Bahan.

Embrio Ginjal Manusia (HEK293) sel secara stabil menyatakan populasi

homogen manusia 1A-, 1B-, dan 1D-AR yang diperoleh dari Dr Kenneth Minneman (Emory
University, Atlanta, GA) subtype Manusia 2A-,2B-, dan 2C-AR stabil dinyatakan dalam sel CHO
diperoleh dari Drs. Marc Caron, Robert Lefkowitz (Duke University, Durham, NC), andStephen
Liggett (University of Cincinnati, Cincinnati, OH). Alkaloid efedrin digunakan dalam penelitian
ini diberikan oleh Dr. Popat N. Patil (The Ohio State University, Columbus, OH), atau dibeli dari
Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Senyawa yang larut dalam air atau dalam 1: 5 campuran dimetil
sulfoksida dan air. Larutan stok dari 10 mM masih baru disiapkan setiap hari dan diencerkan
dalam air konsentrasi yang tepat untuk studi. [3H] Rauwolscine dan [3H] prazosin diperoleh dari
PerkinElmer Hidup dan Ilmu Analytical (Wellesley, MA). The phorbol ester (12-Otetradecanoylphorbol- 13-asetat) gen -response elemen-luciferase (TRELUC) dan cAMP-respon
elemen-luciferase gen reporter (6 CRELUC) yang baik yang disediakan oleh Dr A. Himmler
(Boehringer Ingelheim Penelitian dan Pengembangan, Wina, Austria). Semua reagen kultur sel
diperoleh dari Life Technologies (Carlsbad, CA). Bahan kimia lainnya yang dibeli dari SigmaAldrich.
Kultur cell.Embrio Ginjal Manusia (HEK293) sel secara stabil menyatakan populasi
homogen manusia 1A-, 1B-, 1D-AR ditumbuhkan dalam 150 cm2 termos budaya Corning
(Acton, MA) dengan modifikasi media Eagle Dulbecco ini dilengkapi dengan 10% serum janin
sapi, 2 mM glutamin, penisilin G (100 U / ml), streptomisin (100? g / ml), dan G418 (geneticin,
100? g / ml). Setelah pertemuan, sel-sel terpisah oleh gesekan lembut. Sel CHO secara stabil
mengekspresikan 2A-, 2B-, 2C--AR ditanam di 150 cm2 Corning termos kultur dengan media
F12 Ham ditambah dengan 10% janin bovine serum, 2 mM glutamin, penisilin G (100 U / ml),
streptomycin (100? G / ml), dan G418 (100? G / ml). Semua sel dikultur pada 37 C dalam
Suasana 5% CO2 dan 95% kelembaban. Media berubah setiap 48 jam sampai sel yang konfluen.
Setelah pertemuan, sel-sel yang terpisah oleh trypsinization (0,25% tripsin EDTA) selama 2
menit.
Kompetitif radioligand Binding Tes. radioligand mengikat tes dilakukan pada secara
utuh HEK293 sel secara stabil mengekspresikan 1A-, 1B-, 1D-AR subtipe dan sel CHO secara
utuh stabil mengekspresikan 2A-, 2B-, 2CAR subtipe seperti yang dijelaskan oleh Lalchandani
et al. (2002). Sel-sel yang terpisah dicuci dan disentrifugasi dengan Tris- EDTA penyangga, pH
7,4, yang mengandung 50 mM Tris, 20 mM dinatrium EDTA, dan 154 mM NaCl, di mana
mereka akhirnya tersuspensi. Radioligand itu digunakan pada konsentrasi tetap 0,1 Ci dalam
ketiadaan dan kehadiran berbagai konsentrasi (kisaran itu 10-10-10-3 M atau 10-11-10-4 M) obat
bersaing. Obat-obatan yang ditambahkan ke dalam sel (50.000) di 50 mM Tris-EDTA penyangga
untuk total volume 2,0 ml dan dibiarkan inkubasi pada 37 C selama 1 jam. Nonspecificbinding
ditentukan dengan adanya 10 M phentolamine. Reaksi dihentikan dengan penyaringan yang
cepat melalui Whatman GF / C filter menggunakan pemanen sel Brandel 12R dilanjutkan dengan
pencucian dengan penyangga dingin dua kali. Radioaktivitas pada cakram penyaring kering
diukur dengan menggunakan kilau analyzer cair (Tri-carb 2900TR; PerkinElmer Hidup dan Ilmu

