ACARA II

PENGUKURAN KONSENTRASI PROTEIN

1. TUJUAN PERCOBAAN
Untuk mengetahui konsentrasi total protein terlarut suatu sampel dengan Metode Bradford.
2. PENDAHULUAN
2.1 Dasar Teori
Protein berasal dari kata protos dari bahasa Yunani yang berarti yang paling
utama adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggu yang merupakan
polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan
ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogrn, oksigen, nitrogen,
oksigen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur
fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.
Pada umumnya sumber protein dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu kelompok potein
hewani dan nabati.
a. Protein hewani
Yang termasuk protein hewani ialah protein yang terdapat dalam hasil ternak, yaitu
daging mamalia, daging unas, telur, susu, dan ikan atau binatang laut. Daging ternak
dewasa, tanpa lemak biasanya mengandung kadar protein 18-20 % dari berat.basah.
b. Protein Nabati
Sayur-sayuran bukan merupakan sumber protein yang baik. Berdasarkan berat basah,
kandungan proteinnya memang rendah.
Protein biji-bijian yang berasal dari beras, jagung dan sorgum stelagh mengalami
pengeringan yang cukup ( 12 %) dapat meliputi 6 sampai 15%. Protein biji-bijian terdapat di
berbagai bagian kulit biji. Di endosperm, protein terdapat dalam bagian yang disebut sub
selulosa granular atau pada bagaian yang disebut badan protein.
Hewan yang makan tumbuhan mengubah protein nabati menjadi protein hewani.
Tumbuhan membentuk protein dari COHO dan senyawa nitrogen. Di samping digunakan
untuk pembentukan sel-sel, protein juga dapat digunakan sebagai energy apabila tubuh kita
kekurangan karbohidrat dan lemak. Komposisi rata-rata unsure kimia yang terdapat dala
protein ialah sebagai berikut: karbon 50%, hydrogen 7%, oksigen 23%, hydrogen 16%,
belerang 0-3%, dan fosfor 0-3%. Dengan berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16%, dapat
dilakukan penentuan kandungann protein dalam suatu bahan makanan.

Molekul monomer dari protein yang mengandung molekul nitrogen yang dikenal
sebagai asam amino. Hanya 20 macam asam amino yang ditemui dalam protein tetapi karena
molekul protein besar dan komplek sering mengandung beberapa ratus asam amino. Sebagai
contoh sel tunggal dari bakteri E. Coli dapat mengandung 600 sampai 800 macam protein
yang berbeda dan pada sel tanaman dan hewan kemungkinan mempunyai beberapa kali
jumlah protein. Pada tanaman konsentrasi tertinggi didapati dalam biji sebesar 40% dari berat
keringnya. Protein dalam bii akan digunakan sebagai energi dalam perkecambahan biji.
Protein larut dalam air, tetapi juga terdapat protein yang terikat pada membran
lipoprotein sehingga yang akan dihitung konsentrasi protein yaitu total protein terlarut, karena
sebagai pelarut atau buffernya adalah air.
Pengujian Bradford adalah sangat cepat dan untuk menentukan konsentrasi protein
dalam sampel. Metode ini telah direkomendasikan untuk penggunaan secara umum,
khususnya dalam penentuan kandungan protein dari fraksi gel atau gel electrophoresis.
Metode ini merupakan prosedur standar dengan sensitivitas antara 20 sampai 200 g protein.
Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara
kalorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna coomassie Brilliant
Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga
memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kalorimetri
dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert-Beer) pada
panjang gelombang 465-595 nm (cahaya tampak). Metode ini sangat cepat dan efisien.
Pengikatan protein dengan warna terjadi setelah kira-kira 2 menit dan stabilitas warna selama
1 jam. Tidak terdapat atau hanya sedikit gangguan dari kation seperti potasium atau
karbohidrat seperti sukrosa.
CBB merupakan pewarna yang sering digunakan untuk mengukur kadar protein dengan
spektrofotometer.. pewarna CBB ini sering digunakan karena karakteristiknya, yaitu dapat
berikatan pada ikatan peptida pada protein. Senyawa ini umum digunakan untuk pewarnaan
protein (reagen pada metode Bradford). CBB memiliki nilai absorbansi maksimum pada
panjang gelombang 595 nm ketika berikatan dengan protein. Sementara itu, nilai absorbansi
maksimumnya bila tidak berikatan dengan protein pada larutan buffer sitrat dengan pH 3
adalah panjang gelombang 555 nm.
2.2 Rumusan Masalah
2.2.1 Metode apa yang digunakan dalam percobaan pengukuran konsentrasi
protein?
2.2.2 Bagaimana cara membuat larutan sampel, standar, dan blangko?
2.2.3 Bagaimana cara pengukuran konsentrasi protein?
2.2.4 Berapa nilai regresi yang diperoleh?

