasi.
7. Kemampuan dekontaminan kontak dengan mikroorganisme.
8. Prosedur antisipasi yang diperlukan dalam dekontaminasi agar efisien dalam waktu dan
konsentrasi yang digunakan.
9. Toksisitas dari dekontaminan yang dapat membahayakan praktikan di area tersebut.
Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan sporasporanya. Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu :
1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)
2. Sterilisasi Panas Kering
3. Sterilisasi dengan Penyaringan (Filtrasi)
4. Sterilisasi Gas
5. Sterilisasi dengan Radiasi
Metode yang biasa digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah

metode sterilisasi uap (panas lembab) dan metode sterilisasi panas kering.
1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)
Sterilisasi Uap dilakukan menggunakan autoclave dengan prinsipnya memakai uap air dalam
tekanan sebagai pensterilnya. Temperatur sterilisasi biasanya 121, tekanan yang biasa
digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung
dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit
tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :
1. Penguraian gula.
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih
rendah dibandingkan jika tidak ada kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air
panas adalah terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organisme
tersebut.
Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoclave adalah :
- Suhu 115,5 , waktu 30 menit
- Suhu 121,5 , waktu 20 menit
- Suhu 126,5 , waktu 15 menit
Metode sterilisasi uap umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan lain
yang tahan terhadap temperatur yang dipergunakan dan tahan terhadap penembusan uap air,
larutan dengan pembawa air, alat-alat gelas, pembalut untuk bedah, penutup karet dan plastik, dan
media untuk pekerjaan mikrobiologi.
2. Sterilisasi Panas Kering
Sterilisasi Panas Kering dilakukan menggunakan oven pensteril, karena metode sterilisasi panas
kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan sterilisasi uap. Metode ini
memerlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang, sterilisasi panas kering
biasanya ditetapkan pada temperatur 160-170 dengan waktu 1-2 jam. Umumnya digunakan
untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air, seperti minyak lemak,
minyak mineral, gliserin (berbagai jenis minyak), petrolatum jelly, lilin, wax, dan serbuk yang
tidak stabil dengan uap air. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah.
Karena tingginya suhu yang diterapkan dalam sterilisasi panas kering, maka metode ini dapat
digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan. Contohnya alat ukur dan penutup
karet atau plastik. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi panas kering dengan menggunakan
oven steril adalah :
Suhu 170C, waktu 1 jam
Suhu 160C, waktu 2 jam
Suhu 150C, waktu 2,5 jam
Suhu 140C, waktu 3 jam
Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering.
Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati.
3. Sterilisasi dengan Penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) digunakan untuk sterilisasi larutan yang termolabil,
penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba
hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Dibutuhkan penguasaan
teknik aseptik yang baik dalam melakukan metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen.
Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus. Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari
metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan
tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik
melalui penyaring dengan matriks pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme
untuk dapat melaluinya. Cara sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau
bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain.
Teknologi tinggi membran filtrasi meningkatkan penggunaan sterilisasi filtrasi, khususnya jika
digunakan berpasangan dengan sistem proses aseptik.
4. Sterilisasi Gas
Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan
sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi
adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang
digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan
yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan
yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan
protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi
tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida.
Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85C dan 50%
kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L
membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas
atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton,
metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan
biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi
gugus SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein
mengalami kerusakan dan mikroba mati.
Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan
distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya
kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada
pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.
5. Sterilisasi dengan Radiasi
Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk bahan/produk dan alat-alat medis yang peka terhadap
panas (termolabil) dan jika residu etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari dosis
radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan faktor kontrol dalam sterilisasi
radiasi selama dengan waktu radiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi kehatihatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator sterilisasi. Prinsip sterilisasi radiasi adalah
radiasi menembus dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga mikroba
mengalami mutasi. Ada dua macam radiasi yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik
(sinar x, sinar ) dan arus partikel kecil (sinar dan ).

pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasi alat-alat yang berada di laboratorium mikrobiologi.
Tujuan dilakukannya sterilisasi alat ialah agar alat-alat yang berada di laboratorium tidak
terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di lingkungan sekitar. Alat- alat yang disterilisasi
yaitu tabung reaksi, labu ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, pipet volume, dan cawan petri. Alatalat yang disterilisasi menggunakan autoclave merupakan alat-alat gelas yang presisi. Dalam
sterilisasi uap (panas lembab) menggunakan autoclave dengan membutuhkan waktu yang sangat
singkat untuk mensterilkan alat dan pada suhu 121, karena alat gelas tidak akan memuai
sehingga tidak akan merubah ukuran alat. Sedangkan jika menggunakan oven dalam sterilisasi
uap membutuhkan waktu yang lama yaitu 1-2 jam dan membutuhkan suhu yang tinggi 160-170
. Karena pada suhu 160-170 , alat gelas akan memuai sehingga dapat merubah ukuran alat.
Sebelum alat-alat gelas disterilisasikan menggunakan autoclave, semua alat ditutup dengan kapas
yang dibungkus kain kasa dan dilapisi alumunium foil. Tujuannya yaitu semua alat yang
disterilisasi benar-benar steril dari mikroba agar tidak ada lagi spora mikroba yang masuk.
Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer. Media
yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Nutrien Agar adalah medium umum
untuk uji air dan produk pangan. Nutrien juga digunakan untuk pertumbuhan dari mikroorganisme
yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media
sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton dan agar. Lalu Nutrien Broth adalah media untuk
mikroorganisme yang berbentuk cair. Kegunaan dari Nutrien Broth tidak jauh berbeda dengan
Nutrien Agar. Pembuatan media Nutrien Broth dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth
tidak mengandung agar sehingga dapat mudah larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan
untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat.
Untuk membuat media Nutrien Broth dibutuhkan 3,9150 gram Nutrien Broth dan 300 ml aquades.
Nutrien Broth lalu dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning
keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien Broth
dipanaskan menggunakan hot plate. Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik
stirrer yang bertujuan agar Nutrien Broth larut sempurna dan menghasilkan larutan berwarna
kuning yang jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang
dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil. Sedangkan untuk
membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 10,05 gram Nutrien Agar dan 500 ml aquades. Nutrien
agar dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning tua keruh. Warna
kuning tua keruh ini berarti larutan masih belum steril, setelah itu Nutrien Agar dipanaskan juga
menggunakan hot plate . Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer yang
bertujuan agar Nutrien Agar larut sempurna dan menghasilkan larutan berwarna kuning tua jernih.
Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa
dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil. Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil agar
proses sterilisasi media Nutrien Broth berjalan lancar dan menghasilkan media Nutrien Broth yang
benar-benar steril. Setelah itu labu Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoclave dengan suhu 121
selama 15 menit. Setelah 15 menit, labu dikeluarkan dari autoclave dan menghasilkan larutan
Nutrien Broth yang berwarna kuning jernih sama dengan warna larutan Nutrien Broth sebelum
dimasukkan kedalam autoclave. Setelah itu larutan Nutrien broth didiamkan selama 24 jam di
laboratorium. Pendiaman ini dilakukan karena mikroba atau bakteri dapat berkembang biak

dengan cepat dalam waktu 24 jam.


Tujuan dilakukan membuat media dari Nutrien Agar dan Nutrien Broth adalah untuk biakan jamur
pada Nutrien Agar, dan sebagai media pertumbuhan bakteri pada Nutrien Broth. Dari percobaan
yang telah dilakukan ternyata hasil yang diperoleh dari media Nutrien Agar tidak terdapat bakteri
yang berupa lendir pada bagian atas media dan pada Nutrien Broth tidak terdapat jamur yang
tumbuh di sekitar mulut tabung. Hal ini di sebabkan karena alat-alat yang dipakai masih steril,
sedangkan jika terdapat bakteri dan jamur pada media alat-alat yang dipakai sudah dalam kondisi
tidak steril lagi.
mikroorganisme yang dijumpai di laboratorium dan pada permukaan tubuh

pembahasan
Mikroorganisme adalah sebuah organisme kehidupan yang terlalu kecil untuk dilihat dengan mata
telanjang. Ukuran yang digunakan untuk mikroorganisme adalah mikrometer (m) ; 1m = 0,001
milimeter, 1 nanometer = 0,001 m. Mikroorganisme dapat ditemukan dimana-mana dan sangat
berperan dalam semua kehidupan di muka bumi. sebagai contoh pada praktikum kali ini yaitu
dilakukan pengamatan mengenai contoh contoh mikroorganisme yang sering dijumpai di
laboratorium dan juga pada tubuh manusia .
mikroorganisme atau mikroba dapat dibiakkan melalui medium pertumbuhan mikroba. Medium
pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrien yang diperlukan
mikrobia untuk pertumbuhannya. Dengan menggunakan bahan medium pertumbuhan, aktivitas
mikrobia dapat dipelajari dan dengan menggunakan medium tumbuh dapat dilakukan isolasi
mikrobia menjadi biakan murni. Pada dasarnya bahan-bahan untuk pertumbuhan medium dapat
dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu bahan dasar yang meliputi air, agar yang bersifat tidak
diuraikan oleh mikrobia, gelatin yang merupakan protein yang dapat diuraikan oleh mikrobia, dan
silika gel yaitu bahan yang mengandung natrium silikat khusus untuk menumbuhkan mikrobia
yang bersifat obligat autotrof, unsur-unsur nutrien yang dapat diambil dari bahan alam, meliputi
karbohidrat, lemak dan asam-asam organik, sumber nitrogen yang mencakup pepton dan protein,
garam-garam kimia (K, Na, Fedan Mg), vitamin, dan sari buah, ekstrak sayuran dan susu. Serta
bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang sengaja ditambahkan ke dalam medium dengan tujuan
tertentu seperti indikator maupun anti biotik. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh
media yang digunakan disterilkan terlebih dahulu.
Dalam praktikum kali ini percobaan yang dilakukan adalah pembuatan media dari nutrient agar
dan nutrient browth.
Sama seperti pembuatan media bakteri pada umumnya, bahan-bahan yang diperlukan ditimbang
terlebih dahulu kemudian dicampur dan dipanaskan. Pada saat dipanaskan media harus diaduk
supaya larutan yang ada di dalam media tersebut dapat homogen dengan baik.
Untuk media pada cawan petri, yang disterilisasikan dalam autoklaf yaitu erlenmeyernya, baru
sesudah itu media dipindahkan ke dalam cawan petri sesuai prosedur cara kerja yang aseptis,
sedangkan untuk media pada tabung reaksi yang dipanaskan dalam autoklaf adalah tabung
reaksinya. Sesudah media dibuat pada erlenmeyer dan dipanaskan pada air mendidih lalu media
dimasukkan ke dalam tabung reaksi untuk kemudian disterilisasikan di dalam autoklaf. Ini