Analytical). Kurva pergeseran diplotkan dan nilai-nilai Ki dari ligan tes untuk subtipe reseptor
yang ditentukan dengan menggunakan GraphPad Prism (GraphPad Software Inc, San Diego,
CA). Binding persentase tertentu ditentukan dengan membagi selisih antara total terikat
(disintegrasi per menit) dan tidak spesifik terikat (disintegrasi per menit) dengan jumlah terikat
(disintegrasi per menit).
Tes fungsional. Sebuah uji gen reporter sensitif baru-baru dikembangkan (Lalchandani et
al., 2002) digunakan untuk menjelaskan efek dari alkaloid efedrin pada manusia Subtipe 2-AR.
Dalam Studi 1-AR, plasmid TRE-LUC disediakan oleh Dr. A. Himmler (Stratowa et al., 1995)
digunakan untuk mempelajari efek fungsional alkaloid efedrin. Sel HEK293 stabil
mengekspresikan 1A-AR transfected dengan plasmid TRE-LUC (40 G / ml) menggunakan
elektroporasi (70 ms, pulsa tunggal, 150 V). Sel transfected diunggulkan dengan kepadatan
50.000 sel / baik di piring mikro (Cultureplate; PerkinElmer Hidup dan Analytical Sciences) di
200 L media dan dibiarkan tumbuh selama 24 jam dengan inkubasi pada 37 C (5% CO2).
Setelah 24 jam, sel-sel yang diterapi dengan berbagai konsentrasi obat untuk jangka waktu 20
jam, yang ditemukan menjadi optimal selama waktu analisis dilakukan sebelumnya (data tidak
disajikan). Ketika studi antagonis dilakukan, senyawa yang ditambahkan 15 menit sebelum
penambahan agonis, L-fenilefrin. Setelah paparan obat, sel-sel lisis, dan aktivitas luciferase
diukur menggunakan Luclite assay kit (PerkinElmer Hidup dan Ilmu Analytical).
Dalam studi 2-AR, sel berbasis CRE-LUC dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya
oleh Lalchandani et al. (2002). Sel-sel CHO secara stabil mengekspresikan 2A- dan 2C-ARS
transfected dengan plasmid 6 CRE-LUC (40 G / ml) menggunakan elektroporasi (70 ms, pulsa
tunggal, 150 V). Sel transfected unggulan dengan kepadatan 50.000 sel / baik di piring mikro
(Cultureplate; PerkinElmer Hidup dan Ilmu Analytical) di 200 l media dan dibiarkan tumbuh
selama 24 jam dengan inkubasi pada 37 C (5% CO2). Setelah 24 jam, sel-sel diperlakukan
dengan berbagai obat konsentrasi selama 4 jam. Ketika studi antagonis dilakukan, senyawa yang
ditambahkan 15 menit sebelum penambahan adenilat siklase aktivator forskolin langsung (3
M). Setelah paparan obat, sel-sel lisis, dan aktivitas luciferase diukur menggunakan Luclite
assay kit (PerkinElmer Hidup dan Ilmu Analytical).
Untuk kedua 1A- dan 2A- dan Sel 2C-AR, aktivitas luciferase ditentukan menggunakan
TopCount Microplate Kilau dan Luminescence Counter (Model B9904; PerkinElmer Hidup dan
Ilmu Analytical). Data dinormalisasi relatif perubahan luciferase dari L-fenilefrin (3X10 -4 M
=100%) Dan forskolin (3X10-6 M 100%) Di 1A-and 2A-/ 2C-AR dinyatakan dalam HEK293 dan
sel CHO, masing-masing.
Data Akumulasi dan Analisis. Untuk studi Binding dalam sel garis, berbagai
konsentrasi masing-masing obat yang ditambahkan dalam rangkap dalam setiap percobaan, dan
nilai-nilai IC50 individu ditentukan dengan menggunakan software GraphPad Prism. Ki nilai
setiap ligan ditentukan menurut persamaan dijelaskan oleh Cheng dan Prusoff (1973), dan data
akhir disajikan sebagai pKi S.E.M. n=6 percobaan. Reversal tergantung konsentrasi dari

forskolin-diinduksi (3M) aktivitas luciferase pada sel CHO oleh medetomidine dan analog
efedrin karena digunakan untuk menilai aktivitas agonis, dan data untuk medetomidine
dinyatakan sebagai EC50 nilai S.E.M. n= 6 eksperimen. Kegiatan antagonis dari analog efedrin
ditentukan oleh Selain itu sebelum inkubasi dengan konsentrasi tetap dari 2-AR agonis,
medetomidine (10M). Data dinyatakan sebagai nilai-nilai IC50S.E.M. minimal n=6 percobaan.
Perbedaan antara sarana afinitas mengikat dan respons fungsional obat individu dianalisis
menggunakan uji Paired t. Nilai dianggap signifikan secara statistik ketika P< 0.05.