3. BAHAN DAN METODE

3.1 Alat dan Bahan
Alat
Tabung Reaksi
Spektrofotometer UV-Vis
Mikropipet
Vortex
Kuvet
Bahan
Aquadest
BSA
Reagen Bradford
Sampel biji jagung
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Pembuatan larutan standar
Buat larutan sampel dengan konsentrasi 0,08 M, 0,2M, 0,4M, 0,8M,
Masukkan volume tertentu BSA ke dalam tabung reaksi(sesuai dengan tabel),
tambahkan volume tertentu aquadest(sesuai dengan tabel)

Tambahkan ad 950 l dengan reagen Bradford

Vorteks larutan dalam tabung reaksi ad homogen,diamkan 10 menit

lakukan analisa spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm
Hitung analisa regresinya
tabung
1
2
3
4
5

3.2.2

Aquadest

l)

50
45
40
30
10

Pengukuran kandungan protein sampel

BSA ( l)

Bradfoard ( l)

0
5
10
20
40

950
950
950
950
950

Masukkan sampel dalam tabung reaksi dengan konsentrasi sebagai berikut :

(I) sampel 25 l + aquadest 25 l + BSA 950 l lalu vorteks. (II) sampel 50 l
+ BSA 950 l lalu divorteks.

Lakukan analisa spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 595nm

Hitung kandungan protein sampel dengan grafik standar BSA dengan
perhitungan kurva regresi linier
4 HASIL PERCOBAAN
4.2 Hasil Percobaan
Setelah dilakukan analisa spektrofotometer didapatkan hasil sebagai berikut
Tabel 1. Pengukuran Absorbansi larutan Standart BSA
NO

BSA ( L )

1
2
3
4

(Y)
2
5
10
20

ABSORBANSI

KONSENTRASI

(X)
200 ppm
400 ppm
600 ppm
800 ppm

0,08
0,2
0,4
0,8

dari data diatas, diperoleh nilai a = -3,07 ; b= 18.87 ; r = 0,95

Tablel 2. Hasil Pengukuran Sampel

Kelompok
2
3
4
5

Rep 1
0,829
0,807
0,904
0,882

25 l
Rep 2
0,822
0,780
0,932
0,898

Rep 3
0,835
0,745
0,893
0,833

Rep 1
0,932
0,813
1,066
1,063

50 l
Rep 2
0,960
0,820
1,024
1,000

Rep 3
0,787
1,028
1,031

4.3 Analisis Hasil Percobaan

y = bx + a, dimana y adalah konsentrasi dan x adalah absorbansi
untuk sampel kelompok 2
-

25l

Replikasi I
y = 18,87 . 0,829 3,07
y = 12,57322

Replikasi II

Replikasi III

y = 18,87 . 0,822 3,07 y = 18,87 . 0,835 3,07

y = 12,44114

y = 12,68645

y rata-rata
= 12,5669

50l

replikasi I

Replikasi II

y = 18,87 . 0,932 3,07 y = 18,87 . 0,960 3,07

y = 14,51684

y rata-rata
-

y = 15,0452

=
14,78102

untuk sampel kelompok 3

-

25l

Replikasi I

Replikasi II

Replikasi III

y = 18,87 . 0,807 3,07

y = 18,87 . 0,780 3,07

y = 18,87 . 0,745 3,07 =

y = 12,15809

y = 11,6486

y = 10,98825

y rata-rata
11,59828

50l

Replikasi I

Replikasi II

Replikasi III

y = 18,87 . 0,813 3,07

y = 18,87 . 0,820 3,07

y = 18,87 . 0,787 3,07 =

y = 12,27131

y = 12,4034

y = 11,78069

y rata-rata
12,1521

untuk sampel kelompok 4

-

25l

Replikasi I

Replikasi II

y = 18,87 . 0,904 y = 18,87 . 0,932 3,07

3,07
y = 13,98848

y = 14,51684

Replikasi III

y rata-rata

y = 18,87 . 0,893 3,07

y = 13,78091

14,09541

50l

Replikasi I

Replikasi II

Replikasi III

y = 18,87 . 1,066

y = 18,87 . 1,024 3,07

y = 18,87 . 1,028 3,07 =

3,07

y = 16,25288

y = 16,32836

y rata-rata
16,54222

y = 17,04542

untuk sampel kelompok 5

-

25l

Replikasi I

Replikasi II

y = 18,87 . 0,882 y = 18,87 . 0,898 3,07

3,07

Replikasi III

y rata-rata

y = 18,87 . 0,833 3,07 =

y = 13,87526

y = 12,64871

13,36577

Replikasi I

Replikasi II

Replikasi III

y rata-rata

y = 18,87 . 1,063 3,07

y = 18,87 . 1,000 3,07

y = 18,87 . 1,031 3,07 =

y = 13,57334
-

50l

y = 16,98881

y = 15,8000

y = 16,38497

16,39126

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
konsentrasi BSA (M)

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0,180 0,502 0,833 1,096
absorbansi 595 nm

5 PEMBAHASAN

Grafik Kurva Standard

untuk BSA

Pada praktikum ini, kami akan membahas mengenai pengukuran konsentrasi protein dengan
metode Bradfoard.