bertujuan agar media yang dibuat tidak rusak akibat pemanasan.


kemudian selanjutnya adalah pembiakan bakteri pada medium tersebut. bakteri yang digunakan
berasaldari beberapa sumber yaitu permukaan kulit, permukaan lidah, saliva dan kandang tikus.
pengamatan dilakukan selama 3 hari dan setiap 24 jam dilakukan pengamatan untuk melihat
perkembangannya.
pada media NA dengan sampel bakteri dari permukaan kulit adalah positif menunjukan adanya
bakteri. Kebanyakan bakteri kulit di jumpai pada epitelium yang seakan-akan bersisik (lapisan
luar epidermis), membentuk koloni pada permukaan sel-sel mati. Kebanyakan bakteri ini adalah
spesiesStaphylococcus dan sianobakteri aerobik, atau difteroid. lalu bakteri pada permukaan mulut
jug positif , hal tersebut dikarenakan
Kelembapan yang paling tinggi, adanya makanan terlarut secara konstan dan juga partikel-partikel
kecil makanan membuat mulut merupakan lingkungan ideal bagi pertumbuhan bakteri. Mikrobiota
mulut atau rongga mulut sangat beragam; banyak bergantung pada kesehatan pribadi masingmasing individu.
isoasi identifikasi
Teori
: Mikroorganisme ada dimana-mana. Mereka dapat ditemukan di tanah, udara, air,
makanan, limbah, bahkan di permukaan tubuh. Singkatnya, setiap area dari lingkungankitapenuh
dengan mikroba.Ilmu mikrobiologi memisahkan populasi yang beraneka ragam tersebut menjadi
spesies induvidu yang dapat dipelajari (Cappucino, 1983).
Berbagai macam mikroorganisme dapat ditemukan di alam dalam populasi yang
heterogen.Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan.Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat
sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo, 1996).
Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan,
sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel
mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Beberapa cara yang dilakukan untuk
mengisolasi mikrooraganisme antara cara goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate),
cara sebar (spread plate), cara pengenceran ( dilution plate) serta micromanipulator (Pleczar,
1986).
Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap
sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga
memudahkan pemisahan selanjutnya (Sutedjo, 1996).
Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena
terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel itu dipisahkan
dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan dibiarkan
membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi
atau cawan petri-cawan petri yang terpisah (Sutedjo, 1996).
Beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam mengisolasi bakteri adalah sebagai berikut :
1.
2.

Sifat dan jenis mikroorganisme


Habitat mikroorganisme

3.
4.
5.
6.

Medium pertumbuhan
Cara menginokulasi dan inkubasi
Cara mengidentifikasi bakteri
Cara pemeliharaannya (Dwidjoseputro, 1998)

Ada bermacam-macam metode isolasi yang dapat digunakan. Macam-macam metodeisolasi


tersebut antara lain :
1)
Isolasi Tunggal
Merupakan metode isolasi dengan cara meneteskan bahan yang mengandung mikroorganisme
pada suatu kaca penutup dengan menggunakan mikropipet, yang kemudian diteliti dibawah
obyektif mikroskop.
2)
Isolasi Gores
Merupakan metode isolasi dengan cara menggeser atau menggoreskan ujung jarum ose yang telah
mengandung mikroorganisme dengan hati-hati di atas permukaan agar secara zig zag yang dimulai
dari dasar tabung menuju ke bagian atas tabung.
3)
Isolasi Tebar
Merupakan metode isolasi dengan cara menebarkan bahan yang mengandung mikroorganisme
pada permukaan atas tabung
4)
Isolasi Tuang
Merupakan metode isolasi dengan cara mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang telah
diencerkan dan sampel tersebut kemudian disebarkan didalam suatu medium dari kaldu dan
gelatin encer (Dwidjoseputro, 1998).
Oleh Nuniek, 2001 isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu cara penggoresan dan
cara penaburan.
a.
Isolasi Mikroba dengan Cara Penggoresan
Tujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah
dengan baik dari suspensi sel yang pekat.Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut
ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan
yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.
Ada beberapa teknik goresan, diantaranya adalah :
Goresan T
Goresan Kuadran
Goresan Radian
Goresan Sinambung (Nuniek, 2001)
b.
Isolasi Mikroba dengan Cara Penaburan
Cara penaburan (pour plate) merupakan cara yang kedua di samping penggoresan untuk
memperoleh biakan murni dari biakan campuran mikroba. Cara ini berbeda dari cara penggoresan
dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair yaitu pada suhu 450C, dan demikian pula
koloni-koloni akan berkembang di seluruh media, tidak hanya pada permukaan. Untuk beberapa
tujuan hal ini menguntungkan, contohnya dalam mempelajari pertumbuhan
kololoniStreptococcal pada sel-sel darah merah.

