TUGAS BIOTEKNOLOGI-ISOLASI DNA

1. Urutkan prosedur isolasi DNA plasmid!

Jawab :
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa
DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan
DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda
sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom.
Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana
(vektor) kloning, antara lain adalah :
a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan
dimanipulasi;
b. DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia;
c. Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di
dalam sel inang secara otonomi;
d. Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam
jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;
e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih
memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu.
Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda
dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini
membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA
kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA+protein+potasium yang
mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid,
RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk
mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari beberapa tahapan berikut :
1) Tahap kultivasi dan harvesting
Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada
saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak.
Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut:
a) Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.
b) 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.
c) Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 l buffer lisis (100mM Tris HCl pH 8,100mM
NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.
d) 10 l ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.
e) Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.
f) Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.
g) Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.
h) Kemudian ditambahkan 700 l phenol, digojog pelan.
i) Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung eppendorf
1,5 ml.
j) Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul
benang-benang halus DNA.
k) Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.

l) Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan.

m) Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.
Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.

Gambar 1. Tahap Kultivasi Dan Harvesting DNA Plasmid

2) Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid
Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran
dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan
peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga
terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel
dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin
tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak
sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel
maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS
yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua
menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan
SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida
(DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat
protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari
larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan
DNA.
Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid:

a) Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung yang telah
berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.
b) Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.
c) Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
d) Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan dalam es
selama 5 menit.
e) Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit.
f) Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan, diinkubasi
dalam es selama 5 menit.
g) Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
h) Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.
i) Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan
Vortek.
j) Disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.

Gambar 2. Tahap Resuspensi Dan Lisis DNA Plasmid

3) Tahap pemurnian DNA plasmid
Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan pembilasan DNA
plasmid. penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube

dari pembersihan dengan C-I pertama. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi
dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut dingin akan
mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. Penambahan
garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+
Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya
elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih
berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O). Atau dapat dikatakan
air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol
adalah untuk menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan
Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)

Tahap ini meliputi proses berikut:

Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1:1
(v/v).
Dicampur dengan vortek.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil.
Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenolkloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.
Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37C
semalam.
Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin.
Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 l, masukkan ke dalam tabung.
Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu - 200C.
jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian DNA.

Gambar 3. Tahap pemurnian DNA Plasmid

2. Urutkan prosedur isolasi DNA darah!
Jawab :
Ada beberapa tahapan untuk melakukan isolasi DNA darah, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan
dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
1) Tahap isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah.
Tahap isolasi jaringan dilakukan untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah yang
masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga
yang tersisa hanya sel darah putih.
2) Tahap lisis
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah
merah. Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah
tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan
yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut
bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel darah putih.
Secara lebih rinci berikut prosedur tahapan ini: ke dalam tabung yang berisi darah diberikan
larutan pelisis sel darah merah yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut
hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA
(ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam,
seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik denan gerakan
memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10
menit. Darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi

selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang.
Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi,
diberikan larutan pelisis sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl
Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Hal
tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel darah putih, dan kemudian dilakukan
ekstraksi di dalam larutan.
3) Tahap purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya. Ke dalam larutan
tadi diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37C. Hal tersebut bertujuan
untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.
4) Tahap presipitasi
Tahap presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak
lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA
menjadi terlihat. Tahap ini dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan
kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein
terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya
senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein
mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan
kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi
isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8. Pemberian
isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama
5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada
dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian
etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur,
tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil
akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan
pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi.
Selanjutnya dapat dilakukan pengukuran konsentrasi dan kemurnian dengan spektrofotometer
atau disimpan pada suhu 40C untuk penundaan identifikasi sementara, pada suhu - 200C
(untuk penyimpanan selama 3 bulan), dan pada suhu 80 0C (untuk penyimpanan lebih lama).
Untuk pengukuran konsentrasi dan kemurnian, DNA harus diencerkan terlebih dahulu. Dengan
pengeceran 1/10 menggunakan larutan DD H2O (Double Destilat H2O/aquabidest).

Gambar. Mekanisme Kerja Isolasi DNA Darah

Referensi Jawaban
Anam, K. 2010. Laporan Praktikum Rekayasa Genetika: Isolasi Dan Pemetaan DNA Plasmid. Bogor: IPB.
http://khairulanam.files.wordpress.com/2010/08/laporan-1-rekgen.pdf (diakses pada 3 Agustus
2011)
Cammpbell, Neil A., Jane B. Reece, dkk. 2010. Biologi Jilid 1, Edisi Kedelapan. Jakarta: Erlangga.
Carladc,

C.
D.
2010. Our
World:
DNA.http://carladc.student.umm.ac.id/download-aspdf/umm_blog_article_57.pdf (Diakses pada 5 Agustus 2011)

Faatih,

M. Jurnal:
isolasi
Dan
Digesti
Kromosom.http://eprints.ums.ac.id/1395/1/7._FATIH.pdf (Diakses pada 7 Agustus 2011)

DNA

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPA Kimia Universitas Padjadjaran.
Ravichandran,
M. Plasmid
Extraction.http://www.ppsk.usm.my/lecturers/mravi/PDF_FIles/Plasmidextraction2002.pdf (Dia
kses pada 3 Agustus 2011)
Qiagen

Plasmid
Purification
Handbook.http://www.mnstate.edu/provost/Qiagen_Plasmid_Prep_Book.pdf (Diakses pada 3
Agustus 2011)