Pengukuran konsentrasi protein menurut metode Bradfoard adalah

pengukuran protein berdasarkan pada penggunaan Coomassie Briliant Blue (CBB G-260).
Senyawa pewarna ini akan berikatan dengan protein terutama pada residu asam amino
arginin, triptofan, tirosin, histidin dan fenil alanin. Namun perlu diketahui bahwa residu asam
amino arginin yang menentukan ikatan antara CBB G-250 dengan protein. Senyawa ini
dalam keadaan bebas berada dalam bentuk kation yang mempunyai absorbansi maksimum
pada 595 nm membentuk warna biru.
Pada praktikum kali ini disiapkan larutan standar sebagai kurva distribusi sampel dan
preparasi sampel. Larutan standar dibuat dengan berbagai konsentrasi perbandingan antara
BSA, Aquadest, dan Bradford sehingga dicapai konsentrasi 0,08 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,8M.
Untuk mengetahui konsentrasi total protein terlarut, kami menggunakan sampel biji jagung .
Prosedur Pertama yang kami lakukan adalah memipet 25 l (sampel I) dan 50 l (sampel II)
biji jagung yang kemudian ditambah dengan aquadest dan BSA. Lalu divorteks dan kemudian
didiamkan selama 10 menit. Hasil inilah yang kemudian diukur dengan spektrofotometer
untuk mengetahui berapa konsentrasi proteinnya.
Prosedur pengukuran yaitu dilakukan analisis dengan spektrofotometer UV-Vis pada
standart untuk mengetahui sebaran distibusi dari standar sehingga bisa dibuat kurva
distribusinya absorbansinya dan dapat diitung regresi liniernya. Sampel juga dianalisis
dengan spektrofotometer UV-Vis dan dapat diketahui absorbansinya.
Dari hasil pengukuran dengan spektrofotometer didapatkan absorbansi standar dengan
diperoleh nilai a = -3,07 ; b= 18.87 ; r = 0,95. Kemudian pada pengukuran sampel I(25
l),didapat nilai konsentrasi terkecil pada kelompok 3 yaitu 11,59828. Hasil ini tergolong
sangat sedikit jika dibandingkan dengan pengukuran konsentrasi protein pada kelompok lain
padahal sampel yang digunakan setiap kelompok sama yaitu biji jagung . Pada kelompok 2,4,
dan 5 masing-masing didapatkan hasil konsentrasi protein sebesar 12,5669 ; 14,09541 dan
13,36577. Selanjutnya, pada pengukuran sampel II (50 l),didapat nilai konsentrasi terkecil
pada kelompok 3 yaitu 12,1521. Namun pada kelompok 2,4, dan 5 masing-masing didapatkan
hasil konsentrasi protein sebesar 14,78102 ; 16,54222 dan 16,39126.
Adanya perbedaan antara hasil konsentrasi sampel tiap kelompok dapat dipengaruhi
oleh beberapa faktor antara lain :
1. Kesalahan dapat terjadi pada saat preparasi sample, baik ketidaktepatan dalam
mengambil sample.

2.

Adanya kontaminan senyawa-senyawa penganggu yang muncul karena peralatan

yang digunakan untuk preparasi sample kurang bersih atau kurang higienis.

3.
6

Pengukuran spectrometer kurang tepat.

KESIMPULAN
1. Menggunakan metode Bradford, yaitu suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total
dalam suatu larutan.
2. Larutan standar dibuat dengan berbagai konsentrasi perbandingan antara BSA, Aquadest,
dan Bradford sehingga dicapai konsentrasi 0,08 M, 0,2 M , 0,4 M , 0,8 M.
Larutan sampel dibuat dengan sampel biji jagung 25 l / 50l + aquadest 25l / - + BSA
950 l,kemudian divorteks,diamkan 10 menit lalu di spektro pada 595 nm.
3. Prosedur pengukuran yaitu dilakukan analisis dengan spektrofotometer UV-Vis pada
standart untuk mengetahui sebaran distribusi dari standar sehingga bisa dibuat kurva
distribusinya absorbansinya dan dapat diitung regresi liniernya.
4. Dari hasil pengukuran dengan spektrofotometer didapatkan absorbansi standar dengan
diperoleh nilai a = -3,07 ; b= 18.87 ; r = 0,95.
5. Pada pengamatan konsentrasi protein terdapat beberapa perbedaan pada sampel antar
kelompok, perbedaan itu dapat terjadi oleh beberapa faktor diantaranya : Ketidaktepatan
pengambilan sampel, adanya kontaminan, serta pengukuran dangan spektrofotometer
kurang tepat.

DAFTAR PUSTAKA
Bradford MM.1976.A Rapid And Sensitive Method For The Quantitation Of
Microorganism Quantities Of Protein In Utilizing The Principle Of Prtotein
Dye-Binding.Anal.Biochem 72:248-254
Day, Jr, R. A., Underwood, A. L. 1989. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.