Distribusi koloni-koloni lebih baik juga diperoleh dalam cawan penaburan yang dibuat dengan
baik, dan isolasi akan lebih mudah dibuat. Supaya koloni tumbuh dalam cawan tidak terlalu
banyak ataupun sedikit maka contoh diencerkan hingga beberapa kali pengenceran dan ditaburkan
pada beberapa cawan. (Nuniek, 2001)
Karakteristik koloni bakteri hasil inokulasi merupakan salah satu bagian dalam identifikasi
bakteri. Beberapa bentuk koloni spesifik koloni bakteri pada media agar datar yaitu (Sutedjo,
1996) :
Ukuran

Titik

Kecil

Sedang

Besar
Warna Koloni
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri
tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan
tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti.

Bentuk Koloni
Bundar
Tidak beraturan
Rhizoid (tersebar seperti akar)

Bentuk Bagian Tepi Koloni (margin)


Rata (entire)
Tidak rata, bergelombang secara beraturan (lobate)
Bergelombang (undulate)
Bergerigi (sellate)
Seperti filamen (filamentous)

Media Spesifik(selective medium) /media penghambat adalah media yang ditambah zat kimia
tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain sehingga dapat
mengisolasi mikroba tertentu, misalnya media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu,
dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi bakteri gram negatif.
Media ini selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut
dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang
diinginkan. Contohnya adalah Luria bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk
merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline Salt
Broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuhStreptococcus agalactiae yang toleran terhadap
garam.
Media ini dipakai untuk menyeleksi mikrorganisme sesuai dengan yang diinginkan, jadi hanya
satu jenis mikrorganisme saja yang dapat tumbuh dalam media ini atau hanya satu kelompok
tertentu saja.

Hal hal yang perlu diperhatikan dalam membuat media adalah :


a)
Mencuci tangan sebelum praktikum
b)
Menggunakan jas lab dan sarung tangan yang steril
c)
Sebelum dan sesudah praktikum meja kerja dan tangan disemprotkan alkohol 70%.
d) Menggunakan alat dan bahan yang sudah disterilkan
e)
Tidak banyak bercanda dan berbicara saat praktikum berlangsung.
f)
Menggunakan masker
Pada percobaan 3 Isolasi, Identifikasi dan Konfirmasi Mikroba menggunakan beberapa
media, diantaranya adalah sebagai berikut ;
Mac Conkey Agar
Media selektif untuk isolasi dan identifikasi bakteri Gram negatif terutama bakteri yang berasal
dari tinja dan urin. Disimpan pada suhu +15C hingga +25C, pH 6.9 - 7.4 dan termasuk media
padat. Media ini mengandung garam empedu dan pewarna kristal violet, yang menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif dan menseleksi bakteri gram negatif. Media ini juga berisi
karbohidrat laktosa, yang memungkinkan pembedaan bakteri gram negatif berdasarkan pada
kemampuan mereka untuk memfermentasi laktosa.Organisme yang memfermentasi laktosa
menghasilkan produk akhir asam yang bereaksi dengan indikator pH merah netral dan
menghasilkan warna merah muda.
Vogel Jonson Agar
Vogel Johnson Agar mengandung mannitol, tellurite dan lithium chloride yang berperan untuk
mengisolasi bakteri yang bersifat koagulase positip, karena semua yang bersifat koagulase positip
akan tumbuh pada media ini. S. aureus mempunyai koloni hitam sebagai akibat pengendapan hasil
reduksi tellurite. Media di sekitar koloni akan berubah menjadi kuning akibat fermentasi
mannitol. Adanya lithium chloride: sangat bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri
laintermasuk E. coli. Namun demikian media ini kurang mampu memilah S. aureus karena semua
koagulase positip dapat tumbuh termasuk S. epidermidis dan Proteus.
Cetrimide Agar
Cetrimide Agar biasanya digunakan untuk isolasi Pseudomonas. Kandungan cetrimide yang
merupakan quarternary ammonium merupakan senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri lan, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur didalam sel, namun tidak terjadi
pada Pseudomonas.
Pada media cetrimide konvensional beberapa bakteri dapat tumbuh seperti Klebsiella,
proteus dan Providencia.Untuk menghambat pertumbuhan mereka dapat ditambahkan cetrimide.
Pada media ini, P. aeruginosa dapat dibantu dengan menggunakan media Pseudomonas Selective
Medium yang mengandung Nalidixi acid untuk menghambat pertumbunan bakteri lain.
Triple Sugar Iron Agar
Media ini berfungsi untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasikan karbohidrat
berdasarkan panjang rantai karbon. TSI terdiri dari laktosa 1 %, sukrosa 1%, dan glukosa 0,1 %,

kemampuan bakteri dalam menghasilkan H2S dengan adanya presipitat kehitaman pada media
dan kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas dengan indikasi media terangkat atau pecah.
Media yang digunakan adalah TSIA (Triple Sugar Iron Agar).Terutama digunakan untuk
identifikasi bakteri gram negative.Media ini mengandung 3 macam gula yaitu glukosa, laktosa dan
sukrosa, indicator merah fenol dan FeSO4 untuk memperlhatkan pembentukan H2S
yangditunjukan dengan adanya endapan hitam. Konentrasi glukosa adalah 0,1 dari konsentrasi
laktosa aatau sukrosa agar fermentasi glukosa dapatterlihatreaksi dilihat setelah 24-4 8 jam.
penentuan mic
pembahasan
Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
antibiotik kloramphenicol terhadap bakteri gram positif maupun gram negatif, dengan
menggunakan metoda MIC cair dan menentukan kerentanan suatu bakteri terhadap antibiotik
kloramphenicol melalui tes resistensi dengan metode cakram kertas (Paper Disc Plate).
Sebelum melakukan praktikum ini, semua peralatan yang akan digunakan harus
disterilisasikan terlebih dahulu untuk memastikan peralatan benar-benar bersih dan mencegah
terjadinya kontaminasi yang diakibatkan oleh penggunaan sebelumnya yang dapat mempengaruhi
pengamatan pada praktikum ini.
Kloramphenicol merupakan antibiotik spektrum luas yang dapat membunuh bakteri gram positif
maupun gram negatif. Kemudian untuk menentukan MIC dari antibiotik kloramphenicol
digunakan media cair yakni Nutrient Broth. Nutrient broth dibuat dengan variasi single strength
dan double strenght kemudian setelah itu ke dalam media dimasukkan bakteri staphylococcus
aureus yang merupakan bakteri gram positif. Ke dalam masing-masing variasi nutrient broth
tersebut di masukkan kloramfenicol yang berasal dari konsentrasi 2000 ppm kemudian diencerkan
menjadi 1000 ppm,500 ppm, dan 200 ppm. Setelah itu, diinkubasikan pada suhu 37C selama 1824jam. Pada prinsipnya praktikum ini melihat pengaruh faktor pengenceran dari antibiotika yang
dapat menghambat bakteri staphylococcus aureus dalam media nutrient broth yang merupakan
nutrisi untuk pertumbuhannya. Dengan begitu kita dapat mengetahui MIC dari kloramphenicol.
MIC adalah konsentrasi antibiotik terendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat. MIC biasanya
dapat dilihat pada tabung reaksi bening terakhir dan tabung reaksi sebelum keruh pertama.
Berdasarkan data pengamatan, MIC ditunjukkan saat konsentrasi 1000 ppm pada media nutrient
broth yang single strength dan kita dapat lihat juga semakin encer konsentrasi kloramfenicol yang
digunakan dia akan semakin keruh karena antibiotik pada konsentrasi yang encer (lebih kecil)
tidak mampu untuk meghambat pertumbuhan bakterinya trutama pada media nutrient broth yang
double strenght, semuanya menunjukkan cairan yang keruh. Hal ni terjadi karena nutrisi yang
diberikan untuk bakteri tersebut konsentrasinya double atau lebih banyak sehingga dapat
memperkuat daya tahn bakteri terhadap kloramphenicolnya. Dengan kata lain semakin besar
konsentrasi antibiotik yang digunakan maKa ia akan menghmabat pertumbuhan bakteri dalm hal
ini memnujukkan cairan berwarna bening dan apabila konsentrasi nutrient broth yang semakin
besar maka akan memperkuat daya tahan bakteri terhadap antibiotik yang diberikan.
Dalam penentuan kerentanan suatu bakteri terhadap antibiotik kloramphenicol melalui tes
resistensi dengan metode cakram kertas (Paper Disc Plate) digunakn media padat yakni nutrient

agar (NA). pertama-tama disiapkan 20 mL NA kemudian dituangkan ke dalam cawan petri.


Kerjanya harus dilakukan secara aseptis (ataau di dalam laminar air flow) agar dapar menghindari
kontaminasi dari mikroba lain yang mampu merusak hasil percobaan tersebut. Lalu ditunggu
hingga NA mengering dan suhunya kira-kira hangat kuku karena jika suhu terlalu
panas Staphylococcus aureus akan mati. Setelah NA memadat, suspensi Staphylococcus
aureus digoreskan atas permukaan NA kemudian diratakan dan ditempelkan cakram antibiotika
lalu diinkubasikan di dalam inkubator suhu 37C selama 18-24 jam. Cakram antibotika
klorampenicol diletakkan pada media nutrient agar dengan jarak sedimikian rupa. Hal ini
bertujuan agar zona yang dibentuk oleh Staphylococcus aureus dapat teramati dengan jelas karena
bakteri itu bisa tumbuh secara optimal.
Selain itu jarak peletakan cakram antibiotik tersebut bertujuan agar tidak terjadi penumpukan zona
inhibisi. Untuk mengetahui pengaruh konsentrasi antibiotika kloramphenicol, dibuat pengenceran
dari antibiotika tersebut sehingga dengan begitu kita dapat menbandingkan zona inhibisi yang
terbentuk . Dan sebagai controller kita gunakan kontrol negatif yang berisi nutrient agar dan
kloramphenicol. Zona inhibisi diukur menggunakan jangka sorong dan pada pengamtan hasilnya
negatif smua karena adany kesalahan dalam prosedur plaksanaan praktikum, seharusnya nutrient
agar dicampur dengan bakteri tetapi dalam praktikum kmarin nutrient agar dicampur dengan
antibiotik kloramphenicol dalam berbagai variassi konsentrasi (1000 ppm, 500 ppm dan 200 ppm)
dan pada cakram kertas adalah bakterinya. Tntu saja hasilnya negaif karena bakteri tidak mampu
tumbuh dalam media yang sudah dicampur dengan antibiotik tersebbut (sudah terhambat duluan).

penetapan potensi bakteri


teori dasar
Antibiotika atau animikroba adalah zat-zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba terutama golongan
fungi (jamur), yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Suatu obat antibiotika
yang ideal menunjukan toksisitas yang selektif. Istilah ini berarti bahwa obat tersebut haruslah
bersifat toksis untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksis (dalam konsentrasi yang dapat ditoleransi)
terhadap hospes (setiabudi, 1995)
Potensi adalah perbandingan dosis sediaan uji dengan dosis larutan standar atau larutan
pembanding yang menghasilkan derajat hambatan pertumbuhan yang sama pada biakan jasad
renik yang peka dan sesuai (Farmakope Indonesia). Aktivitas (potensi) antibiotik dapat
ditunjukkan pada kondisi yang sesuai dengan efek daya hambatannya pada mikroba. Suatu
penurunan aktivitas antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat
ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologi biasanya
merupakan suatu standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas.
Potensi Antibiotika adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau membunuh
pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg atau ug/mg. Penetapan potensi antibiotika secara
mikrobiologi merupakan metode penetapan hayati, sebagai jasad renik digunakan mikroorganisme
dan sebagai pembanding digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurnian dan
kekuatan/potensinya (akmal djamaan, 2012)
Potensi antibiotika standar berkisar antara 95-105%. Namun potensi tersebut dapat menurun

karena kadaluwarsa, penyimpanan yang tidak benar dan terjadinya penguraian obat yang
menghasilkan zat lain yang tidak memiliki efek lagi. (Farmakope Indonesia)
Aktivitas suatu antibiotika dapat dilihat pada dua kriteria yaitu MIC dan besar diameter hambatan.
Makin rendah MIC makin kuat potensialnya, demikian pula semakin besar diameter hambatan,
makin kuat pula potensialnya. Namun pada umumnya, antibiotik yang mepunyai potensi tinggi
memilki MIC yang rendah dan diameter yang besar. (Modul praktikum mikrobiologi
STFI,2013/2014)
Ada dua metode umum pengujian potensi antibiotika yang dapat digunakan :
Metode penetapan dengan lempeng silinder atau cara difusi agar
Metoda ini berdasarkan difusi antibiotika dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar
padat dalam cawan petri atau lempeng, sehingga mikroba yang ditambahkan dihambat
pertumbuhannya pada daerah berupa lingkaran atau zona disekeliling silinder yang berisi larutan
antibiotika.
Metode Turbidimetri atau cara tabung
Metode ini berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan serbasama
antibotika, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat bila tidak terdapat
antibiotika.
(Menurut akmal Djamaan, 2012 )Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi
antibiotika:
1.Mikroba Uji
- Mikroba uji yang digunakan harus berasal dari galur murni
- Dapat memberikan respon yang bertingkat antara peningkatan konsentrasi dengan peningkatan
daerah hambatannya.
- Untuk penetapan dengan cara difusi, daerah hambatan yang terbentuk harus jelas dan mudah
diukur,
- Untuk penetapan cara tabung (turbidimetri) perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu
harus terlihat jelas.

Baku Pembanding Biologi


Sebagai baku pembanding biologi (biological reference) digunakan antibiotika yang telah
diketahui kemurniaan dan potensinya secara pasti.
Baku pembanding ini direkomendasi oleh Badan Kesehatan Dunia (WHO) dan di Indonesia
melalui Badan POM RI (SBI, SPI, SBN, SPN, SBL)
Baku ini diberikan dalam bentuk baku sekunder atas permintaan laboratorium-laboratorium
penelitian atau Perguruan Tinggi.
Media Perbenihan
Media perbenihan yang digunakan harus
mendukung pertumbuhan mikroba uji atau dapat
menumbuhkan mikroba uji dengan baik.
Media perbenihan tidak boleh mengandung zat yang bersifat antagonis ataupun mempengaruhi
aktivitas antimikroba dari antibiotika yang diperiksa.
Di pasaran banyak ditemui media perbenihan dengan berbagai merek dengan kode Antibiotic
Medium No. 1, 2, 3 dan sebagainya.
Larutan Dapar

Digunakan untuk melarutkan antibiotika yang akan diperiksa,baik baku pembanding maupun
sampel uji. Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan
yang akan diuji.
Pemilihan terhadap metode
Pemilihan metode mana yang akan dipakai pada penetapan potensi antibiotika, apakah cara difusi
atau cara tabung tergantung pada pengalaman yang dimiliki dan fasilitas laboratorium yang ada.
Akan tetapi untuk zat-zat tertentu pemilihan tidak dapat dilakukan sekehendak hati, karena sifat
bahan yang akan diuji tersebut. Misalnya tirotrisin karena difusinya yang jelek tidak akan
memberikan hasil yang memuaskan bila menggunakan cara difusi,sebaliknya sefaloridin dengan
cara tabung tidak cocok bila sampel mengandung hasil urainya yang menyebabkan sampel tetap
keruh pada berbagai tingkat pengenceran.
Kelebihan dan kekurangan dari kedua metode
1. Cara turbidimetri, biasanya mempunyai range daerah
pengerjaan yang sempit dengan
perbandingan tingkat dosis kurang dari 5 : 1.
Sebaliknya pada cara difusi, range tersebut lebih lebar sehingga dimungkinkan perbandingan
tingkat dosis sampai 100 : 1.
2. Cara turbidimetri, hanya memerlukan waktu inkubasi kurang dari 4 jam, sedangkan cara
difusi memerlukan waktu paling kurang 18-24 jam.
3. Cara turbidimetri adalah mengukur aktivitas total dari antibiotika yang diuji, sedangkan cara
difusi tergantung pada kecepatan difusi zat aktif, sehingga ada kemungkinan tidak mengukur
aktivitas totalnya.
4. Cara turbidimetri tidak dipengaruhi oleh sifat difusibilitas dari zat aktif, sedangkan cara
difusi sangat dipengaruhi oleh hal lain tersebut.
Kloramfenicol adalah antibiotika spektrum luas, efektif melawan sebagian besar bakteri aerob dan
anaerob, kecuali Pseudomonas aeruginosa. (Janet L.Stringer,2008)
Kloramfenicol atau kloramisetin adalah antibiotika yang empunyai spektrum luas, berasal dari
jamur Streptomyces venezuelae, dan sekarang telah dapat dibuat sintetik di laboratorium. Dalam
keadaan murni kloramfenicol berupa kristal jarum atau lemepeng memanjang, warna putih keabuabuan, tida bebau dan rasanya pahit. Kloramfenicol sukar larut dalam air, muah larut dalam
metanol,etanol,etil asetat, dan aseton serta tidak larut dalam benzene. Kloramfenicol dapat
digunakan untuk melawan infeksi yang disebabkan oleh beberapa jenis bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Antibiotika ini memiliki khasiat bakteriostatik terhadap beberapa spesies,
pada keadaan tertentu, kloramfenikol memepunyai khasiat bakterisid. (damin sumardjo,2008)
Pembahasan
Percobaan ini dilakukan untuk menentukan besarnya potensi sampel terhadap antibiotika standar.
Suatu antibiotika memerlukan konsentrasi tertentu agar dapat menjalankan fungsinya yaitu
sebagai bakteriostatik atau bakteriosidik. Potensi yang diberikan menurut farmakope haruslah
95% - 105%, di luar itu berarti antibiotik sampel tidak memenuhi syarat untuk dapat diedarkan di
pasaran.
Pada percobaan kali ini, metode yang digunakan dalam penentuan potensi antibiotika adalah

meode penetapan dengan lempeng silinder,yaitu menggunakan perforator untuk menguji


antibiotika pada medianutrien agar yang berisi inokulum bakteri pada cawan petri. Potensi
dapatditentukan dengan mengukur zona bening yang dihasilkan danmembandingkannya dengan
diameter zona bening dari antibiotika standar.
Syarat penggunaan biakan bakteri yang dipakai adalah harus biakan murni (pure straired ).
Maksud dari biakan murni adalah bakteriyang diambil dari alam secara langsung kemudian
dibiakkan, bukan dari bakteri yang diisolasi dari laboratorium klinis (sampel darah, feses, urin,dan
sebagainya). Pada percobaan ini antibiotik yang digunakan adalah kloramfenicol dan suspensi
bakterinya adalah E Coli karena menurut farmakope dan literatur yang ada antibiotika
kloramfenicol dapat menghambat pertumbuhan bakteri E Coli.
Sebelum memulai praktikum, dilakukan perencanaan pengenceran dan perhitungan konsentrasi.
Hal ini dilakukan untuk mempermudah penentuan nilai dosis tertinggi dan dosis terendah yang
ingin digunakan pada antibiotika ini, yaitu kloramfenikol . Konsentrasi kloramfenicol pada
awalnya adalah 2500g/ml pada larutan baku. Untuk larutan sampel dianggap konsentrasinya
sama dengan konsentrasi baku. Dari perencanaan perhitungan konsentrasi, telah ditentukan
konsentrasi pada dosis tinggia adalah 2500g/ml, untuk mendapatkannya, dicampurkan
kloramfenicol 250mg lalu di tambahkan air suling steril hingga 100 ml, inilah dosis tingginya.
Pada dosis menengah, konsentrasinya adalah 500g/ml,dengan cara mencampurkan 2ml
kloramfenicol 2500g/ml dengan 10ml air suling steril. Untuk dosis rendah yaitu 250g/ml,
dengan cara mencampurkan .1ml antibiotic kloramfenicol 2500 g/ml dengan .10 ml aquadest
steril. Konsentrasi untuk larutan baku dan larutan sampel dianggap sama.Setelah dilakukan
pengenceran pada tabung, dilakukan pembagian pada permukaan dasar cawan petri menjadi 4 area
sama besar. Setiap area ini diberi label daerah untuk larutan baku tinggi, baku rendah maupun
larutan sampel tinggi maupun sampel rendah untuk mempermudah dalam pengamatan. Untuk
zona baku tinggi dan sampel tinggi diletakkan berseberangan karena jika dua dosis yang samasama tinggi diletakkan berdampingan, akan menyulitkan mengukur zona inhibisi
karenadikhawatirkan zonanya saling tumpang tindih.
Pada penggunaan cawan petri, jangan dibiarkan dalam kondisi terbuka, agar isi cawan
tidak terkontaminasi oleh udara luar.Semua tahap pengerjaan prosedur harus dilakukan secara
aseptis,hal ini dilakukan untuk menghindari kontaminasi yang terjadi oleh mikroba lain yang
dapat merusak percobaan. Kemudian siapkan perfortor yang steril, yaitu dengan cara
membakarnya di atas nyala ap\i. Cetakan yang dibuat dengan perforator digunakan untuk
menampung antibiotika. Namun saat memanaskan perforator dan spatel haruslah didiamkan
terlebih dahulu hingga tidak terlalu panas, tetapi tetap di dekat pembakar spiritus, agar bakteri dari
udara tidak mengkontaminasi media agar yang berisi bakteri. Suhu yang panas dapat meleburkan
nutrien agar saatmelubanginya dan jika terlalu jauh dari api, ditakutkan akanterkontaminasi oleh
bakteri. Proses pembuatan lubang harus dilakukan dengan cepat, jangan biarkan cawan petri
terbuka terlalu lama untuk menghindari bakteri dari luar masuk ke dalam cawan. Setelah keenam
daerah yang dibagi tadi telah dilubangi, maka dimasukkanlah larutan antibiotika dengan dosis
tinggi dan rendah dari larutan baku maupunlarutan sampel. Pengisian antibiotika ke lubang yang
telah dibuatdilakukan dengan menggunakan mikro pipet 100 l (masingmasing lubang diisi
dengan 100 l antibiotika). Pengisian antibiotika ke lubang yang telah dibuat harus dilakukandi
dekat api, agar tetap aseptis. Pada saat meneteskan antibiotika harustepat di lubang, dan lubang
yang dibentuk harus bulat agar antibiotik berdifusi sempurna dan zona yang dihasilkan juga bulat

(diameter yangdihitung mudah). Mikropipet yang digunakan haruslah bersih, setelahdigunakan


harus dicuci dengan desinfektan. Saat penggunaan, harus benar- benar kering, jika desinfektan
masih di dalam mikropipet maka akanmempengaruhi konsentrasi antibiotika (desinfektan juga
bersifat bakteriosida).Setelah semua lubang terisi, cawan petri harus dibungkus dengan koran
kemudian diinkubasikan pada suhu 370C selama 18-24 jam supaya bakteri dapat tumbuh secara
optimal. Pada saat inkubasi, cawan petri tidak boleh dibalik karena antibiotika yang ada di
dalamnya bisa tumpah sehingga tidak terdifusi sempurna pada daerah sekitarnya. Percobaan ini
dibuat duplo (dua kali) dengan perlakuan yang sama.